Summary
本协议描述了通过将微细加工与 cryogelation 技术相结合的方法制备弹性3D 大孔 microcryogels。在加载与细胞, 3D microtissues 生成, 这可以很容易地注入在体内, 以促进再生治疗或组装成阵列的体外高通量药物筛选。
Abstract
为了将传统的2D 细胞培养技术升级到3D 细胞培养, 我们将微加工与 cryogelation 工艺相结合, 生产出大孔微尺度 cryogels (microcryogels), 可加载多种细胞类型, 形成 3D microtissues。在此, 我们提出了制造多功能 3D microtissues 及其在再生疗法和药物筛选中的应用的协议。尺寸和形状可控 microcryogels 可以在一个阵列芯片上制作, 可以被捕获片作为单独的细胞负载载体的可注射再生疗法或进一步组装在芯片上 3D microtissue 阵列的高通量药物筛选。由于这些微型 cryogels 的高弹性性质, 3D microtissues 在注射过程中保护细胞免受机械剪切力的侵袭, 为微创细胞治疗提供了巨大的可。这就保证了小鼠肢体缺血模型中细胞存活率的提高和治疗效果。同时, 以标准的 384-井格式组装 3D microtissue 阵列, 便于使用通用的实验室设施和设备, 使高通量的药物筛选在这个多才多艺的3D 细胞培养平台。
Introduction
传统的细胞培养在平坦的 two-dimensional (2D) 表面, 如培养皿或井板, 很难引出细胞行为接近他们的本土状态。在三维 (3D) 体系结构中包含各种细胞类型、胞外基质和生物活性可溶性因子的环境的精确重述1,2,3 ,4, 对于组织工程、再生医学、基础生物学研究和药物发现的应用 (5、6、7),在体外构建 biomimicking 组织是必不可少的. ,8,9。
在2D 细胞培养中, 3D 细胞培养被广泛应用于培养细胞的仿生微结构和功能性特征的体外。流行的3D 单元格区域性方法是将单元格聚合为椭球7、8、9、10。细胞椭球可以注射到受伤的组织, 增强细胞的保留和生存相比, 注射的分散细胞。然而, 在注射过程中, 流体剪切力对细胞的非均匀球体大小和不可避免的机械损伤导致细胞治疗效果不佳11,12,13。同样, 在椭球聚合过程中固有的不均匀性使得他们的翻译为3D 细胞高通量药物筛选挑战10。
另一种3D 细胞培养方法是在生物材料的帮助下实现的, 它通常将水凝胶或多孔支架中的细胞封装起来。它允许在构建3D 体系结构时具有更大的灵活性。对于治疗, 细胞包裹在散装支架通常被送到动物身体通过外科植入, 这是侵入性和创伤, 因此限制其广泛的翻译到床边。另一方面, 水凝胶可以通过注射悬浮在水凝胶前体溶液中的细胞进入动物体内进行微创治疗, 使原位凝胶通过热, 化学或酶交联的11。然而, 当细胞被交付, 而水凝胶前体仍然在水状态时, 他们也暴露于机械剪在注射期间。不仅如此, 化学或酶交联过程中, 在原位凝胶的凝胶体也可能造成损害的细胞内。在药物筛选中, 生物材料辅助细胞培养面临着均匀性、可控性和吞吐量等问题。使用水凝胶, 细胞通常涉及在凝胶过程中, 这可能会影响细胞的活力和功能。在细胞播种过程中, 凝胶也会阻碍大多数高通量设备的使用, 因为水凝胶可能需要在冰层上保存, 以防止在细胞播种前凝胶, 而水凝胶可能堵塞配药技巧, 这通常非常薄, 以确保准确性高通量筛选。预成形的支架可能会将生物材料的制造过程从细胞培养中分离出来, 但是大多数 scaffold-based 的产品都可以作为相对较低吞吐量14的散装材料。
为了克服目前3D 文化方法的一些缺点, 我们开发了一种微加工-cryogelation 集成技术来制造现成的和 user-friendly 的 microcryogel 阵列芯片15。在本协议中, 选择明胶作为 microcryogel 制造技术的例证, 因为它具有生物相容性、可降解、cost-effective, 并且不需要对细胞附着进行进一步的修改。其他天然或合成来源的聚合物也可用于制造, 这取决于应用。通过这一技术, 我们可以制造小型化和高弹性 microcryogels 的大小, 形状和布局可控。当加载各种细胞类型, 3D microtissues 可以形成各种应用。这些独特的功能使理想的可, 细胞保护和现场定向保留后, 注入在体内, 以加强治疗效果。不仅如此, microcryogels 可以进一步处理, 形成 3D microtissue 阵列, 这是兼容的通用实验室设备和仪器, 以实现高通量细胞培养多功能药物筛选和其他细胞化验。在这里, 我们将详细介绍 microcryogels 及其后处理作为单独的 3D microtissues 或 3D microtissue 阵列用于两个重要的应用, 细胞治疗和药物筛选, 分别为10,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
动物实验遵循了清华大学生物医学分析中心动物伦理委员会批准的严格的协议。在伦理委员会的批准下, 从北京协和医院整形外科部门获得了患者的知情同意, 得到了人体脂肪组织.
1. 制作 3D Microcryogels
- microstencil 阵列芯片的设计和制作
- 使用商用软件设计特定几何图形的数组, 如圆、椭圆、三角形或草 14 , 具体取决于后续应用程序.
