Summary
En metode til at kvantificere tidsmæssige hovedtræk set i flyve døgnrytmen bevægeapparatet rytmer er præsenteret. Kvantificering opnås ved montering flyve aktivitet med en multi parametrisk model bølgeform. Model parametre beskriver form og størrelse af morgen og aften toppene af daglig aktivitet.
Abstract
I de fleste dyr og planter, døgnrytmen ure orkestrere adfærdsmæssige og molekylære processer og synkronisere dem til den daglige lys-mørke cyklus. Grundlæggende mekanismer, der ligger bag denne timelige kontrol studeres bredt ved hjælp af bananfluen Drosophila melanogaster som en model organisme. I fluer, er uret typisk studerede ved at analysere multiday bevægeapparatet optagelse. Sådan en optagelse viser en kompleks bimodal mønster med to toppe af aktivitet: en morgen peak, der sker omkring daggry, og en aften peak, der sker omkring solnedgang. Disse to toppe tilsammen danner en bølgeform, der adskiller sig meget fra sinusformet svingninger observeret i ur gener, tyder på, at mekanismer ud over uret have dybtgående virkninger i producerer de observerede mønstre i adfærdsmæssige data. Her giver vi instruktioner om brug af en nyligt udviklede beregningsudstyr, som matematisk beskriver tidsmæssige mønstre i flyve aktivitet. Metoden passer aktivitetsdata med en model bølgeform, der består af fire eksponentiel vilkår og ni uafhængige parametre, der fuldt ud beskriver form og størrelse af morgen og aften toppene af aktivitet. De udpakkede parametre kan hjælpe med at belyse de kinetiske mekanismer af substrater, der ligger til grund for almindeligt observerede bimodal aktivitet mønstre i flyve bevægeapparatet rytmer.
Introduction
Døgnrytmen uret er en endogen biokemiske oscillator med en periode på ca. 24 timer og er næsten allestedsnærværende i dyr og planter,1,2. Uret hjælper synkronisere en organismes interne processer og adfærd til den eksterne lys mørke cyklus. Den genetiske struktur af døgnrytmen uret er blevet meget studeret siden i 1960 ' erne ved hjælp af frugtflue, D. melanogaster. I dette insekt, kernen i døgnrytmen uret består af fire proteiner: periode, TIMELESS, ur og cyklus. Disse kernekomponenter sammen med andre molekyler danner en feedback-sløjfe, der producerer næsten sinusformet svingninger af ur gener3,4. Døgnrytmen uret i fluer er almindeligt studerede ved hjælp af multiday bevægeapparatet optagelser hvor flyve aktivitet registreres med en enkelt infrarød stråle passerer i midten af en individuel tube5. En typisk flyve optagelse har en kompleks bimodal mønster med to godt skelnes toppe: morgen peak (M), der starter i slutningen af natten og har en maksimal når lysene tænder; og aftenen peak (E), der starter i slutningen af dagen og har en maksimal når lyset slukke6. Interessant, er formen af sådanne adfærdsmæssige optagelse meget forskellig fra de simple sinusformet svingninger observeret på det molekylære niveau, tyder på handlingen af yderligere mekanismer bidrager til de observerede tidsmæssige mønstre. For bedre at forstå disse skjulte mekanismer, har vi udviklet en beregningsmæssige værktøj, der giver en kvantitativ beskrivelse af de tidsmæssige mønstre.
I vores arbejde, er bevægeapparatet rytmer defineret i en bølgeform, der efterligner flyve aktivitet mønster. Da enkel sinus bølger ikke kan bruges til at modellere de observerede rytmiske ændringer i aktivitet, testede vi forskellige signal figurer at vælge den enkleste, indfanger alle de vigtigste træk set i optagelserne. Bananfluen døgnrytmen adfærd styres af aktiviteten af ur neuroner, der ofte har eksponentiel mønstre for aktivering og deaktivering af7. Eksponentielle dynamik og visuel analyse af dataene, der motiverede os til at bygge en model med eksponentiel vilkår består af fire eksponenter med ni uafhængige parametre og der ligner flyve aktivitet mønster8. Ud over de bevægeapparatet data analyserer vi også sin magt spektrum. Typisk flyve aktivitet spektrum viser flere toppe på harmoniske T0/2, T0/3, osv., ud over den forventede grundlæggende peak på døgnrytmen perioden T0. Ifølge Fourier sætningen producerer kun en ren sinusbølge en enkelt peak i power spektre, mens mere komplekse bølgeformer vis flere spektrale toppe på harmoniske af den primære periode (figur 1). Derfor, da den ikke-sinusformede tidsmæssige mønster i flyve aktivitet8, en multi peak magt spektrum af data forventes matematisk og betyder ikke nødvendigvis, at tilstedeværelsen af flere perioder af svingning. Vigtigere, viser power spektrum af den foreslåede model bølgeform også toppe på alle overtoner af den primære periode, svarende til de flyve bevægeapparatet optagelser, således understregelse high fidelity, som vores model beskriver flyve data både i tid og frekvens.
