Summary
En metode for å kvantifisere timelige hovedtrekkene i fly circadian locomotor rytmer presenteres. Kvantifiseringen oppnås ved montering fly aktivitet med en multi parametrisk modell bølgeform. Parameterne modell beskriver formen og størrelsen på morgenen og kvelden topper aktivitetsnivået.
Abstract
I de fleste dyr og planter, circadian klokker organisere opptreden og molekylære prosesser og synkronisere dem til daglig lys og mørke syklus. Grunnleggende mekanismer som ligger til grunn for denne timelige kontrollen er mye studert med frukt fly Drosophila melanogaster som en modell organisme. I fluer, er klokken vanligvis studerte ved å analysere multiday locomotor opptak. Slike en innspilling viser et kompleks bimodale mønster med to topper aktivitet: en morgen topp som skjer rundt dawn og en kvelden peak som skjer rundt skumringen. Disse to toppene sammen danner en bølgeform som er veldig forskjellig fra sinusformet svingninger observert i klokken gener, noe som tyder på at mekanismer i tillegg klokken har dyptgripende virkninger i produserende observert mønstre i atferdsdata. Her gir vi instruksjoner om bruk av en nylig utviklet datametode som matematisk beskriver timelige mønstre i fly aktivitet. Metoden passer aktivitetsdata med en modell bølgeform som består av fire eksplosive betingelser og ni uavhengig parametere som fullt beskriver formen og størrelsen på morgenen og kvelden topper aktivitet. Utdraget parameterne kan bidra til å belyse kinetic mekanismer av underlag underlie vanligvis observert bimodale aktivitet mønstre i fly locomotor rytmer.
Introduction
Circadian klokken er en endogen biokjemiske oscillator med en periode på ca. 24 timer og er nesten allestedsnærværende i dyr og planter1,2. Klokken hjelper synkronisere en organismes interne prosesser og virkemåten til eksterne lys mørke syklus. Den genetiske strukturen av circadian klokken har vært mye studert siden 1960 med frukt fly, D. melanogaster. I dette insektet, kjernen i circadian klokken består av fire proteiner: periode, TIMELESS, klokke og syklus. Disse kjernekomponentene sammen med andre molekyler utgjør en feedback loop som produserer nesten sinusformet svingninger for klokke gener3,4. Circadian klokken i fluer er mye studert bruker multiday locomotor opptak hvor fly aktivitet registreres med en enkelt infrarød stråle krysset midten av en individuell tube5. En typisk fly innspillingen har en kompleks bimodale mønster med to frisk distinguishable toppene: morgen peak (M) som starter på slutten av natten og har en maksimal når lysene slår på; og kvelden peak (E) som starter på slutten av dagen og har en maksimal når lysene slår av6. Interessant, er form av slike atferdsmessige innspillingen svært forskjellig fra enkel sinusformet svingninger observert på molekylært nivå, foreslå av flere mekanismer bidrar til observert timelige mønstre. For bedre å forstå disse skjulte mekanismer, har vi utviklet et beregningsorientert verktøy som gir en kvantitativ beskrivelse av timelige mønstre.
I vårt arbeid defineres locomotor rytmer en bølgeform som etterligner fly aktivitet mønster. Siden enkel sinus-bølger ikke kan brukes til modell observert rytmisk endringer i aktivitet, testet vi ulike signal figurer å velge den enkleste som fanger opp alle de viktigste funksjonene i opptakene. Frukt fly circadian virkemåten kontrolleres av aktiviteten til klokken nerveceller som ofte har eksponentiell mønstre for aktivering og deaktivering *7. Eksponentiell dynamikk og visuell analyse av dataene motivert oss å bygge en modell med eksponentiell vilkår som består av fire eksponenter med ni uavhengig parametere og ligner fly aktivitet mønster8. I tillegg til locomotor dataene analysere vi også spekteret sin makt. Typisk fly aktivitet spectrum viser flere topper på harmoniske T0/2, T0/3, etc., i tillegg til den forventede grunnleggende peak på circadian perioden T0. Ifølge Fourier teoremet produserer bare en ren sinuskurve en enkelt topp i kraft spectra, mens mer komplekse bølgediagrammer viser flere spectral topper på harmoniske primære perioden (figur 1). Derfor, gitt ikke-sinusformet timelige mønsteret i fly aktivitet8, et multi peak strøm spekter av data forventes matematisk og innebærer ikke nødvendigvis tilstedeværelsen av flere perioder oscillation. Viktigere, viser makt spekteret av foreslåtte modellen bølgeform også topper på alle harmoniske primære periode, ligner på fly locomotor opptakene, dermed understreker Hi-Fi som beskriver vår modell fly data både i tid og frekvens.