注: 请参阅《再生医学议定书》2节和《药物筛选议定书》3节的设计细节. - 将设计导入激光雕刻机随附的激光雕刻软件中。根据工厂推荐的激光雕刻机, 将进口的设计用激光刻在聚 (methymethacrylate) (PMMA) 片上.
- 用去离子水清洗 microstencil 阵列芯片, 清除激光雕刻的碎片。在60和 #176 中烘干 microstencil 阵列芯片; c. 在室温下存放几个月的密封袋.
- 使用商用软件设计特定几何图形的数组, 如圆、椭圆、三角形或草 14 , 具体取决于后续应用程序.
- 制作 microcryogel 阵列芯片
- 将 4 microstencil 阵列芯片放在样品托盘上, 并插入等离子清洗器中。关闭清洁器的门, 打开真空泵2分钟, 然后打开最大的射频功率 (18 W), 以处理等离子清洗器中的 microstencil 阵列芯片在室温下3分钟以提高亲水性.
- 添加0.06 克明胶至1毫升去离子水, 形成 6% (重量/卷) 明胶前驱体溶液 (足以制造5芯片)。在60和 #176 温暖; C 在水浴中充分溶解。在冰上孵育5分钟.
- 添加3和 #181; L 戊二醛进入明胶前驱溶液, 最终浓度为0.3%。完全混合.
- 吸管200和 #181; 在 microstencil 阵列芯片的上表面上有戊二醛的前驱溶液.
注: 200 和 #181; L 足够75毫米和 #215; 25 毫米芯片不管设计。增加芯片表面面积时的比例. - 通过将2到3倍的弯曲的玻璃棒来回刮, 将溶液均匀地分布在芯片上.
注: microstencil 芯片上的每一个微井都可以用前驱体溶液填充, 因为等离子体处理后它们具有亲水性. - 立即将前体解决方案填充阵列芯片放置在-20 和 #176 中; C 型冰箱为 cryogelation 16 小时.
- 将冻调整为-40 和 #176; C 为30分钟, 将阵列芯片放在 cryogelation 冻和 lyophilize 阵列芯片中, 在真空中放置2小时.
注: 明胶 microcryogels 与相互连接的孔隙形成, 因为冰形成期间, cryogelation 升华在冻. - 进行2节以治疗严重肢体缺血 (CLI) 和3节的高通量药物筛选.
2。收集单个 Microcryogels 以形成可注射的 3D Microtissues, 用于处理 CLI
- 收集单个 Microcryogels
- 设计阵列 (75 mm 和 #215; 25 mm) 的600个圆圈, 每一个都有400和 #181; m 直径, 在可注射 3D microtissue 结构的商用软件。使用300和 #181 的 PMMA 制造 microstencil 阵列芯片的厚度, 详见1.1 节.
- 制造 microcryogel 阵列芯片, 如1.2 节所示.
- 用标准的软光刻制作一个与步骤2.1.1 相同的设计的芯片顶针阵列 16 , 17 .
- 将 microcryogel 阵列芯片叠加在集成电路顶针阵列的顶部, 将每个 microcryogel 与阵列上的顶针引脚对准。按 microcryogel 阵列芯片对顶针阵列, 以推动 microcryogels 出的 microwells 与突出的引脚上的硅橡胶顶针阵列, 以收获个人 microcryogels.
- 将 microcryogel 收获到水中, 并借助细胞过滤剂收集它们。使用一个过滤器从一个芯片收集 microcryogels ( 即 , 600 microcryogels).
- 用0.1 米 NaBH 清洗 microcryogels 4 在冰上20分钟以淬火任何 uncross 链醛残渣。每芯片使用5毫升的0.1 米 NaBH 4 。丢弃 NaBH 4 , 用5毫升去离子水冲洗3至5次, 每次15分钟.
- 将水从电池过滤器中丢弃, 并将 microcryogels 收集到每个单元格过滤器的一个簇中, 并使用弯曲的镊子将一个簇放入一个 35 mm 的 Petri 盘中。添加 50-70 和 #181; 我去离子水到每个星团, 盖上培养皿的盖子。轻轻地在桌面上轻敲培养皿, 以使所有的 microcryogels, 所以没有 microcryogels 是躺在另一个 microcryogel 的顶部形成单层 microcryogels 在培养皿的表面.
- 将收获的 microcryogels 冻结在-20 和 #176; C 为4到 16 h, 然后冻为 2 h (请参见步骤 1.2.7)。在室温下将 microcryogels 储存在真空中直到进一步使用.
- 特性 microcryogels
- 通过扫描电子显微镜 (SEM) 成像来评估 microcryogels 的孔隙。
- 将收获的和冻干的 microcryogels 固定到一个样品持有人的双面胶带和大衣与镀金的溅射涂布九十年代, 在成像之前的 SEM 11 。利用图像分析软件对七种不同扫描电镜图像中 microcryogel 孔直径的分布进行评价和分析.
- 在 35 mm 的培养皿中称一簇600冻干 microcryogels, 用于干明胶 microcryogels (GMs) 的重量。添加60和 #181; 我去离子水到冻干 microcryogels, 等待三十年代 microcryogels 完全吸收水和膨胀。重 microcryogels 肿。
- 确定 microcryogels 的平衡溶胀率和孔隙率, 因为肿胀的 microcryogels 与干明胶 microcryogels 的重量之比以及 microcryogels 中的保持水与水合 microcryogels 的重量之比,分别为 13 .
