Summary
En metod för att kvantifiera temporal huvuddragen hos flyga dygnsrytm rörelseapparaten rytmer presenteras. Kvantifieringen uppnås genom att montera flyga aktivitet med en multi parametrisk modell vågform. Modellparametrar beskriva formen och storleken på morgonen och kvällen toppar av daglig aktivitet.
Abstract
I de flesta djur och växter, dygnsrytm klockor orkestrera beteendemässiga och molekylära processer och synkronisera dem till den dagliga ljus-mörk-cykeln. Grundläggande mekanismer som ligger bakom denna tidsmässiga kontroll studeras allmänt använda bananflugan Drosophila melanogaster som modellorganism. I flugor studeras normalt klockan genom att analysera Flerdagsaktivitet rörelseapparaten inspelning. Sådan en inspelning visar ett komplext bimodal mönster med två toppar av aktivitet: en morgon topp som händer runt omkring dawn och en kväll-topp som händer runt omkring skymning. Dessa två toppar tillsammans bildar en vågform som skiljer sig mycket från sinusformiga svängningarna observerats i klocka gener, vilket tyder på att mekanismerna förutom klockan har djupgående effekter på att producera observerade mönstren i beteendemässiga data. Här ge vi instruktioner om att en nyligen utvecklad computational metod som matematiskt beskriver tidsmässiga mönster i flyga aktivitet. Metoden passar aktivitetsdata med en modell vågform som består av fyra exponentiell villkor och nio oberoende parametrar som fullständigt beskriver formen och storleken på morgonen och kvällen topparna av aktivitet. De extraherade parametrarna kan hjälpa till att belysa de kinetiska mekanismerna av substrat som ligger bakom de vanligaste observerade bimodal aktivitetsmönster i flyga rörelseapparaten rytmer.
Introduction
Dygnsrytm klockan är en endogen biokemiska frekvensgenerator med en period av cirka 24 timmar och är nästan allestädes närvarande i djur och växter1,2. Klockan hjälper synkronisera en organisms interna processer och beteende till den yttre ljus mörka cykeln. Den genetiska strukturen hos dygnsrytm klockan allmänt har undersökts sedan 1960-talet med bananflugan, D. melanogaster. I denna insekt, kärnan i dygnsrytm klockan består av fyra proteiner: PERIOD, TIMELESS, klocka och cykel. Dessa huvudkomponenter tillsammans med andra molekyler bildar en feedbackloop som producerar nästan sinusformiga svängningarna av klocka gener3,4. Dygnsrytm klockan i flugor studeras allmänt med Flerdagsaktivitet rörelseapparaten inspelningar där flyga aktivitet detekteras med en enda IR-strålen passerar mitten av en enskild tube5. En typisk fly inspelning har ett komplext bimodal mönster med två väl urskiljbara toppar: morgon peak (M) som börjar i slutet av natten och har en maximal när lampor slår på; och kvällen peak (E) som börjar i slutet av dagen och har en maximal när lamporna stänger av6. Intressant, är formen på sådana beteendemässiga inspelning mycket olika från enkla sinusformiga svängningarna observerats på molekylär nivå, föreslår åtgärder ytterligare mekanismer bidrar till de observerade tidsmässiga mönsterna. För att bättre förstå dessa dolda mekanismer, har vi utvecklat en computational verktyg som ger en kvantitativ beskrivning av de tidsmässiga mönsterna.
I vårt arbete definieras rörelseapparaten rytmer en vågform som härmar flyga aktivitet mönster. Eftersom enkla sinusvågor inte kan användas för att modellera de observerade rytmiska förändringarna i aktivitet, testade vi olika signal former att välja den enklaste som fångar alla de framträdande dragen i inspelningarna. Bananflugan dygnsrytm beteende styrs av aktiviteten av klocka nervceller som ofta har exponentiell mönster av aktivering och avaktivering7. Den exponentiella dynamiken och visuell analys av data motiverade oss att bygga en modell med exponentiell villkor som består av fyra exponenter med nio oberoende parametrar och liknar den flyga aktivitet mönster8. Förutom rörelseapparaten data analyserar vi också dess kraftspektrum. Typiska flyga aktivitet spektrum visar multipla toppar på övertoner T0/2, T0/3, etc., förutom förväntade grundläggande toppen vid dygnsrytm perioden T0. Enligt Fourier sats producerar endast en ren sinusvåg en enda topp i power spectra, medan mer komplexa vågformer visar multipla spektrala toppar på övertoner av primära perioden (figur 1). Därför ges icke-sinusformade temporal mönstret i flyga aktivitet8, en multi peak power spectrum av data beräknas matematiskt och innebär inte nödvändigtvis förekomsten av flera perioder av svängningen. Ännu viktigare, visar power spectrumen av föreslagna modellen vågformen också topparna på alla övertoner av den primära perioden, liknande de flyga rörelseapparaten inspelningar, således betonar hög trohet som beskriver vår modell flyga data både i tid och frekvens.
