Summary
Se presenta un método para cuantificar las principales características temporales vistas en mosca los ritmos locomotores. La cuantificación se logra encajando actividad mosca con una forma de onda multi-paramétrico del modelo. Los parámetros del modelo describen la forma y el tamaño de la mañana y noche picos de actividad diaria.
Abstract
En la mayoría de los animales y plantas, relojes circadianos orquestan procesos conductuales y moleculares y sincronización en el ciclo diario de luz-oscuridad. Los mecanismos fundamentales que subyacen a este control temporal se estudian ampliamente con la mosca de la fruta Drosophila melanogaster como organismo modelo. En moscas, el reloj se estudia típicamente analizando grabación locomotor varios días. Tal grabación muestra un complejo patrón bimodal con dos picos de actividad: un pico de la mañana que sucede alrededor de amanecer y un pico de la tarde que ocurre al atardecer. Estos dos picos forman una forma de onda que es muy diferente de oscilaciones sinusoidales observado en los genes del reloj, que sugieren que mecanismos además el reloj tienen profundos efectos en la producción de los patrones observados en datos conductuales. Aquí proporcionan instrucciones sobre el uso de un método computacional desarrollado recientemente que matemáticamente describe patrones temporales en la actividad de la mosca. El método ajusta a los datos de actividad con una forma de onda de modelo que consta de cuatro términos exponenciales y nueve parámetros independientes que describen completamente la forma y el tamaño de la mañana y noche picos de actividad. Los parámetros extraídos pueden ayudar a elucidar los mecanismos cinéticos de sustratos subyacentes a los patrones de actividad bimodal comúnmente observados en los ritmos locomotores mosca.
Introduction
El reloj circadiano es un oscilador bioquímico endógeno con un período de aproximadamente 24 horas y es casi ubicuo en animales y plantas de1,2. El reloj ayuda a sincronizar los procesos internos de un organismo y el comportamiento para el ciclo oscuro de luz externo. La estructura genética del reloj circadiano ha sido ampliamente estudiada desde la década de 1960 con la mosca de la fruta D. melanogaster. En este insecto, el núcleo del reloj circadiano consiste en cuatro proteínas: período, atemporal, reloj y ciclo. Estos componentes del núcleo junto con otras moléculas forman un bucle de retroalimentación que produce casi sinusoidales oscilaciones de reloj genes3,4. El reloj circadiano en moscas es ampliamente estudiada usando grabaciones locomotoras varios días donde se detecte actividad mosca con un rayo infrarrojo solo cruzando la mitad de un tubo individual5. Una mosca típica grabación tiene un complejo patrón bimodal con dos picos bien distinguibles: punta de la mañana (M) que se inicia al final de la noche y tiene un máximo cuando se enciende; y pico de la tarde (E) que se inicia al final del día y tiene un máximo cuando las luces se apagan6. Curiosamente, la forma de tal grabación de comportamiento es muy diferente de las oscilaciones sinusoidales simples observadas a nivel molecular, lo que sugiere la acción de mecanismos adicionales que contribuyen a los patrones observados de temporales. Para entender mejor estos mecanismos ocultos, hemos desarrollado una herramienta computacional que proporciona una descripción cuantitativa de los patrones temporales.
En nuestro trabajo, los ritmos locomotores se definen en términos de forma de onda que imita el patrón de la mosca de la actividad. Desde simples ondas sinusoidales no puede utilizarse para modelar los cambios rítmicos observados en la actividad, hemos probado varias formas de señal para seleccionar la más simple que captura todas las características en las grabaciones. Comportamiento circadiano de la mosca de la fruta es controlada por la actividad de las neuronas reloj que a menudo tienen exponenciales patrones de activación y desactivación7. La dinámica exponencial y análisis visual de los datos nos motivaron a construir un modelo con términos exponenciales que consta de cuatro exponentes con nueve parámetros independientes y muy parecidas a la mosca actividad patrón8. Además de los datos del aparato locomotoras, también analizamos su espectro de energía. Espectro de actividad típica mosca muestra varios picos en armónicos T02 T03, etc., además el pico fundamental previsto en el período circadiano T0. Según el teorema de Fourier, sólo una onda senoidal pura produce un solo pico en espectros de energía, mientras que las más complejas formas de onda muestran varios picos espectrales en armónicos del período primario (figura 1). Por lo tanto, dada el no-sinusoidal patrón temporal de actividad mosca8, matemáticamente se espera y no implica necesariamente la presencia de múltiples períodos de oscilación de un espectro de energía multi-pico de los datos. Lo importante es el espectro de energía de la onda modelo propuesto muestra picos en los armónicos de la época primaria, similar a las grabaciones locomotoras mosca, subrayando así la alta fidelidad con que nuestro modelo describe mosca datos tanto en tiempo como en frecuencia.