- 使用与数字测力仪集成的可编程注射器泵来测量可 microcryogels 14 。
- 用台盼蓝染色600片 microcryogels, 并在600和 #181 中悬浮; L 15% 明胶溶液, 达到均匀分布。负载1毫升 microcryogel 悬浮在1毫升注射器。使用可编程注射器泵在1毫升/分钟的流速下, 通过一个27口径的针头连接到1毫升注射器注入混合物.
- 通过数字测力仪检测 real-time 注入力, 绘制力-时曲线。注射后, 观察显微镜下 microcryogels 的完整性.
注: 在 15% (重量/卷) 明胶溶液中悬浮的 GMs 可以顺利注射, 并在注射后保持完好.
- 描述 microcryogels 的可降解性。
- 首先, 测量一组600冻干 microcryogels 在 35 mm 培养皿中作为干重的重量。然后, 浸泡600冻干 microcryogels 在2毫升 0.025% (卷/卷) 胰蛋白酶/EDTA.
- 在不同时间点使用单元过滤器从解决方案中收集 microcryogels ( 即 、10、20、30、40、50、60和 70 min)。用纸巾把多余的溶液吸走。测量 microcryogels 在不同时间点的重量, 并计算降解程度, 因为 microcryogel 在一定时间点的重量与 microcryogel 在时间上的比值为零.
- microcryogels 从步骤2.1.8 到 12 h 气体暴露的环氧乙烷灭菌系统, 然后在 vac 下进行12小时的脱气真空.
- 选择人脂肪间质基质细胞 (hMSCs) 治疗小鼠缺血性后肢。按照先前报告的 18 的步骤隔离单元格.
- 培养基中含有2% 胎牛血清 (FBS) 的生长培养基中的 hMSCs, 10 ng/毫升表皮生长因子 (EGF), 10 ng/毫升血小板衍生生长因子 bb (bb), 1X 胰岛素转铁蛋白硒 (其), 10 -8 M 地塞米松, 10 -4 M 抗坏血酸 2-磷酸酯, 100 U/毫升青霉素, 以及100和 #181; DMEM/F12 中的链霉素。通过细胞的比例为1:3 时汇合。在下面的实验中使用3到5的单元格.
- 收获 hMSCs 与胰蛋白酶和量化的细胞数使用一个福斯计数室和重密度 8 x 10 6 细胞/毫升在 hMSCs 生长培养基.
- 吸管60和 #181; L hMSCs 悬浮到 600 microcryogels 的单层, 直径为400和 #181; m 在35毫米的菜从2.1 节。细胞被自动吸收到多孔微结构的 microcryogels.
- 保持在湿润的室内, 孵育在37和 #176; C 为2小时以允许单元格附加。经过 2 h 的孵化, 加入2毫升培养基。每2天更换一次培养基。文化 hMSCs 加载 microcryogels 2 天, 形成 3D microtissues.
- 经过2天的培养, 吸管 100 hMSCs microcryogels 每井在一个96井板上, 添加120和 #181; 根据制造商和 #39 的指示, 对每个井进行了天青的工作解决方案。在37和 #176 孵育2小时;
- 检测天青在微读卡器中的可存活细胞代谢的荧光, 其激发光波长为 560 nm, 发射光波长为 590 nm。根据试剂盒协议 13 , 建立细胞数与荧光的标准曲线, 用 hMSCs 从荧光强度中插入细胞数.
- 从0天到4天的步骤2.3.7 中所述, 使用天青从0天到4天评估 microcryogels 中的 hMSCs 的数量.
- 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中, 用1:500 稀释素 AM 和1:250 稀释碘碘 (即活/死染色) microcryogels 染色细胞, 并在荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜下观察.
- 建立女性 balb/c/c 裸鼠的严重后肢缺血报告 11 , 19 以确定 3D microtissue-based 治疗的疗效.
- 使用5毫升吸管将 microtissues 从步骤2.3.6 转移到细胞过滤器中, 并过滤掉培养基.
- 重 hMSCs 3D microtissues 在15% 明胶溶液中, 密度为 100 microcryogels 每 100 #181; L 解决方案.
- 手术前, 用高压釜消毒手术工具, 在动物设施中心的动物手术室里进行手术.
- 将鼠标放入麻醉诱导室中, 其中含有1-3% 氟烷100% 氧气, 流速为1升/分. 将红霉素涂抹在老鼠的眼睛上以防止干燥。通过一个1厘米长的皮肤切口, 结扎股动脉及其分支与5-10 丝绸缝合和消费税 19 .
- 注射哚绿色 (0.1 毫升100和 #181; g/毫升) 通过尾静脉注射监测血流。在反射几何 11 中使用荧光成像系统 (这里是自制的系统) 执行组织的荧光成像.
- 注注射 microtissues 到三个部位的股薄肌周围的动脉切口使用1毫升注射器与23口径针.
- 手术后, 在恢复笼中用加热垫将鼠标保持温暖。注射皮下昔, 以减轻疼痛和持续监测, 直到清醒.
- 28 天后, 用荧光成像技术监测 3D microtissue 治疗肢体的疗效 11 .
#160; 注意: 注射皮下昔, 以减轻当小鼠出现自发肢体截肢时的疼痛. - 在实验完成后, 用二氧化碳安乐老鼠.
注: 在这里, 在清华大学生物医学分析中心的动物伦理学委员会批准的严格的协议中, 使用二氧化碳进行了安乐死的 .