Tiden upplösningar på några minuter eller mindre, flyga aktivitet visas data bullriga, vilket gör det svårt att extrahera parametrar direkt från rådata. Binning data till längre tidsintervall kan minska ljudnivån, men kan ändra data på ett sätt som kan påverka uppskattningen av modellparametrar. Vi få därför parametrarna från power spektra av inspelningarna, använder ett analytiskt uttryck för förväntade effekt spektra beräknas från fouriertransformen av modell funktion8 (se ytterligare fil 1 av referens8). Detta tillvägagångssätt för att få parametrar från power spektra ger exakta parametervärden utan någon ytterligare manipulationer, såsom binning eller filtrering, den råa aktivitetsdata. Matematiska uppgifter om modell och applikationer till vildtyp och muterade data beskrivs i referens8. Protokollet presenteras här fokuserar på de stegvisa anvisningarna för att använda verktyget computational.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mäta flyga Locomotion använda Drosophila aktivitet Monitor (DAM)
Obs: för mer information se referens 5.
- Förbereda enskilda flyga rör med mat i ena änden och bomull på andra. Avsluta med mat ska förseglas för att förhindra maten från att torka ut.
- Sätta 5-6 g flyga mat i en 50 mL bägare. Skär maten i små bitar så att det är lättare att smälta det.
- Ansluta 32 enskilda glasrör med en gummisnodd.
- Smälta maten i bägaren genom att värma den i mikrovågsugnen för 10-15 s. stopp mikrovågsugn varje 5 s och försiktigt skaka bägaren för att säkerställa lika smältande mat.
- Medan maten är fortfarande flytande, sätta beredda enskilda rören i bägaren med mat. Flytta rören upp och ner så de fylls lika.
- Tillåt den mat att svalna och stelna för ca 1 h.
- Efter maten är solid, ta bort rören med maten från bägaren.
- Tätning i slutet som innehåller maten med hjälp av vax. Först noga ren en tub med pappershandduk, tryck röret mot vaxet. Visuellt kontrollera kvaliteten på tätningen, och om nödvändigt, upprepa försegla igen.
- Stänger i andra änden av röret med bomull, bomull tillåter luft att gå igenom medan hålla en fluga låst i röret.
- Placera en enda fluga i varje enskilda rör och placera rören i DAMMEN.
- Plats övervakar i en inkubator som upprätthåller konstant temperatur och fuktighet. Baserat på experimentet, ange korrekt ljus/mörk villkor enligt följande.
- För ljus och mörker experiment hålla flugorna i ljus och mörker cykel för hela experimentet. Använd inte den första dagen av mätningar i analys.
- För konstant mörker experiment, först hålla flugorna för två dagar i ljus och mörker villkor för övningsprovet och synkronisering av klockor och sedan växla till konstant mörker. Använd inte måtten från den första dagen i konstant mörker i analys.
- Samla in data som kan användas i analysen minst fyra dagar.
Obs: DAM systemet kommer ut en enda fil med en locomotion inspelning av alla flugor i monitor.
2. Dataanalys
- dela bildskärmen utdatafil i flera enstaka flyga aktivitetsfiler; varje fil ska vara en enda kolumn ' .txt ' fil med en mätning av individuella flyga locomotion.
- Kör ' ModelFitPS3.m ' funktion i ett Matlab-kommandofönster med följande indataparametrar:
- för samplingrate, ange datasampling tidsintervallet i sekunder. Om aktiviteten mättes varje minut, t.ex 60 som den samplingrate.
- För bin_interval, ange tidsintervall i minuter som data kommer att kastas för bättre visualisering; rekommenderade bin intervallet är 20-30 min.
- För trend, ange " 1 " om data visar baslinjen trend och " 0 " annars; data med trenden kommer vara detrended först genom montering av en andra ordningens polynom och sedan subtrahera det från data.