En resoluciones de tiempo de unos pocos minutos o menos, mosca actividad datos aparecen ruidos, lo que hace difícil extraer parámetros directamente los datos en bruto. Datos binning en intervalos más largos de tiempo pueden disminuir el nivel de ruido, pero pueden modificar los datos de maneras que pueden afectar la estimación de parámetros del modelo. Por lo tanto obtenemos los parámetros de espectros de potencia de las grabaciones, usando una expresión analítica para los espectros de energía esperados calculados a partir de la transformada de Fourier de la función modelo8 (véase la archivo adicional 1 de referencia8). Este enfoque de obtención de parámetros de los espectros de energía produce valores de parámetro exacto sin cualquier manipulación adicional, como binning o filtrado de los datos crudos de la actividad. Detalles matemáticos del modelo y las aplicaciones a los datos de tipo salvaje y mutantes se describen en la referencia8. El protocolo aquí presentado se centra en las instrucciones paso a paso para utilizar la herramienta computacional.
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Protocol
1. medición de volar locomoción usando Drosophila actividad Monitor (DAM)
Nota: para más detalles véase referencia 5.
- Preparación individual volar tubos con el alimento en un extremo y el algodón en el otro. Al final con el alimento debe sellarse para evitar que los alimentos se sequen.
- Pone 5-6 g de comida de mosca en un vaso de precipitados de 50 mL. Corte los alimentos en trozos pequeños para que sea más fácil derretir lo
- Tubos de vidrio individuales 32 Conecte con una banda elástica.
- La comida en el vaso del derretimiento por calentamiento en un horno de microondas para 10-15 s. parar el microondas cada 5 s y agite con cuidado el vaso de precipitados para asegurar igual fusión de alimentos.
- Mientras que el alimento esté aún líquido, ponga los tubos individuales preparados en el vaso con los alimentos. Mover arriba y abajo los tubos por lo que igualmente están llenos.
- Permitir que el alimento se enfríe y solidifique para aproximadamente 1 h.
- Después de que el alimento es sólido, retirar los tubos con el alimento de la taza.
- Sellar el extremo que contiene el alimento utilizando cera. En primer lugar, limpiar cuidadosamente un tubo utilizando una toalla de papel, luego presione el tubo contra la cera. Visualmente Compruebe la calidad de la Junta y si es necesario, repetir la Junta otra vez.
- Cerrar el otro extremo del tubo con algodón, algodón permitirá mientras que mantener una mosca encerrada en el tubo de aire.
- Colocar una sola mosca en cada tubo individual y colocar los tubos en la presa de. Monitores de
- lugar en una incubadora que mantiene la humedad y temperatura constante. Basado en el experimento, establecidas en las condiciones adecuadas de luz/oscuridad.
- Para experimentos de luz/oscuridad mantienen las moscas en el ciclo de luz/oscuridad para el experimento entero. No utilice el primer día de medición en el análisis.
- Para experimentos de oscuridad constante, primero mantener las moscas durante dos días en condiciones de luz/oscuridad de arrastre y la sincronización de los relojes y luego a la oscuridad constante. No utilice las mediciones desde el primer día de la oscuridad constante en el análisis.
- Recoger por lo menos cuatro días de datos que pueden ser utilizados en el análisis.
Nota: El sistema de la represa generará un único archivo con un registro de locomoción de los moscas en el monitor de.
2. Análisis de datos
- Split el monitor salida de archivo en múltiples archivos de actividad única mosca, cada archivo debe ser una sola columna ' .txt ' archivo con una medición individual locomoción mosca.
- Run ' ModelFitPS3.m ' función en una ventana de comandos de Matlab con los siguientes parámetros de entrada:
- para samplingrate, establecer el intervalo de tiempo de muestreo de datos en segundos. Por ejemplo, si la actividad se midió cada minuto, 60 como ingresar el samplingrate.