3。用于高通量药物筛选的 Microtissue 阵列芯片的组装在片上单元格区域性的 microcryogel 数组的
- 程序集
- 根据常规井板尺寸修改1.1 节中的设计, 即 , 对于 384-井格式, 设计一个16和 #215 的数组; 24 口井 (行按列), 每个 2 mm 直径和 4.5 mm 中心间距.
- 激光雕刻到500和 #181; m 厚的 PMMA 板材, 如1.1 节所述.
- 使用从步骤3.1.2 获得的384井阵列芯片来制造 microcryogels, 如1.2 节所述。这个包含 microcryogel 的阵列被指定为 microcryogel 阵列芯片.
- 用50毫升0.1 米 NaBH 清洗 microcryogel 阵列芯片, 以使任何残留醛 uncross 连接, 然后用50毫升去离子水反复冲洗3次, 每次2小时.
- 丢弃水, 将 microcryogel 阵列芯片冻结在-20 和 #176; C 为4到16小时, 冻根据步骤 1.2.7.
- 在步骤3.1.1 中修改384井阵列设计, 以包含16和 #215; 24 口井, 每3毫米直径和 4.5 mm 中心间距.
- 从一张超薄 (10 & #181; m) 的双面胶粘带上取下背面的一侧, 并将其粘贴到3毫米厚的有机玻璃片的一侧。激光雕刻的设计, 从步骤3.1.4 到这个3毫米厚的有机玻璃板根据1.1 节。该数组被指定为储层阵列.
- 将 microcryogel 阵列芯片与储能阵列芯片对齐, 并紧密结合在一起, 组装 3D microcryogel 阵列芯片, 用于芯片上的细胞培养。1小时紫外线辐射灭菌
- 在室温下在真空中存储 3D microcryogel 阵列芯片, 以进行进一步的实验.
- 3D microtissue 阵列上的药物筛选
- 将25毫升无菌去水的湿箱填满, 作为细胞培养的湿度室。预热在湿润的 5% CO 2 孵化器到37和 #176; C.
- 从组织培养皿中采集非小细胞肺癌细胞 (NCI-H460) 和肝癌细胞 (HepG2), 根据标准协议和培养基中的 re-suspend, 最终密度为 1.0 x 10 6 细胞/毫升。完全混合.
注: RPM1640 10% FBS, 100 U/毫升青霉素和100和 #181; 链霉素用于 NCI-H460。使用 DMEM 与 10% FBS, 100 U/毫升青霉素和100和 #181; 链霉素 HepG2。 - 从孵化箱中取出湿度室。使用镊子小心地将组装的 3D microcryogel 阵列芯片从台阶3.1.9 在湿度室。注意不要在房间里用水浸湿 microcryogels.
- 将电池悬浮液彻底混合, 然后分3和 #181; 将细胞悬浮液的 L 直接放到 microcryogel 上.
注: 在排出细胞悬浮液前, 吸管尖端应轻触 microcryogel 表面。细胞通过吸收 auto-loaded 进入 microcryogel。不要在外围油井中播种细胞. - 添加10和 #956; 在单元格 microcryogel 使用多通道吸管 (例如96通道的液体处理器) 后, 将培养基中的每一个井。介质也被添加到外围油井中.
注: 使用 RPM1640 介质与 10% FBS, 100 U/毫升青霉素和100和 #181; g/毫升 streptomycin 为 H460 细胞。使用 DMEM 介质与 10% FBS, 100 U/毫升青霉素和100和 #181; 用于 HepaG2 细胞的链霉素. - 将细胞负载的 microcryogel 阵列芯片放在湿度室中, 在湿湿 5% CO 2 孵化器37和 #176; C 形成 3D microtissue 阵列.
- 溶解阿霉素和 IMMLG-8439 9 在二甲基亚砜 (亚砜) 中形成一个10毫米的股票溶液。用培养基稀释药物, 形成10倍稀释浓度梯度, 从2纳米到200和 #181; m.
- 在每个井中添加10和 #181; 我的药物解决方案。使用0.1% 甲基亚砜 (稀释中) 作为对照。孵育药物负载 3D microtissue 阵列在湿 5% CO 2 孵化器在37和 #176; C 为 24 h.
- 添加4和 #181; 天青库存解决方案。孵育在37和 #176; C 为 2 h. 在微读取器中放置 3D microtissue 阵列, 并在 560 nm 的激发光波长和 590 nm 的发射光波长上检测可活细胞代谢天青的荧光.
- 在进一步数据处理之前, 从所有井中减去天青基线信号。通过控制井的平均荧光信号除以其荧光信号, 计算出各井的细胞活力分数.