Tid oppløsning noen minutter eller mindre, fly aktivitet vises dataene støyende, gjør det vanskelig å ekstra parametere direkte fra rådataene. Binning data til lengre tidsintervaller kan redusere støynivå, men kan endre dataene på måter som kan påvirke estimering av modellen parametere. Vi har derfor få parameterne fra makt spektra av opptakene, bruker analytisk uttrykk for de forventede makt spectra beregnet fra Fourier-transformere modell funksjon8 (se tilleggsfil 1 referanse8). Denne tilnærmingen å skaffe parametere fra til makt spectra gir nøyaktig parameterverdier uten noen ytterligere endringer, som binning eller filtrering av rå aktivitetsdata. Matematiske detaljer av modellen og vill-type og mutant-programmer er beskrevet i referanse8. Protokollen presenteres her fokuserer på de trinnvise instruksjonene bruke verktøyet beregningsorientert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. måle Fly bevegelse bruke Drosophila aktivitet skjerm (DAM)
Merk: For mer informasjon se referansen 5.
- Forberede personlige fly rør med mat på den ene enden og bomull på den andre. Til slutt med mat skal tettes for å hindre maten tørker ut.
- Innlegge en 50 mL kanne 5-6 g fly mat. Skjær maten i små biter slik at det er lettere å smelte den.
- Koble 32 personlige glass rør med en strikk.
- Smelte maten i begeret av varme den i en mikrobølgeovn på 10-15 s. stopp mikrobølgeovn hver 5 s og nøye riste begeret for å sikre lik smelting av mat.
- Mens maten er fremdeles væske, satte forberedt personlige rørene i begeret med mat. Flytte rør opp og ned slik de er like fylt.
- Tillat maten å kjøle ned og stivne for ca 1 h.
- Når maten er heldekkende, fjerne rør med mat fra begeret.
- Sel slutten som inneholder mat ved hjelp av voks. Først nøye rent en tube med tørkepapir, deretter trykker røret mot voksen. Visuelt sjekke kvaliteten på segl, og om nødvendig gjenta sel igjen.
- Lukker den andre enden av røret med bomull, bomull vil tillate luft å gå mens holde en flue låst i røret.
- Sett et enkelt fly i hver enkelt rør og plassere rør i DAMMEN.
- Sted skjermer i en inkubator som opprettholder konstant temperatur og fuktighet. Basert på eksperimentet, angi riktig lys/mørke betingelsene som følger.
- For lys/mørke eksperimenter holde fluene i lys/mørke syklus for hele eksperimentet. Bruker ikke den første dagen av målinger i analysen.
- For konstant mørke eksperimenter, først holde fluene i to dager i lys/mørke forhold for entrainment og synkronisering av klokkene og deretter bytte til konstant mørke. Ikke bruk målinger fra første dag av konstant mørket i analysen.
- Samle minst fire dager som kan brukes i analyser.
Merk: DAM systemet vil sende en enkelt fil med en bevegelse innspilling av alle fluer i skjermen.
2. Dataanalyse
- delt skjermen utdatafil i flere enkelt fly aktivitet filer, hver fil skal være en enkeltkolonne ' txt ' fil med en personlige fly bevegelse måling.
- Kjøre ' ModelFitPS3.m ' funksjonen i Matlab ledeteksten med følgende inndataparameterne:
- For angitt samplingrate, angi datastikkprøver tidsintervallet i sekunder. For eksempel hvis aktivitet ble målt hvert minutt, angi 60 som den angitt samplingrate.
- Angi tidsintervallet i minutter som dataene vil bli binned for bedre visualisering, anbefalte bin intervallet er 20-30 min. for bin_interval,
- For trend, angi " 1 " Hvis dataene viser planlagte trend og " 0 " ellers; data med trenden vil bli detrended først av montering en andre orden polynom og deretter trekke det fra dataene.
- i popup-vinduet velger du en enkelt fly aktivitet fil.