På tid beslutninger på et par minutter eller mindre, flyve aktivitet vises data støjende, hvilket gør det vanskeligt at udtrække parametre direkte fra de rå data. Binning data i længere tidsintervaller kan mindske støjniveau, men kan ændre data på måder, der kan påvirke estimering af model parametre. Vi får derfor parametrene fra power spektre af optagelser, ved hjælp af et analytisk udtryk for de forventede effekt spectra beregnes fra Fouriertransformation af model funktion8 (Se yderligere fil 1 reference8). Denne tilgang til at opnå parametre fra power spectra giver nøjagtige parameterværdier uden nogen yderligere manipulationer, såsom binning eller filtrering af rå aktivitetsdata. Matematiske detaljer af model og applikationer til wild-type og mutant data er beskrevet i reference8. Protokollen præsenteres her fokuserer på de trinvise instruktioner til at bruge værktøjet beregningsmæssige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. måling af flyve bevægelse ved hjælp af Drosophila aktivitet Monitor (DAM)
Bemærk: For flere detaljer se reference 5.
- Forbered enkelte flyve rør med mad på ene ende og bomuld på den anden. Slut med mad skal være forseglet for at undgå fødevaren mod udtørring.
- Sæt 5-6 g flyve mad i en 50 mL bægerglas. Skære mad i små stykker, så det er nemmere at smelte den.
- Tilslut 32 individuelle glasrør med en elastik.
- Smelte mad i bægerglasset ved at opvarme det i en mikrobølgeovn til 10-15 s. Stop mikrobølgeovnen hver 5 s og forsigtigt ryste bægerglasset for at sikre lige smeltning af mad.
- Mens maden er stadig flydende, sætte de forberedte enkelte rør i bægerglasset med mad. Flytte rørene op og ned, så de er lige så fyldt.
- Tillad mad til at køle og størkne for ca 1 h.
- Efter maden er solid, fjerne rør med mad fra bægerglasset.
- Seal ende indeholdende mad ved hjælp af voks. Først, forsigtigt ren et rør ved hjælp af en køkkenrulle, derefter tryk røret mod voks. Visuelt kontrollere kvaliteten af seglet, og hvis det er nødvendigt, gentage forsegling igen.
- Lukke anden enden af røret med bomuld, bomuld vil tillade luft hen til efterkontrollere at holde en flue låst i røret.
- Placere et enkelt fly i hver enkelte rør og placere rørene i Dæmningen.
- Sted skærme i en inkubator, der opretholder konstant temperatur og luftfugtighed. Baseret på eksperimentet, angive de ordentlige lys/mørke forhold som følger.
- For lys/mørke eksperimenter holde fluerne i lys/mørke cyklus for hele eksperimentet. Brug ikke den første dag af målinger i analysen.
- For konstant mørke eksperimenter, først holde fluerne i to dage i lys/mørke forhold for medrivning og synkronisering af ure og derefter skifte til konstant mørke. Brug ikke målinger fra den første dag i konstant mørke i analysen.
- Indsamle mindst fire dage af data, der kan bruges i analysen.
Bemærk: DAM system vil output en enkelt fil med en bevægelse optagelse af alle fluer i monitoren.
2. Dataanalyse
- Split skærmen output filen i flere filer, enkelt flyve aktivitet; hver fil skal være en enkelt kolonne ' .txt ' fil med en individuel flyve locomotion måling.
- Køre ' ModelFitPS3.m ' funktion i en Matlab kommandovindue med følgende input parametre:
- For samplingrate, angive data prøveudtagning tidsintervallet i sekunder. For eksempel, hvis aktivitet var målt hvert minut, Angiv 60 som den samplingrate.
- For bin_interval, angive tidsintervallet i minutter som data vil blive arkiveret lodret for bedre visualisering, anbefalede bin interval er 20-30 min.
- Trend, Angiv " 1 " Hvis dataene viser baseline tendens og " 0 " ellers; data med tendens vil detrended først ved montering af en anden orden polynomiel og derefter fratrække det fra data.