- 在绘图软件中绘制剂量-响应曲线, 以细胞活力分数为 Y 轴, 以药物浓度的基10对数作为 X 轴。将50% 抑制浓度 (IC50) 插在细胞活力分数 0.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D microtissue 形成的 microcryogels 的制备和表征。
根据该协议, microcryogels 是捏造的, 形成 3D microtissues 和个人 microcryogels 或 microcryogel 阵列, 并分别用于再生疗法和药物筛选 (图 1)。用 PMMA 制备的 Microstencil 阵列芯片作为 microcryogel 阵列芯片的 micromolds。microstencil 阵列芯片可进行可变几何设计。我们选择了一个代表性的 45 mm x 14 mm microstencil 阵列芯片作为一个例子, 其中包含各种形状 (即, 圆形, 椭圆形, 三角形和三叶草) 和一个圆形的 microstencil 阵列芯片的大小不同 (直径 = 100, 200, 400 和800µm). 为了提高阵列芯片上 micromolds 的可见性, 观察了光 epi-光照图像 (图 2A, B)。从阵列芯片中获取的 Microcryogels 展示了所需的形状和大小 (图 2C, D)。这种 microcryogels 与期望的几何特征可以作为模板, 形成不同的细胞单位, 模仿某些结构的本地组织。所收获的 GMs (明胶 microcryogels) 具有预定义的形状和大小 (图 3A)。SEM 观察表明, microcryogels 包含了相互关联的大孔结构, 孔径大小在 30-80 µm (图 3B) 范围内。
hMSCs 负荷 microtissues 增强可改善缺血性肢体抢救
使用可编程注射器泵集成了数字测力仪14, 对 GMs 的可进行了定量评估。在流速为1毫升/分钟, 密度为 1000 microcryogels 每毫升的 GMs 被注射在 6 n 以下, 这是低于临床可接受的力量 10 N20 (图 3F)。基于 gms 的细胞保护, 在5天的培养过程中, hMSCs 在注射后具有很高的生存能力, 并保持了很大的增殖力 (图 3H)。
选择小鼠肢体缺血模型评价注射 hMSC microtissues 的疗效。术后28天检查缺血性肢体的生理状况 (图 4A)。假组或 GMs 对照组未发现肢体残肢。在 105游离细胞治疗组中, 25% 天内观察到50% 总脚趾截肢, 25% 部分脚趾截肢, 7 部分截肢, 80% 天后20% 肢丢失, 28 总脚趾截肢。相比之下, microtissues 治疗与 105 hMSCs 取得了改善肢体抢救 (75%) 只有25% 只小鼠显示自发脚趾截肢后28天. 106 hMSCs, 在以前的研究中使用的最小有效细胞数, 是选择为正控制21。4只小鼠中只有2只出现了肢体抢救, 但都有轻微的坏死。
血液灌注监测和评估的援助哚绿色 (组织), FDA 批准血管造影造影剂。结果表明, microtissue 治疗小鼠和 106游离 hMSCs 治疗小鼠均出现荧光信号。在28天 (图 4B) 中, 假或 GM 组的缺血性后肢中没有明显的荧光信号。
这些结果进一步证实, 3D microtissue 辅助 hMSCs 治疗取得了优越的治疗效果的 CLI 治疗, 这代表了最小有效剂量的细胞疗法在小鼠模型到目前为止。
3D microtissue 阵列芯片高通量药物细胞毒性筛选
一个现成的 3D microcryogel 阵列的芯片细胞培养可以很容易地制作通过保留 microcryogels 在 PMMA 芯片干燥后, 并结合相应的 well-array 芯片与生物相容性胶带 (图1和图 5A)。在这两部分细胞培养阵列中, 顶部 well-array 芯片作为培养基的储层, 药物溶液和测定试剂, 而细胞被培养在 3D microcryogel 固定在底部阵列芯片。顶部和底部阵列芯片之间的粘合带允许为高通量的3D 细胞培养 (图 5B) 生成384个人井, 从而为药物发现提供了实用工具。
如协议所述, 3D microtissue 阵列是由直接播种细胞进入 microcryogels, 然后加入介质到储层中而形成的。通过使用 RFP 标记的 NIH-3T3 单元, 我们证明了在 microcryogels (图 5C, D) 的3D 体系结构中, 单元的分布与多层一致。SEM 图像显示, 细胞粘附在孔壁上, 甚至在 microcryogels (图 5E) 中沿或穿过孔隙的相邻壁展延丝状。
然后, 我们展示了应用这一 3D microtissue 阵列的可行性, 用于高通量药物测试使用两个癌细胞线和两个化合物。用阿霉素治疗肝细胞癌细胞 (HepG2), 非小细胞肺癌细胞 (NCI-H460) IMMLG-8439, 一种新型肿瘤抑制剂。将每种药物的五到九离散浓度分别管理为六邻井, 作为复制, 在培养基中采用0.1% 亚砜作为负控制。在传统的2D 井板中, 细胞毒性试验也同样进行。经过24小时的孵化, 细胞活力测定被用来评估的药物反应的细胞在2D 和3D。在不同药物浓度下使用规范化细胞生存率绘制药物反应曲线, 然后从这些曲线中插 IC50。较高的 IC50 值将表明细胞更耐药性。从图 5F和5I中, 我们观察到在 3D microtissue 阵列上培养细胞时耐药性显著增加, 而不是在2D。阿霉素对 HepG2 细胞的 IC50 达到165.959 µM, 相对于2D 的 18.239 nM;IMMLG-8439 在 NCI-H460 细胞上的 IC50 在3D 同样升高到 331.894 nm, 而在2D 只需要 1.294 nm。这种观察是与其他研究人员22,23中的3D 文化中耐药性增加的报告一致。
我们将这种增加的抗药性归因于3D 微环境的复杂性, 而2D 文化的平面配置。SEM 图像显示, HepG2 细胞聚集, 作为椭球装饰的表面孔隙在 microcryogel。这些细胞是紧密聚集的, 这种增强的细胞间相互作用可能是 HepG222的耐药性来源。还有一点值得注意的是, 这些细胞簇没有被自由地悬浮椭球, 因为它们仍然保持了对矩阵的一些附着力 (图 5G, H)。相反, 上皮-间质-转移 (急诊) 推测发生时, 非小肺癌细胞, NCI-H460, 在 3D microcryogels 培养。NCJ-H460 细胞像成纤维细胞一样分布 (图 5J, K), 而不是像 HepG2 一样聚集。因此, 我们推测, 耐药性的增加可能是由上皮 NCI-H460 细胞向更恶性状态转变的结果18,19,20,21,22 ,23。
图 1: 3D Microtissue 的原理和在再生疗法和药物筛选中的应用.简要介绍了用明胶 cryogelation 在阵列 PMMA 芯片上制备尺寸和形状可控 microcryogel 芯片。microcryogel 芯片可片作为个体 microcryogels, 进一步, 个体 microcryogels 可以 auto-loaded 与细胞和培养形成 3D microtissues 的可注射再生疗法。microcryogel 芯片的另一个应用是用储层阵列芯片组装, 然后进一步将细胞和培养物加载到 3D microtissue 阵列中进行高通量药物筛选。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:Microstencil 阵列芯片(A, B)两个不同形状的 microstencil 芯片 (即、圆形、椭圆形、三角形和三叶草) 和不同大小的圆形 (直径: 100、200、400和800µm) 的照片分别 (A),和两个对应的 microcryogel 阵列芯片 (B)。(C, D)从两个 microcryogels 阵列芯片中采集到的单个 microcryogels 的显微图像。