Merk: Den første tomten er data makt spektrum og ikke velkjente aktivitet tomten. Fra plottet makt spekteret, bestemme primære perioden T 0: klikker med venstre museknapp på circadian toppen eller høyre museknapp på andre harmonisk toppen (rundt T 0 / 2). - På åpen data tomten, sjekk hvis morgen og kveld topper er også visualisere. Hvis ikke, endrer du bin_interval verdien av rett klikker hvor som helst i diagrammet og skrive inn den nye bin_interval-verdien i dialogboksen. Programmet vil tegne data med den nye verdien for intervallet. For å akseptere bin_interval verdien, venstre klikk hvor som helst i diagrammet.
- Programmet vil tegne dataene igjen og viser de første fem dagene av aktivitet. Klikk på første M toppen som skal brukes i analyse (noen ganger er det nødvendig å hoppe over en eller to dager) på denne tomten,.
Merk: Programmet vil tegne grafen fra plukket morgen toppen. De blå og røde linjene viser den en cirkaposisjon E peak og neste dag M topp, henholdsvis basert på perioden i trinn 2.4. - i samme diagram, velge data for foreløpige passform data med modellen: Klikk på følgende punkter (i denne bestille, Merk at Klikk plasseringen angis med en rød stjerne nederst): (i) øverst på M topp; (ii) slutten av M toppen; (iii) starter E toppen; (iv) toppen av E fjellet; (v) etter E toppen; (vi) toppen av M toppen av dagen.
- Oppmerksom på at programmet nå presenterer makt spekteret.
Merk: X-aksen er nå gitt i frekvens.- i vinduet åpnet med makt spekteret plukke som skal brukes for montering analytisk uttrykket for modell makt spekteret. Perioden i trinn 2.4 er merket med en rød linje. For å velge passende poeng, først omtrent bestemme primære perioden, ligner på trinn 2.4. Deretter bruke glidebryteren, finjustere primære perioden verdi, slik at montering poeng (vist med røde sirkler, vises etter glidebryteren) er lukket til toppen verdier.
- Etter at visuell peak, klikk " godta " og programmet passer valgte punktene med analytiske uttrykk til å beregne parameterne modell.
- Merk at parameterne og spectral passer feil lagres filen " model_fit_parameters.txtŔ programmet lagres i tillegg 2 tall med anfall av locomotor dataene og dens makt spectrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden som presenteres her kan kvantifisering av hovedtrekkene flyr bevegelse mønster. Kvantifiseringen oppnås ved å tilpasse aktivitetsdata med en modell som består av fire eksplosive begreper:
Modellen har ni uavhengig parametere som beskriver aktivitet mønster. Parametere bMD,bMR,bED,og bER definere prisene for morgen forfall (MD), morgen stige (MR), kvelden forfall (ED), og kvelden økning (ER), henholdsvis. Parameteren T0 definerer circadian periode, TM og TE definerer bredden på M og E topper og HM og HE definere høyder av M og E topper.
Verdier av parametre hentes fra ufiltrert dataene i noen få trinn (figur 2). Først bestemmes en circadian periode fra aktivitet makt spekteret (protokollen trinn 2.4). Deretter er foreløpige verdiene Hentet fra den bevegelse opptak av passer det med f (t) (Protocol trinn 2.5-2.6). Disse verdiene brukes som første anslag for passende data makt spekteret med et analytisk uttrykk avledet i8 (ekstra fil 1 i referanse8) ved å ta Fourier-transformere f (t):
der Tn = T0/n, med n = 1,2,3... og T0 er circadian perioden (protokollen trinn 2.7-2.8). Ved spectral passer er modell parameterne Hentet fra fly bevegelse uten filtrering eller binning. Montering av makt spekteret produserer siste verdier for modell, som deretter brukes til å konstruere den endelige formen f (t), dvs, modell av fly locomotor rytmer.
I modellen, b parametere kan være enten negative eller positive, som gjenspeiler kurvatur av tilsvarende eksponentiell. Parametrene bMD og bER er positive når eksponentene konvekse og negative når eksponentene er konkav, mens parametrene bMR og bED er positive når eksponentene konkave og negative når den eksponenter er konvekse. Generelt for eksponenter beskriver M toppen, økningen i b-parametere Angir tregere stige eller forfall, og for eksponenter beskriver E toppen, økningen i b-parametere Angir raskere stige eller forfall.