- Para bin_interval, establecer el intervalo de tiempo en minutos en que datos se clasifica para mejor visualización; el intervalo bin recomendado es 20-30 min.
- Tendencia, introduzca " 1 " si los datos muestran la tendencia de la línea de base y " 0 "; datos con tendencia a detrended primero instalando un polinomio de segundo orden y luego la sustracción de los datos.
- En la ventana emergente Seleccione un archivo de la actividad de volar solo.
Nota: La primera parcela es espectro de energía de datos y no la trama de la actividad familiar. Desde el espectro de energía trazada, determinar el período primario T 0: o bien haga clic con el botón izquierdo del ratón en el pico circadiano, o con botón derecho del ratón en el segundo pico del armónico (alrededor de T 0 / 2). - En la trama de datos abierta, compruebe si se visualizan bien la mañana y noche picos. Si no es así, cambie el valor de bin_interval haciendo clic derecho en cualquier lugar en el gráfico e introducir el nuevo valor de bin_interval en el cuadro de diálogo. El programa se vuelva a tomar los datos con el nuevo valor del intervalo. Para aceptar el valor de bin_interval, haz click en cualquier lugar en el gráfico.
- El programa volver a dibujar los datos y mostrar los primeros cinco días de actividad. En esta trama, haga clic en el primer pico de M que se utilizarán en el análisis (a veces es necesario saltarse uno o dos días).
Nota: El programa será volver a dibujar el gráfico a partir de la punta de la mañana escogido. Las líneas azul y roja mostrará la posición aproximada del pico E y siguiente pico del día M, respectivamente, basado en el período determinado en el paso 2.4. - En el mismo gráfico, elija un ajuste preliminar de los datos con el modelo de datos: haga clic en los siguientes puntos (en este orden; tenga en cuenta que se indicará la ubicación del clic con una estrella roja en la parte inferior): pico de (i) arriba de M; (ii) el final del pico M; (iii) Inicio del pico E; (iv) la parte superior del pico E; (v) final del pico E; (vi) la parte superior del pico M del día siguiente.
- En cuenta que el programa ahora presenta el espectro de energía.
Nota: El eje x se da ahora en la frecuencia.- En la ventana abierta con el espectro de energía, escoger los puntos que se utilizarán para el montaje de la expresión analítica para el espectro de energía del modelo. El periodo detectado en el paso 2.4 está marcado con una línea roja. Para seleccionar puntos, primero determine aproximadamente el período primario, similar al paso 2.4. Luego usando la barra deslizante, afinar el período primario de valor para que la conexión señala (se indica con círculos rojos, aparecerá después de mover el control deslizante) están cerrados a valores máximos.
- Después de la selección visual máximo, haga clic en " aceptar " y el programa ajusta a puntos seleccionados con la expresión analítica para el cálculo de los parámetros del modelo.
- Tenga en cuenta que los parámetros y el error de ajuste espectral se guardan en el archivo " model_fit_parameters.txtŔ el programa además ahorrará 2 cifras con ajustes de los datos del aparato locomotoras y su espectro de energía.
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Representative Results
El método presentado aquí permite la cuantificación de las principales características en el patrón de locomoción mosca. La cuantificación se logra ajustando los datos de actividad con un modelo que consta de cuatro términos exponenciales:
El modelo tiene nueve parámetros independientes que describen el patrón de actividad. Los parámetros bMD,bSeñor,bEDy bER definir las tasas de decaimiento de la mañana (MD), subida de la mañana (Señor) y por la noche decaimiento (ED), subida de noche (ER), respectivamente. Parámetro T0 define periodo circadiano, TM y TE definen anchos de los picos de M y E, y HM y HE definen alturas de M y E.
Valores de los parámetros se obtienen de los datos sin filtrar en unos pocos pasos (figura 2). En primer lugar, se determina un período circadiano del espectro de energía de actividad (paso de protocolo 2.4). Entonces, valores de los parámetros preliminares se extraen de la locomoción grabación ajustando con la f (t) (pasos de protocolo 2.5-2.6). Estos valores sirven como conjetura inicial para el montaje del espectro de energía de datos con una expresión analítica derivada en8 (archivo adicional 1 en la referencia8) tomando la transformada de Fourier de f (t):
donde Tn = T0/n, con n = 1,2,3... y T0 es el periodo circadiano (protocolo pasos 2.7-2.8). Usando el ajuste espectral, los parámetros del modelo se extraen mosca locomoción sin filtrado ni binning. Montaje del espectro de energía produce valores finales para los parámetros del modelo, que luego se utilizan para construir la forma final de f (t), es decir, el modelo de mosca ritmos locomotores.