- i popup-fönstret väljer du en enskild aktivitet som kan flyga fil.
Obs: Den första tomten är data kraftspektrum och inte bekant aktivitet tomten. Från den plottade kraftspektrum, fastställa den primära period T 0: antingen klicka med vänster musknapp på dygnsrytm topp eller med höger musknapp på den andra harmoniska toppen (runt T 0 / 2). - På öppnade data tomten, kontrollera om på morgonen och kvällen toppar visualiseras väl. Om inte, ändra värdet bin_interval genom att högerklicka någonstans i diagrammet och mata in det nya bin_interval värdet i dialogrutan. Programmet kommer att rita data med det nya värdet för intervallet. För att acceptera värdet bin_interval, vänster klicka någonstans i diagrammet.
- Programmet kommer att rita om data igen och Visa de första fem dagarna av aktivitet. På denna tomt, klicka på den första M-toppen som kommer att användas i analysen (ibland är det nödvändigt att hoppa över en eller två dagar).
Obs: Programmet kommer att rita diagrammet start från plockade morgon toppen. De blå och röda linjerna visar den ungefärliga platsen för det E toppen och nästa dag M peak, respektive, baserat på perioden som bestäms i steg 2.4. - På samma diagram, väljer data för en preliminär passform av data med modellen: Klicka på följande punkter (i detta beställa; Observera att klicka platsen kommer att anges med en röd stjärna på botten): (i) toppen av M topp; II slutet av M peak; (iii) start av E toppen; (iv) överkant E toppen; (v) slutet av E toppen; (vi) överkant M toppen av nästa dag.
- Observera att programmet nu presenterar kraftspektrum.
Obs: X-axeln ges nu i frekvens.- i det öppna fönstret med kraftspektrum, plocka poäng som kommer att användas för att montera det analytiska uttrycket för modell power spectrum. Den period som identifieras i steg 2,4 markeras med en röd linje. Välj passande punkter genom först ungefär bestämma den primära perioden, liknande steg 2,4. Sedan använda skjutreglaget, finjustera perioden primära värde så att tillbehöret pekar (visas med röda cirklar, visas efter reglaget) är stängda för toppvärden.
- Efter visuell peak markeringen, klicka på " acceptera " och programmet kommer att passa utvalda punkter med det analytiska uttrycket för att beräkna modellparametrar.
- Observera att parametrar och spektrala fit fel sparas i filen " model_fit_parameters.txtŔ programmet kommer dessutom spara 2 siffror med passar rörelseapparaten och dess kraftspektrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden presenteras här tillåter kvantifiering av huvuddragen i flyga locomotion mönster. Kvantifieringen uppnås genom att montera aktivitetsdata med en modell som består av fyra exponentiell termer:
Modellen har nio oberoende parametrar som beskriver aktiviteten mönster. De parametrar bMDbherr,bED,och bER definiera av morgon decay (MD), morgon upphov (MR), kväll decay (ED) och kvällen rise (ER), respektive. Parametern T0 definierar dygnsrytm period, TM och TE definiera bredder av M och E toppar och HM och HE definiera höjder av M och E toppar.
Värdena för parametrarna som erhålls från ofiltrerade data i ett stenkast (figur 2). Först bestäms en dygnsrytm period från den aktivitet kraftspektrum (protokoll steg 2,4). Sedan, preliminära parametrar värden extraheras från den locomotion inspelning genom att montera den med F(t) (protokollstegen 2,5-2,6). Dessa värden fungera som första gissning för montering data makt spektrum med analytiska uttryck härrör i8 (ytterligare fil 1 i referens8) genom att ta fouriertransformen av F(t):
där Tn = T0/n, med n = 1,2,3... och T0 är perioden dygnsrytm (protokoll steg 2,7-2,8). Genom att använda den spektrala passformen, extraheras modellparametrar från flyga locomotion utan filtrering eller binning. Montering av kraftspektrum producerar slutliga värden för parametrarna modell, som sedan används för att konstruera den slutliga utformningen av F(t), dvs, modellen av flyga rörelseapparaten rytmer.
I modellen, kan b parametrar vara antingen negativ eller positiv, som återspeglar krökning av motsvarande exponentiell termer. Parametrarna bMD och bER är positiva när exponenterna är konvex och negativa när exponenterna är konkav, medan parametrarna bherr och bED är positiva när exponenterna är konkav och negativa när de exponenter är konvex. Generellt för de exponenter som beskriver M peak, ökningen av parametrarna b anger långsammare uppgång eller förfall och för de exponenter som beskriver E toppen, ökningen i b parametrar anger snabbare upphov eller förfall.