- i pop-up-vinduet Vælg en enkelt flyve aktivitet fil.
Bemærk: Den første plot er data power spectrum og ikke kender aktivitet plot. Plottet magt spektrum, bestemmes den primære periode T 0: enten klikke med venstre museknap på døgnrytmen peak eller med højre museknap på den anden harmoniske peak (omkring T 0 / 2). - På handlingen åbnede data kontrollere hvis morgen og aften toppe er godt visualiseret. Hvis ikke, den bin_interval ændres ved at højreklikke et vilkårligt sted på grafen og indtaste en ny bin_interval værdi i dialogboksen. Programmet vil gentegne data med den nye værdi i intervallet. For at acceptere bin_interval værdien, venstre klik et vilkårligt sted på grafen.
- Programmet vil gentegne data igen og viser de første fem dage af aktivitet. Klik på den første M top, der vil blive brugt i analysen (nogle gange er det nødvendigt at springe en eller to dage) på dette plot,.
Bemærk: Programmet vil tegne grafen fra plukkede morgen peak. De blå og røde linjer vil vise den omtrentlige placering af E peak og næste dag M peak, henholdsvis, baseret på perioden, være bestemt i trin 2.4. - På den samme graf, vælge data for en indledende fit af data med modellen: Klik på de følgende punkter (i dette bestille, Bemærk at placeringen, klik vil være angivet med en rød stjerne på bunden): (i) toppen af M peak; (ii) årets M peak; (iii) start af E peak; (iv) top E top; (v) årets E peak; (vi) toppen af M-toppen af den morgendag.
- Bemærk, at programmet nu præsenterer power spectrum.
Bemærk: X-aksen er nu givet i frekvens.- i det åbnede vindue med magt spektrum, samle point, der skal bruges til montering af den analytiske udtryk for model power spectrum. Perioden blev fundet i trin 2.4 er markeret med en rød linje. For at vælge passende punkter, skal du først finde ud omkring den primære periode, svarende til trin 2.4. Derefter bruge skyderen, finjustering perioden primære værdi, så montering peger (vist med røde cirkler, vises efter flytte skyderen) er lukket for spidsværdier.
- Efter visuel peak udvælgelse, klik " Accepter ", og programmet vil passe valgte punkter med den analytiske udtryk for at beregne model parametre.
- Bemærk, at parametrene og spektral fit fejl er gemt i filen " model_fit_parameters.txtŔ programmet gemmes desuden 2 tal med anfald af bevægeapparatet data og dets magt spektrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden præsenteres her giver mulighed for kvantificering af de vigtigste funktioner i flyve bevægelses mønster. Kvantificering opnås ved montering aktivitetsdata med en model, der består af fire eksponentiel vilkår:
Modellen har ni uafhængige parametre, der beskriver aktiviteten mønster. Parametre bMD,bhr.,bED,og bER definere priser morgen henfald (MD), morgen anledning (MR), aften henfald (ED), og aftenen anledning (ER), henholdsvis. Parameter T0 definerer døgnrytmen periode, TM og TE definere bredder af M og E toppe, og HM og HE definere højder af M og E toppe.
Værdier for parametrene, der er fremstillet af ufiltreret dataene i et par trin (figur 2). Først, en døgnrytmen perioden aktivitet power spectrum (protokol trin 2.4) bestemmes. Derefter, foreløbige parametre værdier er udvundet af locomotion optagelse ved at montere det med f(v) (protokol trin 2,5-2.6). Disse værdier tjene som indledende gæt til montering data magt spektrum med analytiske udtryk afledt i8 (ekstra fil 1 i reference8) ved at tage Fouriertransformation af f(v):
hvor Tn = T0/n, hvor n = 1,2,3... og T0 er perioden døgnrytmen (protokol trin 2.7-2.8). Ved hjælp af den spektrale pasform, er model parametre udvundet fra flyve bevægelse uden filtrering eller udsmidningen. Montering af power spectrum producerer endelige værdier for parametrene model, som derefter anvendes til at konstruere den endelige form af f(v), dvs, modellen af flyve bevægeapparatet rytmer.
I modellen, kan b parametre være enten negative eller positive, som afspejler krumning af de tilsvarende eksponentielle udtryk. Parametrene bMD og bER er positiv, når eksponenter er konvekse og negative når eksponenter er konkav, mens parametre bhr. og bED er positiv, når eksponenter er konkav og negativ når den eksponenter er konveks. Generelt for eksponenter beskriver M peak, stigningen i b parametre angiver langsommere stigning eller forfald, og for eksponenter beskriver E peak, stigningen i b parametre angiver hurtigere stigning eller forfald.