缩放条 = 500 µm。此图已在引用14的权限中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 3D 注射 Microtissues 的特性.(A) 采集的 microcryogels 照片。(B) 扫描电子显微图像 (SEM) microcryogels 显示互联和大孔结构。(C, D)荧光显微镜和3D 重建共焦图像的 hMSCs 载 microtissues 染色的活/死和罗丹明笔。(E) 具有不同初始加载密度的 GMs hMSCs 自动和增殖量的定量。(F) 在1毫升的 15% (重量/卷) 明胶溶液中, 在1毫升/分钟注射率 (1,000-1-15%) 的情况下, 三次注射的实时注射力测量曲线为 1000 GMs。(G) 活/死细胞活力测定 hMSCs microtissues 预和后。(H) 在1、3和5天的区域性 (n = 3) 之后, 在 GMs 后中加载的 hMSCs 的增殖。* p 和 #60; 0.05、one-way 方差分析与1天比较。数据显示为平均± SEM。此图已在引用11的权限中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4:在3D 注射 Microtissues 治疗缺血性后肢中改进的抢救和增强血管新生.(A) 代表的假 (n = 4) 的照片, 空白 microcryogels (n = 4), 免费 hMSCs (105) (n = 8), hMSCs (105) 加载的 microtissues (n = 8), 和免费 hMSCs (106) (n = 4) 在 0, 3, 7, 和28天后治疗。(B) 荧光图像在28天的100s 注射后获得。此图已在引用11的权限中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 3D Microtissue 阵列用于高通量药物筛选.(A) 3D microtissue 阵列的照片, 以 384-井格式组装后, 和 (B) 天青细胞活力测定在阵列上进行。(C) RFP-3T3 microcryogel post-seeding 中的单元格 (比例栏 = 200 µm)。(D) 3D 重建细胞核染色, 描述 microcryogel 多层细胞的均匀分布。(E) 扫描电子显微图像的 RFP-3T3 细胞广泛传播在大孔壁的 microcryogels (规模酒吧 = 20 µm)。(F) 阿霉素对 HepG2 细胞的细胞毒性测试和 (I) IMMLG-8439 在 3D microtissue 阵列中的 NCI-H460 细胞上, 显示出 IC50 与2D 的相对。数据显示为平均± SD. (G) 小椭球的 HepG2 细胞在 microcryogel (刻度栏 = 100 µm), 与 (星号在H) 部分坚持在 microcryogel 墙 (规模酒吧 = 20 µm)。(J) NCI-H460 在 microcryogel 中粘附并传播的单元格 (刻度栏 = 100 µm)。(K) NCI-H460 的细胞展示光纤oblastic 形态学 (标尺 = 20 µm)。此图已在引用9的权限中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
再生医学和体外药物筛选模型是组织工程的两个重要应用:5,6,7,8,9。虽然这两种应用有着截然不同的需求, 但它们之间的共同点在于需要一个更具仿生的培养条件来增强细胞功能19。只有改进的细胞功能研究才能更好的治疗疾病20,21, 如果培养细胞反映药物反应更准确, 我们可以加速药物发现6,7。细胞存活后, 植入在体内是一个关键的要求, 再生医学, 而吞吐量是重要的药物筛选, 以处理数以千计的化合物, 在同一时间。这两个要求是具体的各自的应用, 很少能一技术满足这两个要求。因此, 我们有独特的集成的微细加工技术与 cryogel 制备的大孔 microcryogels, 可以收获片作为单独的细胞负载载体的再生治疗, 或保留在芯片上进一步组装成阵列高通量药物筛选。这些新型 microcryogels 的微尺度和 macroporosity 允许细胞通过简单的吸收自动和均匀的加载。采用新颖的 microstencil 制作 microcryogel 阵列芯片, 可轻松有效地生成成百上千个具有均匀和可重现几何特征的微型 cryogels。microcryogels 可以准备和储存的真空包装作为现成的, 随时可用的产品, 以方便准备 3D microtissues 在普通实验室的后续应用。使用这种制造技术, 我们能够满足共同的地面 (3D 培养条件更好的仿生学) 和对两个不同的应用的具体要求 (弹性保护细胞在注射再生医学和高通量的数组格式的药物筛选)。
细胞疗法对修复各种受损的组织或器官有很大的希望24。但是, 由于注射过程中的机械损伤、周围组织的高渗漏以及病变内的体内环境中的缺血和炎症, 细胞潴留、细胞存活和治疗的重现性仍然较差组织25。一些研究人员使用预制细胞聚合体来改善游离细胞的注射。但是, 它需要大量的单元格来形成单元聚合, 从而导致高成本、不均匀的大小和不可控的聚合数26。此外, 在注射过程中, 机械损伤和细胞死亡仍然是不可避免的。另外, 生物材料辅助的细胞治疗已经发展, 其中反应性材料 (如, 热或 pH 敏感的水凝胶) 可以与细胞和凝胶原位实现细胞保留27。然而,原位交联生物材料不允许细胞在体外启动, 并导致细胞立即暴露在病变部位的缺血性和炎症微环境中。解决这些问题, 提高治疗效率是当务之急。使用本协议制造的 microcryogels 的一个主要优势是它们的理想可, 因为它们的小型化和特殊的弹性, 促进了它们在细胞交付中的应用。可的 microcryogels 在细胞的传递过程中能够保护细胞, 因此它们可以在体外刺激细胞在 microcryogel 中形成3D 注射 microtissues, 以增强胞外基质 (ECM) 蛋白沉积, 以及细胞间的相互作用。3D 注射 microtissues 结果在微型组织样的合奏代表一个最佳的分娩策略, 以促进细胞保护, 植入, 生存, 从而改善最终治疗效果的病变部位。
除了提高细胞疗法的治疗效果, 我们的结果也表明3D 微环境对细胞药物反应的复杂影响。利用 biomimicking 培养条件, 就有可能诱发体外细胞药物应答更具代表性的体内反应, 从而加速药物发现67, 28。椭球是普遍的选择3D 细胞培养配置和许多技术已经开发, 以协助研究人员产生椭球。低粘附组织培养板29或用纳米感光剂8修饰的板面也被用来通过防止细胞基体粘附来强迫细胞聚集。虽然这些技术使用起来相对简单, 但诸如在中交换和其他操作期间丢失椭球以及椭球的大小变异性等问题都是阻碍 large-scale 采用此类技术的问题, 如6。更均匀的椭球可以形成使用悬挂下降30,31,32,33, 但它是劳动密集型, 如果不使用专门的板块。使用专业的井悬挂下降板, 并与自动液体处理系统集成6,31, 可以实现高通量筛选。球体培养的最大缺点是缺乏 ECM, 它已经被确定在所有生理和病理组织发展中发挥重要作用34。一项脑模型研究显示, 在 ECM 支架内培养的椭球, 与单纯的椭球相比, 提高了耐药性, 提高了乳酸的酸中毒, 提高了血管生成, 并增加了相关因素34。其他研究也表明, 基质的存在可以提供必要的机械信号来促进急诊和支持肿瘤特征的重述, 如侵袭和转移3,35,36,37。