Figur 3 visar exempel på passar som erhållits genom denna algoritm. Spektrala toppar på T0 och övertoner från T0/2 T0/10 monteras (figur 3A). Andra övertoner normalt har höjder mindre än signifikansnivå på 0,05 och används därför inte i analysen. Parametrar som erhålls från den spektrala fit används att konstruera en modell för flyga locomotion (figur 3B, röd). Metoden fungerar både för vildtyp flugor (figur 3, övre paneler) och dygnsrytm mutanter med förändrad perioden längder (figur 3, mitten och botten panel). För ytterligare exempel och anslutningar mellan modell och underliggande biologi, se Lazopulo et al. 8 resultat från förfarandet montering sparas till en fil i följande ordning: bMD,bherr,bER,bED, T0, TM/t0, TE T0, HM, HE (tabell 1). Programmet sparar också till utmatningsfilen montering felet av den spektrala passformen, 'Err', som beräknas som summan av kvadraterna för de restsubstanser (restsumman av kvadrater) normaliserad av kvadraten på maximalt data makt spektrum.
Figur 1 . Driva spektra av olika vågformer. Enligt Fourier sats visar endast en sinussignal en enkel topp i ett makt spektrum, medan mer komplexa vågformer, såsom kvadratiska eller sawtooth våg, visar ytterligare toppar på övertoner av primära perioden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Schematisk framställning av parameter-extrahera algoritmen. Sista parametervärden erhålls från passande power spektrumet. Eftersom förfarandet för montering kan vara känsliga för start värden, algoritmen använder preliminära värden beräknade från locomotion data och uppdaterar dem med makt spektrumet. De slutliga parametervärdena används för att konstruera F(t) som bäst beskriver data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Representativa resultat av metoden som kvantifierar flyga förflyttning med hjälp av en modell vågform. (A) parametrar av modellen extraheras från passande de första tio topparna av makt spektrum. (B) fås parametrar används för att konstruera en modell av aktivitet. Metoden kan tillämpas på vildtyp flugor (översta paneler) eller mutanter med kort (mellersta paneler) och långa (bottenpaneler) dygnsrytm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| flyga genotyp | bMD (1/min) | bherr (1/min) | bED (1/min) | bER (1/min) | T0 (min) | TM/t0 | TEt0 | HM | HE |
| vildtyp | 0.0094 | 0.2077 | -0.0383 | 0.0606 | 1438 | 0.1528 | 0.0833 | 5.2238 | 8.7185 |
| kort dygnsrytm mutant | 0,015 |
Tabell 1. Exempel på parametrar som utvinns ur passande power spektra visas i figur 3. Programmet matar ut de slutliga parametervärdena till ”model_parameters.txt”-fil som visas i tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete presenterar instruktioner för att använda en computational verktyg som ger en kvantitativ beskrivning av flyga locomotion mönster. Verktyget passar locomotion data med en matematisk modell som består av fyra exponentiell termer som tillsammans beskriver formen och storleken av M och E topparna. De slutliga värdena för parametrarna modellen fås passande power spektra av data, där användningen av rådata kan undvika tingsliga effekter som data binning eller filtrering kan ålägga parametervärden. Modellparametrar kan sedan användas för att ytterligare studie flyga locomotion och de mekanismer som ger upphov till aktivitet topparna.
Kvaliteten på tillbehöret kan utvärderas på två sätt: genom visuell observation av makt spektrum passar och med hjälp av tillbehöret felet (restsumman av kvadrater) som beräknas tillsammans med parametrarna. En av de viktigaste faktorerna som påverkar fit kvalitet är bestämning av dygnsrytm perioden T0 (protokoll steg 2,8). Värdet för T0 påverkar uppskattning av topparna i parametrarna makt spektrum och modell. Ett annat viktigt steg som påverkar fit kvalitet är urvalet av utgångspunkten för en preliminär passform av data (protokoll steg 2,7), sedan TM och TE värden definieras genom detta urval. Användaren kan utforska flera fit resultat genom att välja olika dagar av aktivitet för att definiera TM och TE.