Figur 3 viser eksempler på passer fremstillet af denne algoritme. Spektrale toppe på T0 og harmoniske fra T0/2 til T0/10 er monteret (figur 3A). Andre harmoniske typisk har højder lavere end signifikansniveau på 0,05 og anvendes derfor ikke i analysen. Parametre fra den spektrale fit bruges til at konstruere en model for flyve bevægelse (figur 3B, red). Metoden virker både vildtype fluer (figur 3, top paneler) og døgnrytmen mutanter med ændrede periode længder (figur 3, midten og bunden paneler). For yderligere eksempler og forbindelser mellem model og underliggende biologi, henvises til Lazopulo mfl. 8 resultater fra proceduren for montering er gemt i en fil i følgende rækkefølge: bMD,bhr.,bER,bED, T0, TM/t0, TE /T0, HM, HE (tabel 1). Programmet gemmer også til outputfilen montering fejl af den spektrale pasform, Err, der beregnes som summen af kvadrater af restkoncentrationer (restsummen af kvadrater) normaliseret med kvadratet på maksimalt antal data power spectrum.
Figur 1 . Power spektre af forskellige bølgeformer. Ifølge Fourier sætningen viser kun en sinusformet bølge en enkelt peak i en magt spektrum, mens mere komplekse bølgeformer, såsom kvadratiske eller savtakket bølge, viser yderligere toppene på harmoniske af den primære periode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Skematisk fremstilling af den parameter udvinding algoritme. Sidste parameterværdier hentes fra montering magt spektrum. Da proceduren montering kan være følsomme over for starter værdier, algoritmen bruger foreløbige værdier beregnet ud fra locomotion data og opdaterer dem ved hjælp af power spectrum. De sidste parameterværdier bruges til at konstruere f(v), der bedst beskriver dataene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Repræsentative resultater af den metode, der kvantificerer flyve bevægelse ved hjælp af en model bølgeform. (A) parametre af modellen er udvundet fra montering af de første ti tinder af magt spektrum. (B) fås parametre bruges til at konstruere en model af aktivitet. Metoden kan anvendes til vildtype fluer (top paneler) eller mutanter med kort (midterste paneler) og lange (bunden paneler) døgnrytmen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| flyve genotype | bMD (1/min) | bhr. (1/min) | bED (1/min) | bSkadestuen (1/min) | T0 (min) | TM/t0 | TEt0 | HM | HE |
| vildtype | 0.0094 | 0.2077 | -0.0383 | 0.0606 | 1438 | 0.1528 | 0.0833 | 5.2238 | 8.7185 |
| korte døgnrytmen mutant | 0.015 |
Tabel 1. Eksempel på parametre udvundet fra montering magt spectra vist i figur 3. Programmet udgange de endelige parameterværdier til "model_parameters.txt" fil som vist i tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde præsenterer vejledning i brug af et beregningsprogram værktøj, som giver en kvantitativ beskrivelse af flyve bevægelses mønster. Værktøjet passer locomotion data med en matematisk model bestående af fire eksponentiel vilkår, der tilsammen beskriver formen og størrelsen af M og E toppene. De endelige værdier for parametrene model er fremstillet af montering magt spektre af data, hvor brugen af de rå data kan undgå artefactual effekter, der data binning eller filtrering kan pålægge parameterværdier. Model parametre kan derefter bruges til yderligere undersøgelse flyve bevægelse og de mekanismer, der giver anledning til aktivitet toppe.
Kvaliteten af montering kan evalueres på to måder: ved visuel observation af power spectrum passer og ved hjælp af montering fejl (restsummen af kvadrater), der beregnes med parametrene. En af de vigtigste faktorer, der påvirker den fit kvalitet er bestemmelse af døgnrytmen perioden T0 (protokol trin 2.8). Denne værdi af T0 påvirker estimering af toppene i parametrene magt spektrum og model. Et andet vigtigt skridt, der påvirker den fit kvalitet er Udvalget af udgangspunktet for en indledende fit af data (protokol trin 2.7), siden TM og TE værdier defineres gennem dette valg. Brugeren kan udforske flere fit resultater ved at vælge forskellige dage i aktivitet for at definere TM og TE.