Figur 3 viser eksempler på passer ved denne algoritmen. Spectral topper på T0 og harmoniske T0/2 T0/10 utstyrt (figur 3A). Andre harmoniske vanligvis har høyder lavere enn signifikansnivå på 0,05 og derfor brukes ikke i analysen. Parameterne fra spectral passer brukes til å lage en modell for fly bevegelse (figur 3B, rød). Metoden fungerer både for vill type fluer (Figur 3toppen panelene) og circadian mutanter med endrede perioden lengder (Figur 3, midten og bunnen panel). Flere eksempler og tilkoblinger mellom modellen og underliggende biologi, se Lazopulo et al. 8 resultater fra passende prosedyren er lagret i en fil i følgende rekkefølge: bMD,bMR,bER,bED, T0, TM/T0, TE /T0HM, HE (tabell 1). Programmet lagrer også utdatafilen passende feil spectral passer, 'Feil', som beregnes som en sum av rester (gjenværende summen) normalisert torget maksimal data makt spekteret.
Figur 1 . Strøm spektra av andre bølgeformer. Ifølge Fourier teoremet viser bare en sinusbølge en enkelt topp i en makt-spektrum, mens mer komplekse bølgeformer, for eksempel firkantet eller Sagtann bølge, viser flere topper på harmoniske primære perioden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Skjematisk fremstilling av parameteren-utpakking algoritmen. Siste parameterverdier hentes fra montering makt spekteret. Siden passende prosedyren kan være følsomme for starter verdier, algoritmen bruker foreløpig beregnet fra bevegelse data og oppdaterer dem makt spekteret. Siste parameterverdiene brukes til å konstruere f (t) som best beskriver dataene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Representant resultatene av metoden som quantifies fly bevegelse ved hjelp av en modell bølgeform. (A) parametere av modellen er Hentet fra passer de ti første toppene av makt spekteret. (B) innhentes parametrene brukes til å lage en modell av aktivitet. Metoden kan brukes til vill type fluer (topp panel) eller mutanter med kort (midten panel) og lange (bunnen panel) døgnrytme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| fly genotype | bMD (1/min) | bMR (1/min) | bED (1/min) | bER (1/min) | T0 (min) | TM/t0 | TEt0 | HM | HE |
| Wild type | 0.0094 | 0.2077 | -0.0383 | 0.0606 | 1438 | 0.1528 | 0.0833 | 5.2238 | 8.7185 |
| kort circadian mutant | 0.015 |
Tabell 1. Eksempel på parametere Hentet fra passer til makt spectra vises i Figur 3. Programmet utganger siste parameterverdiene til "model_parameters.txt" fil som vist i tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet gir instruksjoner for bruk av et beregningsorientert verktøy som gir en kvantitativ beskrivelse av fly bevegelse mønster. Verktøyet passer bevegelse data med en matematisk modell som består av fire eksplosive begreper som sammen beskriver formen og størrelsen på M og E toppene. De siste verdiene for parameterne modell hentes fra montering makt spektra av dataene, der bruk av rådata kan unngå artefactual effekter som data binning eller filtrering kan pålegge parameterverdier. Parameterne modell kan deretter brukes til videre studier fly bevegelse og mekanismer som gir opphav til aktivitet toppene.
Kvaliteten på montering kan vurderes på to måter: ved visuell observasjon av makt spekteret passer og bruke passende feilen (gjenværende summen) som er beregnet med parameterne. En av de viktigste faktorene som påvirker passe kvaliteten er fastsettelse av circadian perioden T0 (protokollen trinn 2.8). Denne verdien T0 berører estimering av toppene i parameterne makt spektrum og modell. Et annet viktig skritt som påvirker passe kvaliteten er valg av startpunktet for en foreløpig tilpasning av data (protokollen trinn 2.7), siden TM TE verdier defineres gjennom dette valget. Brukeren kan utforske flere passer resultater ved å velge forskjellige dager aktivitet for TM og TE.