En el modelo, b parámetros pueden ser ya sea negativo o positivo, que refleja la curvatura de los correspondientes términos exponenciales. Los parámetros bMD y bER son positivos cuando los exponentes son convexos y negativa cuando los exponentes son cóncavos, mientras que los parámetros bSeñor y bED son positivos cuando los exponentes son cóncavos y negativa cuando la exponentes son convexos. En general, para los exponentes que describe el pico M, el aumento en los parámetros b indica más lento auge o decaimiento, y de los exponentes que describe el pico E, el incremento en los parámetros b indica más rápido auge o decaimiento.
La figura 3 muestra ejemplos de ajustes obtenidos por este algoritmo. Disponen de picos espectrales en T0 y armónicos de T02 T010 (Figura 3A). Otros armónicos típicamente alturas inferior al nivel de significancia de 0.05 y, por tanto, no se utilizan en el análisis. Parámetros obtenidos de la forma espectral se utilizan para construir un modelo de locomoción mosca (figura 3B, rojo). El método funciona tanto para los mutantes con longitudes de periodo alteradas (figura 3, paneles medio e inferior) para moscas de tipo salvaje (figura 3, paneles superiores). Para las conexiones entre el modelo y la biología subyacente y ejemplos adicionales, consulte Lazopulo et al. 8 resultados desde el procedimiento de conexión se guardan en un archivo en el siguiente orden: bMD,bSeñor,bER,bED, T0, TM/T0, TE /T0, HM, HE (tabla 1). El programa también guarda el archivo de salida el error de ajuste de la forma espectral, 'Err', que se calcula como la suma de los cuadrados de los residuos (suma residual de cuadrados) normalizados por la Plaza de la máxima del espectro de energía de los datos.
Figura 1 . Espectros de diferentes formas de energía. Según el teorema de Fourier, sólo una onda sinusoidal muestra un solo pico en un espectro de energía, mientras que formas de onda más complejas, como onda cuadrada o diente de sierra, muestran picos adicionales en armónicos del período primario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Representación esquemática del algoritmo de extracción de parámetro de. Se obtienen valores de parámetro final del accesorio el espectro de energía. Puesto que el procedimiento de instalación puede ser sensible a partir de valores, el algoritmo utiliza valores preliminares calculados a partir de los datos de la locomoción y actualiza utilizando el espectro de energía. Los valores de parámetro final se utilizan para la construcción de f (t) que mejor describe los datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Resultados representativos del método que cuantifica volar locomoción usando una forma de onda modelo. (A) los parámetros del modelo se extraen de montaje los primeros diez picos del espectro de energía. (B) obtenido parámetros se utilizan para construir un modelo de actividad. El método puede ser aplicado a las moscas de tipo salvaje (paneles superiores) o mutantes con corto (mediados paneles) y durante mucho tiempo los ritmos circadianos (paneles inferiores). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| genotipo de la mosca | bMD (1/min) | bSeñor (1min) | bED (1/min) | bER (1/min) | T0 (min) | TM/T0 | TE/T0 | HM | HE |
| tipo salvaje | 0.0094 | 0.2077 | -0.0383 | 0.0606 | 1438 | 0.1528 | 0.0833 | 5.2238 | 8.7185 |
| corto circadiano mutante | 0.015 |
Tabla 1. Ejemplo de parámetros extraídos de montaje de los espectros de potencia que se muestra en la figura 3. El programa de salidas de los valores de parámetro final al archivo "model_parameters.txt" como se muestra en la tabla.
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Discussion
Este trabajo presenta las instrucciones para el uso de una herramienta computacional que proporciona una descripción cuantitativa del patrón de locomoción mosca. La herramienta ajusta a datos de locomoción con un modelo matemático que consta de cuatro términos exponenciales que juntos describen la forma y el tamaño de los picos de M y E. Los valores finales para los parámetros del modelo se obtienen del ajuste de los espectros de energía de los datos, donde el uso de los datos en bruto puede evitar efectos artefactuales que binning o filtrado de los datos pueden imponer sobre los valores de parámetro. Los parámetros del modelo pueden utilizarse entonces para mayor estudio locomoción mosca y los mecanismos que dan lugar a los picos de actividad.