Vores model er fokuserede på efterligne godt beskrevet ur kontrolleret bevægeapparatet adfærd med to prominente toppe af aktivitet. Denne adfærd er observeret både i lys og mørke og i konstant mørke betingelser, hvilket gør metoden gælder for disse to typer af eksperimenter. Men modellen tager ikke hensyn lyset drevet burst af aktivitet observeret i nogle lys/mørke eksperimenter. En anden begrænsning opstår fra udvinding af model parametre kræver brugerinput (protokol trin 2,7-2.9). Da parametre ThomsenM, TEog T0 er fremstillet af brugerinput, analyseres hver flyve aktivitet manuelt. Derudover anbefales det at bruge metoden med individuelle aktiviteter i stedet for med et gennemsnit af befolkningen optagelse, da proceduren gennemsnit skjuler mange vigtige individuelle forskelle i flyve locomotion. Selv om det kan virke besværligt for stort antal fluer, ved at analysere flyve aktiviteter individuelt, får brugeren værdifulde statistiske oplysninger om graden af parameter variation inden for en gruppe af dyr. For at overse disse fordele, er det muligt at generere en befolkning i gennemsnit flyve bevægelse og analysere det for at få gennemsnitlige parameterværdier.
Den model, der anvendes i dette arbejde er en forbedret version af bølgeform fra vores tidligere forskning8. I modsætning til den tidligere model har det særskilte parametre for M og E tophøjder, HM og HE, henholdsvis. Den nye model viser forudsigeligt bedre aftale med flyve aktivitetsdata, da morgen og aften toppe typisk har forskellige højder.
Denne analyse er ikke begrænset til at flyve locomotion målt med infrarød stråle teknik. Andre metoder, såsom video-tracking, producerer lignende mønstre af flyve daglig aktivitet med M og E toppe viser eksponentielle dynamik i storhed og forfald9. Værktøjet drøftet her kan let anvendes til disse alternative datasæt.
Metoden drøftet her kvantificerer flyve bevægeapparatet optagelser med mål at forbinde adfærdsmæssige output til underliggende mekanismer, der regulerer flyve daglige adfærd og styre bimodal aktivitet mønster. Flere nyere undersøgelser, der tager sigte på at identificere neuroner og substrater figuren M og E aktivitet toppe10,11. Efterforskerne manipuleret aktiviteten af visse neuronal grupper og analyseret deres rolle i dannelsen af aftenen peak ved at observere ændringer i højde og fase af E-toppen. I vores model parametre HE bestemmer højden af E peak, TE giver Topbredden og parametre bER og bED beskrive figuren peak. Som beskrevet i henvisning8, i forbindelse med biokemiske kan HE indikere måling af niveauer af neuropeptider NPF og ITP, mens bER og bED kan repræsentere satserne for deres frigivelse og nedbrydning. Sammen, disse parametre kan være udnyttet i fremtidige undersøgelser for at bedre forbinde flyve adfærd med neuromodulatory signalerer mod en integreret beskrivelse af bimodal mønstre i flyve bevægeapparatet rytmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Stanislav Lazopulo hjælp med video-indhold.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2, DAM5 | Measures fly locootion using single infrared beam |
| MatLab | Mathworks | Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes | |
| Drosophila melanogaster | per[S], per[L], iso31(wild type) | Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period |
References
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: general perspective. Biological Rhythms. II, 57-80 (1981).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (11), 764-776 (2010).
- Tataroglu, O., Emery, P. The molecular ticks of the Drosophila circadian clock. Curr Opin Insect Sci. 7, 51-57 (2015).
- Plautz, J. D., et al. Quantitative analysis of Drosophila period gene transcription in living animals. J Biol Rhythms. 12 (3), 204-217 (1997).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J Vis Exp. (43), e2157 (2010).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster--sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms. 15 (2), 135-154 (2000).
- Dautzenberg, F. M., Neysari, S. Irreversible binding kinetics of neuropeptide Y ligands to Y2 but not to Y1 and Y5 receptors. Pharmacology. 75 (1), 21-29 (2005).
- Lazopulo, A., Syed, S. A mathematical model provides mechanistic links to temporal patterns in Drosophila daily activity. BMC Neuroscience. 17 (1), 14 (2016).
- Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PloS ONE. 7 (5), e37250 (2012).
- Schlichting, M., et al. A Neural Network Underlying Circadian Entrainment and Photoperiodic Adjustment of Sleep and Activity in Drosophila. J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).
- Guo, F., et al. Circadian neuron feedback controls the Drosophila sleep-activity profile. Nature. 536 (7616), 292-297 (2016).