Vår modell er fokusert på å etterligne det godt beskrevet klokke kontrollert locomotor opptreden med to fremtredende toppene aktivitet. Dette problemet er observert både i lys/mørke og konstant mørke forhold, som gjør tilnærming gjelder for disse to typer eksperimenter. Men tar modellen ikke hensyn til lyset drevet utbrudd av aktivitet observert i noen lys/mørke eksperimenter. En annen begrensning oppstår utvinning av modellen parametere som krever inndata fra bruker (protokollen trinn 2.7-2.9). Siden parameterne TMog TET0 hentes fra brukerinndata, bør hver fly aktivitet analyseres manuelt. I tillegg er det anbefalt å bruke metoden med individuelle aktiviteter ikke med en befolkning-gjennomsnitt opptak, siden snitt fremgangsmåten skjuler mange viktige individuelle forskjeller i fly bevegelse. Selv om det kan virke tungvinte for mange fluer, ved å analysere fly aktiviteter individuelt, får brukeren verdifulle statistisk informasjon om graden av parameteren variasjon innen en gruppe dyr. For å overse disse fordelene, er det mulig å generere en befolkning-gjennomsnitt fly bevegelse og analysere den for å få gjennomsnittlig parameterverdier.
Modellen som brukes i dette arbeidet er en forbedret versjon av bølgeform våre tidligere forskning8. I motsetning til den forrige modellen har den egne parametere for M og E peak høyder, HM og HE, henholdsvis. Den nye modellen viser forutsigbart bedre avtale med fly aktivitetsdata, siden morgen og kveld topper har ulike høyder.
Denne analysen er ikke begrenset å fly bevegelse målt med infrarøde strålen teknikk. Andre metoder, som video-sporing, produsere lignende mønstre fly aktivitetsnivået M og E topper viser eksponentiell dynamikken i vekst og nedbrytning9. Verktøyet diskuteres her kan lett brukes på disse alternative datasett også.
Metoden diskutert her kvantifiserer fly locomotor innspillinger med mål om å koble atferdsmessige utgang til underliggende mekanismene som regulerer fly daglige atferd og kontrollere bimodale aktivitet mønsteret. Flere nyere studier å identifisere neurons og underlag figuren M og E aktivitet topper10,11. Etterforskerne manipulert aktiviteten til visse neuronal grupper og analysert sin rolle i dannelsen av kvelden peak ved å observere endringer i høyde og fase av E toppen. I vår modell, parametere HE bestemmer høyden på E toppen, TE gir topp bredden, og parametere bER og bED beskriver topp form. Som beskrevet i referanse8, i biokjemiske sammenheng kan HE indikere mål på nivåene av neuropeptides NPF og ITP, mens bER og bED kan representere satsene for deres utgivelse og fornedrelse. Sammen disse parametrene kan brukes i fremtidige studier for å bedre koble fly atferd med neuromodulatory signalnettverk, mot en integrert beskrivelse av bimodale mønstre i fly locomotor rytmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Stanislav Lazopulo hjelp med videoinnholdet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2, DAM5 | Measures fly locootion using single infrared beam |
| MatLab | Mathworks | Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes | |
| Drosophila melanogaster | per[S], per[L], iso31(wild type) | Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period |
References
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: general perspective. Biological Rhythms. II, 57-80 (1981).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (11), 764-776 (2010).
- Tataroglu, O., Emery, P. The molecular ticks of the Drosophila circadian clock. Curr Opin Insect Sci. 7, 51-57 (2015).
- Plautz, J. D., et al. Quantitative analysis of Drosophila period gene transcription in living animals. J Biol Rhythms. 12 (3), 204-217 (1997).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J Vis Exp. (43), e2157 (2010).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster--sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms. 15 (2), 135-154 (2000).
- Dautzenberg, F. M., Neysari, S. Irreversible binding kinetics of neuropeptide Y ligands to Y2 but not to Y1 and Y5 receptors. Pharmacology. 75 (1), 21-29 (2005).
- Lazopulo, A., Syed, S. A mathematical model provides mechanistic links to temporal patterns in Drosophila daily activity. BMC Neuroscience. 17 (1), 14 (2016).
- Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PloS ONE. 7 (5), e37250 (2012).
- Schlichting, M., et al. A Neural Network Underlying Circadian Entrainment and Photoperiodic Adjustment of Sleep and Activity in Drosophila. J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).
- Guo, F., et al. Circadian neuron feedback controls the Drosophila sleep-activity profile. Nature. 536 (7616), 292-297 (2016).