随着对 ecm 在病理学发展中的重要性的认识越来越多, 毫无疑问, 将 ecm 纳入3D 培养方法可以帮助模拟在体内情况更好的6。天然或合成材料的水凝胶已被用于生成几个体外3D 肿瘤模型, 用于评估化疗由于其生物物理特性 (如刚性) 的灵活性和可控性 (如硬度)38,39,40,41,42. 虽然具有可调谐生物物理特性的水凝胶确实模拟了肿瘤细胞的重要生物学特性, 以促进更准确的药物筛选, 但这种方法的几个缺点阻碍了其在药物中的广泛应用。筛选.在细胞存在的聚合物的交联是必要的, 以封装细胞内的水凝胶基质, 这可能损害细胞。不仅如此, 不同生物物理特性的水凝胶对封装在内的细胞提出了不同的挑战。在软水凝胶中, 高含水量能支持细胞生长, 但这种凝胶很快降解, 为3D 细胞培养提供短期支持。另一方面, 高交联的较硬的水凝胶可以减缓降解, 但低含水量不能支持细胞生长, 高交浓度通常会诱发高 cytotoxicity43,44。不仅如此, 用水凝胶制备3D 细胞培养物是 labor-intensive 的, 与大多数高通量的液体处理系统是不相容的, 因为温度控制的凝胶前体溶液是重要的, 而稀薄的配药技巧的干扰可能导致从胶凝胶内的提示。因此, 这些缺点促使搜索替代 ecm 代理,即, scaffold-based ecm34。
使用预先支架, 细胞可以免于生物材料的制造过程, 因此提供了更多的控制脚手架制造的可能性, 因为更苛刻的条件可以使用, 而不怕破坏细胞。有几项研究表明, 3D 支架内培养的肿瘤细胞具有较高的耐药性, 与2D 由于恶性肿瘤和增强细胞 ECM 相互作用而培养的细胞相比,45,46, 47. 这种观察与我们在这里提出的结果是一致的。在我们的其他作品中, 我们进一步展示了 3D microtissue 阵列的通用性及其优于上述其他技术的优势。在最近的一项研究中, 我们通过在 3D microtissue 阵列上培养 HepaRG 细胞的上皮表型来提高肝脏功能, 并将此类阵列应用于药物肝毒性评价47。由于3D 大孔支架内孔径的均匀性, 我们能够控制肝细胞椭球在50-80 µm 内的大小, 而不管最初的细胞播种密度如何。这为非均匀大小的 free-forming 椭球提供了显著的优势。不仅椭球在每个支架内均匀生长, 井之间的细胞也均匀地被播种, 给变异系数 (cv) 可比较与细胞播种在 2D (即, cv = 0.09 在 3D microtissue 阵列和 cv = 0.05 在2D 商业板材;未显示数据)。在另一项工作中, 我们已经证明, 我们能够形成肝 microtumor 在 3D microtissue 阵列, 以重述肿瘤间质的相互作用, 筛选的基质重新编程组合治疗48。肝微型是由长期 (5 天) 培养成纤维细胞与肿瘤细胞在高密度。我们观察到的障碍, 药物扩散由于致密细胞和 ECM 结构形成的肝脏 microtumor, 这是类似的观察在体内32。利用荧光标记的癌细胞和机械引导的基质细胞, 结合素的发光作为肿瘤细胞的特异出, 高通量筛选新的治疗药物或联合抗肿瘤基质相互作用成为可能。
尽管我们的技术有许多独特的优点, 但目前 microcryogels 的缺点是不, 阻碍了 microcryogels 细胞的详细光学观察。进一步改善这些 microcryogels 将包括 fine-tuning 其光学特性, 以增强成像的细胞在 microcryogels 的观察。此外, 在我们的技术中还没有探讨诸如刚性等重要的生物物理特性, 如果我们想更好地模拟不同生物物理特性的生理和病理组织, 就需要解决这一问题。
虽然我们的技术允许简单的代 3D microtissues, 但一定要注意成功的实验。在 microstencil 阵列芯片上制作 3D microcryogels 时, 重要的是要确保 microcryogels 在放置在冻中时保持冻结状态。因此, 必须 pre-cool 冻, 并迅速将 microcryogels 从-20 ° c 冷冻机转移到冻。在冻或冻 microcryogels 前的熔化会导致毛孔坍塌, 从而影响 microcryogels 的孔隙度。当以阵列格式培养 3D microtissues 时, 需要注意确保两个阵列之间的附着力足以防止井间的交叉污染。此外, 虽然小型化细胞培养在提高吞吐量和减少试剂消耗方面有其优势, 但其缺点是低文化容量不能支持长期的细胞培养, 而无需频繁的媒体补充。不仅如此, 它是关键的保持湿度的文化环境, 以防止影响细胞生存能力由于媒体蒸发, 因为只有少数升的细胞悬浮或媒体增加。蒸发也会影响周围油井细胞的存活, 因此, 避免这些井中培养细胞是至关重要的。
尽管如此, 我们强大的技术提供了一种选择, 以一种易于使用的方式生成 3D microtissues, 这可能使3D 文化成为大多数实验室的共同的细胞操作方法, 以加速基础和平移科学进步.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金的资助 (赠款: 81522022, 51461165302)。作者想感谢所有杜实验室的成员提供一般的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | sigma | G7041 | All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated. |
| Glutaraldehyde | J&K | 902042 | Used as crosslinker in preparation of material. |
| Glass cover slip (24 x 50 mm) | CITOGLASS, China | 10212450C | To scrape prcursor solution onto microstencils array chips. |
| Sodium borohydride, NaBH4 | Beijing Chemical Works | 116-8 | To wash remaining glutaraldehyde away after gelation. |
| Vacuum jar | asperts, China | VC8130 | To preserve microgels under vacuum. |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets | Sunjin Electronics Co., Ltd, China | Ordinary PMMA sheets. | |
| Rayjet laser system | Rayjet, Australia | Rayjet 50 C30 | To engrave PMMA sheets to form wells. |
| Plasma Cleaner | Mycro Technologies, USA | PDC-32G | To make PMMA hyphophilic. |
| Lyophilizer | Boyikang, China | SC21CL | To lyophilize materials. |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Zhongkekeao, China | DA0065 | To dye microgels. |
| Doxorubicin hydrochloride | ENERGY CHEMICAL, China | A01E0801360010 | To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel. |
| Live/dead assay | Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) | CS01-10 | To distinguish alive and dead cells. |
| Cell Titer-Blue | Promega (Wisconsin, USA). | G8080 | To test cell viability. |