La calidad de la conexión puede evaluarse de dos maneras: por observación visual del espectro de potencia ajuste y utilizando el error de ajuste (suma residual de cuadrados) que se calcula junto con los parámetros. Uno de los principales factores que influye en la calidad de ajuste es la determinación del período circadiano T0 (paso de protocolo 2.8). Este valor de T0 afecta la estimación de los picos en los parámetros de modelo y espectro de energía. Otro paso clave que influye en la calidad de ajuste es la selección de punto de partida para un ajuste preliminar de los datos (paso protocolo 2.7), desde TM y TE valores están definidos a través de esta selección. El usuario puede explorar varios resultados ajuste al elegir días diferentes de la actividad para definir TM y TE.
Nuestro modelo se centra en mímico el comportamiento locomotor de reloj descrito bien controlada con dos picos importantes de la actividad. Este comportamiento se observa tanto en luz/oscuridad y en condiciones de oscuridad constante, que hace el enfoque aplicable a estos dos tipos de experimentos. Sin embargo, el modelo no tiene en cuenta la luz accionada ráfaga de actividad observado en algunos experimentos de luz/oscuridad. Otra limitación surge de la extracción de parámetros del modelo requiere la entrada del usuario (pasos de protocolo 2.7-2.9). Desde parámetros TMTEy T0 son obtenidos por el usuario, cada actividad mosca debe analizarse manualmente. Además, se recomienda utilizar el método con actividades individuales, en lugar con un promedio de población de la grabación, ya que el procedimiento de promedio oculta muchas diferencias individuales importantes en locomoción mosca. Aunque pueda parecer incómodo para gran cantidad de moscas, analizando individualmente las actividades de la mosca, el usuario obtiene valiosa información estadística sobre el grado de variación de los parámetros dentro de un grupo de animales. Para pasar por alto estos beneficios, es posible generar una locomoción volar un promedio de población y analizar para obtener valores de parámetros promedio.
El modelo utilizado en este trabajo es una versión mejorada de la forma de onda de nuestra anterior investigación8. A diferencia del modelo anterior, tiene distintos parámetros para alturas de pico M y E, H,M y HE, respectivamente. El nuevo modelo muestra como era de esperar mejor acuerdo con los datos de actividad de volar, desde la mañana y noche cumbres tienen alturas diferentes.
Este análisis no se limita a volar locomoción medido con la técnica de haz de luz infrarroja. Otros métodos, como seguimiento de vídeo, producen patrones similares de actividad diaria mosca con picos de M y E mostrando dinámica exponencial de aumento y decadencia9. La herramienta aquí puede aplicarse fácilmente a estos conjuntos de datos alternativos así.
El método discutido aquí cuantifica mosca locomotoras grabaciones con el objetivo de conectar salida conductual volar mecanismos subyacentes que regulan el comportamiento diario y controlar el patrón de actividad bimodal. Varios estudios recientes encaminadas a identificar las neuronas y sustratos forma M y picos de actividad de la E10,11. Los investigadores manipularon la actividad de ciertos grupos neuronales y analizaron su papel en la formación del pico de la tarde observando cambios en la altura y la fase de la Cumbre E. En nuestro modelo, los parámetros HE determina la altura del pico E, TE da la anchura del pico, y parámetros bER y bED describir la forma de pico. Como se indica en la referencia8, en un contexto bioquímico HE puede indicar la medida de los niveles de neuropéptidos NPF y ITP, mientras que bER y bED pueden representar las tasas de su liberación y degradación. Juntos, que estos parámetros pueden ser utilizan en el futuro estudios para conectar mejor comportamiento mosca con señalización, hacia una descripción integrada de los patrones bimodales en ritmos locomotores mosca neuromoduladoras.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Stanislav Lazopulo ayuda con el contenido de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2, DAM5 | Measures fly locootion using single infrared beam |
| MatLab | Mathworks | Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes | |
| Drosophila melanogaster | per[S], per[L], iso31(wild type) | Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period |
References
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