Vår modell är inriktad på imitera beteendet väl beskrivna klockan kontrolleras rörelseapparaten med två framstående toppar av aktivitet. Detta beteende observeras både i ljus och mörker och i konstant mörker villkor, vilket gör metoden tillämpas på dessa två typer av experiment. Men tar modellen inte hänsyn till ljuset driven sprack av aktivitet observerades i några ljus och mörker-experiment. En annan begränsning uppkommer från utvinning av modellparametrar som kräver användarens inmatning (protokoll steg 2,7-2,9). Eftersom parametrarna TM, TEoch T0 hämtas från användarinmatning, bör varje fluga aktivitet analyseras manuellt. Dessutom rekommenderas att använda metoden med enskilda aktiviteter snarare än med en befolkning-genomsnitt inspelning, eftersom förfarandet för genomsnitt döljer många viktiga individuella skillnader i flyga locomotion. Även om det kan tyckas besvärligt för stort antal flugor, genom att analysera flyga aktiviteter individuellt, erhåller användaren värdefull statistisk information om graden av parametern variationen inom en grupp av djur. För att förbise dessa fördelar, är det möjligt att generera en befolkning-genomsnitt flyga locomotion och analysera den för att få genomsnittliga parametervärden.
Den modell som används i detta arbete är en förbättrad version av vågformen från vår tidigare forskning8. Till skillnad från föregående modell har den separata parametrar för M och E peak höjder, HM och HE, respektive. Den nya modellen visar förutsägbart bättre avtal med flyga aktivitetsdata, sedan på morgonen och kvällen toppar har vanligtvis olika höjder.
Denna analys är inte begränsat till flyga locomotion mätt med IR-strålen teknik. Andra metoder, såsom video-tracking, producera liknande mönster av flyga daglig aktivitet med M och E toppar visar exponentiella dynamiken i uppgång och decay9. Verktyget som diskuteras här kan lätt tillämpas på dessa alternativa uppsättningar data också.
Den metod som diskuteras här kvantifierar flyga rörelseapparaten inspelningar med målet att ansluta beteendemässiga utdata till underliggande mekanismer som reglerar flyga dagliga beteende och kontrollera mönstret bimodal aktivitet. Flera färska studier syftar till att identifiera nervceller och substrat som formar M och E aktivitet toppar10,11. Utredarna manipulerade aktiviteten av vissa neuronala grupper och analyserade deras roll i bildandet av den kväll toppen genom att observera förändringar i höjd och fas av E toppen. I vår modell, parametrar HE bestämmer höjden av E toppen, TE ger toppens bredd och parametrar bER och bED beskriva peak formen. Som beskrivs i referens8, i biokemiska sammanhang tyda HE åtgärden av neuropeptider NPF och ITP, medan bER och bED kan representera sin release och nedbrytning. Tillsammans, dessa parametrar kan utnyttjas i framtiden studier för att bättre ansluta flyga beteende med neuromodulatory signalering, mot en integrerad Beskrivning av bimodal mönstren i flyga rörelseapparaten rytmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Stanislav Lazopulo för hjälp med videoinnehåll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2, DAM5 | Measures fly locootion using single infrared beam |
| MatLab | Mathworks | Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes | |
| Drosophila melanogaster | per[S], per[L], iso31(wild type) | Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period |
References
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: general perspective. Biological Rhythms. II, 57-80 (1981).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (11), 764-776 (2010).
- Tataroglu, O., Emery, P. The molecular ticks of the Drosophila circadian clock. Curr Opin Insect Sci. 7, 51-57 (2015).
- Plautz, J. D., et al. Quantitative analysis of Drosophila period gene transcription in living animals. J Biol Rhythms. 12 (3), 204-217 (1997).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J Vis Exp. (43), e2157 (2010).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster--sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms. 15 (2), 135-154 (2000).
- Dautzenberg, F. M., Neysari, S. Irreversible binding kinetics of neuropeptide Y ligands to Y2 but not to Y1 and Y5 receptors. Pharmacology. 75 (1), 21-29 (2005).
- Lazopulo, A., Syed, S. A mathematical model provides mechanistic links to temporal patterns in Drosophila daily activity. BMC Neuroscience. 17 (1), 14 (2016).
- Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PloS ONE. 7 (5), e37250 (2012).
- Schlichting, M., et al. A Neural Network Underlying Circadian Entrainment and Photoperiodic Adjustment of Sleep and Activity in Drosophila. J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).
- Guo, F., et al. Circadian neuron feedback controls the Drosophila sleep-activity profile. Nature. 536 (7616), 292-297 (2016).