| Cell strainer | BD Biosciences, USA | 352360 | To collect microgels. |
| D-Luciferin | SYNCHEM (Germany) | s039 | To tack cells. |
| Scanning electron microscope | FEI, USA | Quanta 200 | To characterize microgel morphology. |
| Mechanical testing machine | Bose, USA | 3230 | To measure mechanical features. |
| Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | ALADINI 1000 | To test injactabiliy. |
| Digital force gauge | HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China | H-50 | To test injactabiliy. |
| Ethylene oxide sterilization system | Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC | AN74i | To sterilize microgels with ethylene oxide gas. |
| Microplate reader | Molecular Devices,USA | M5 | To measure fluorescence intensity in micro-array. |
| Confocal microscope | Nikon, Japan | A1Rsi | To observe cell distribution in 3D. |
| Xenogen Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences, USA | IVIS | To track cell in animals. |
| Liquid work stataion | Apricot design,USA | S-pipette | To load medium or cell suspension high-throuputly. |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
- Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179 (2013).
- Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
- Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
- Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
- Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
- Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
- Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
- Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
- Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
- Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141 (2012).
- Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
- He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
- Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
- Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
- Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
- Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
- Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
- Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
- Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
- Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
- Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
- Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
- Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
- Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
- Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581 (2016).
- Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
- Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
- Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
- Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
- Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
- Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
- Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
- Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
- Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
- Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
- Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
- Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
- Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
- Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056 (2013).
- Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).
