Summary
Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.
Abstract
Per aggiornare coltura cellulare 2D tradizionale a coltura cellulare 3D, abbiamo integrato microfabbricazione con tecnologia cryogelation per produrre macroporosa Microscala Criogel (microcryogels), che può essere caricato con una varietà di tipi di cellule per formare microtissues 3D. Qui, presentiamo il protocollo per fabbricare versatile microtissues 3D e loro applicazioni in terapia rigenerativa e lo screening di stupefacenti. Dimensione e forma-controllabile microcryogels può essere fabbricato in un chip di matrice, che può essere raccolto fuori del chip come singoli vettori cellulare-caricato per la terapia rigenerativa iniettabile o più ulteriormente essere assemblati su chip in matrici di microtessuti 3D per high-throughput screening di stupefacenti. A causa della natura elastica alta di questi Criogel su microscala, il microtissues 3D presentano ottima iniettabilità per terapia minimamente invasiva cellulare proteggendo le cellule dalla forza di taglio meccanico durante l'iniezione. In questo modo una maggiore sopravvivenza ed effetto terapeutico nel modello di ischemia dell'arto del mouse. Nel frattempo, montaggio di matrici di microtessuti 3D in un formato standard di 384-multi-bene facilita l'uso di comuni strutture di laboratorio e attrezzature, abilitazione high throughput screening su questa piattaforma di cultura cellulare 3D versatile di stupefacenti.
Introduction
Coltura cellulare tradizionale su superfici appiattite di (2D) bidimensionali, ad esempio una piastra di coltura o piastre multi-pozzetto, difficilmente può suscitare comportamenti delle cellule vicino ai loro Stati nativi. Accurata ricapitolazione dei microambienti cellulari nativi, che comprendono vari tipi di cellule, matrici extracellulari e fattori bioattivi solubile in tridimensionale (3D) architetture1,2,3 ,4, è essenziale per costruire biomimicking tessuti in vitro per applicazioni in medicina rigenerativa, ingegneria dei tessuti, biologia fondamentale ricerca e droga scoperta5,6,7 ,8,9.
Al posto di coltura cellulare 2D, coltura cellulare 3D è ampiamente usato per avanzare biomimetici micro-architettura e caratteristiche funzionali delle cellule coltivate in vitro. Un metodo di coltura popolare cellulare 3D è quello di cellule aggregate in sferoidi7,8,9,10. Sferoidi cellulare potrebbero essere iniettati a tessuti danneggiati con una maggiore ritenzione cellulare e la sopravvivenza rispetto ad iniezione di cellule disperse. Tuttavia, non uniforme sferoide dimensioni e inevitabile danno meccanico imposto sulle cellule con la forza di taglio fluido durante l'iniezione conducono al povero cella effetti terapeutici11,12,13. Allo stesso modo, l'intrinseca non-uniformità durante l'aggregazione di sferoidi ha reso loro traduzione al 3D basati su cellule high throughput screening di stupefacenti impegnativo10.
Un altro metodo per la coltura cellulare 3D è realizzato con l'assistenza dei biomateriali, che in genere incapsula le cellule in idrogel acquoso o scaffold porosi. Esso consente una maggiore flessibilità nella costruzione di architetture 3D. Per la terapia, cellule incapsulate in massa ponteggi vengono generalmente recapitate al corpo animale tramite impianto chirurgico, che è invasivo e traumatico, limitando quindi la traduzione ampia al capezzale. D'altra parte, idrogeli acquosi abilitare terapia minimamente invasiva iniettando le cellule sospese in soluzione di idrogel precursore nei corpi degli animali, permettendo la gelificazione in situ tramite termo-, reticolazione chimica o enzimatica11. Tuttavia, come le cellule vengono consegnate mentre i precursori di idrogel sono ancora in uno stato acquoso, essi sono anche esposti a cesoia meccanica durante l'iniezione. Non solo quindi, reticolazione chimica o enzimatica durante la gelificazione in situ di idrogel potrebbe anche imporre il danneggiamento delle cellule all'interno. Per lo screening di stupefacenti, colture cellulari di biomateriale-aiutato affrontano problemi con uniformità, la controllabilità e la velocità effettiva. Utilizzando idrogeli, cellule sono in genere coinvolti durante la gelificazione, da che il processo può colpire la funzione e la vitalità cellulare. Gelificazione durante la semina delle cellule ostacola anche l'utilizzo di maggior parte delle apparecchiature ad alta produttività, poiché potrebbe essere necessario essere tenuta su ghiaccio per evitare la gelificazione prima semina cellulare l'idrogel e l'idrogel potrebbe incepparsi punte di erogazione, che sono solitamente molto sottili per garantire la precisione per High throughput screening. Scaffold preformato potrebbe potenzialmente separare procedure di fabbricazione di biomateriale da coltura cellulare, tuttavia la maggior parte sono disponibili come materiali alla rinfusa con relativamente bassa velocità effettiva14prodotti basati sul patibolo.
Per superare alcune delle carenze degli attuali metodi di cultura 3D, abbiamo sviluppato una tecnologia di microfabbricazione-cryogelation integrato per fabbricare un chip di matrice standard e facile da usare microcryogel15. In questo protocollo, la gelatina è selezionata per esemplificare la tecnica di fabbricazione di microcryogel come è biocompatibile, biodegradabile e conveniente, e nessuna ulteriore modifica è necessaria per il collegamento delle cellule. Altri polimeri di fonti naturali o sintetici potrebbero essere utilizzati anche per la fabbricazione, a seconda dell'applicazione. Tramite questa tecnologia, possiamo fabbricare microcryogels miniaturizzati e altamente elastico con controllabile dimensioni, forma e disposizione. Quando caricato con una varietà di tipi cellulari, microtissues 3D potrebbe essere formata per varie applicazioni. Queste caratteristiche uniche permettono iniettabilità desiderata, protezione delle cellule e ritenzione sito diretta dopo iniezione in vivo per ottenere effetti terapeutici migliori. Non solo in questo modo il microcryogels potrebbe essere ulteriormente trattati per formare matrici di microtessuti 3D compatibili con comuni attrezzature di laboratorio e strumenti per realizzare la coltura delle cellule ad alta produttività per lo screening di stupefacenti versatile e altri test cellulari. Qui, ci faremo i dettagli il processo di fabbricazione di microcryogels e il suo post-trattamento come singoli microtissues 3D o 3D microtessuti matrici per due importanti applicazioni, terapia cellulare e lo screening di stupefacenti, rispettivamente10,15 .
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Protocol
esperimenti sugli animali seguito rigoroso protocollo approvato dal comitato di etica animale il centro di analisi biomedica, Università di Tsinghua. Sotto approvazione del comitato etico, tessuto adiposo umano è stato ottenuto dal dipartimento di chirurgia plastica di Peking Union Hospital con consenso informato dai pazienti.
1. fabbricazione di 3D Microcryogels
- progettazione e fabbricazione di chip array microstencil
- uso un software commerciale a matrici di progettazione di geometrie specifiche, quali cerchi, ellissi, triangoli o trifogli 14, a seconda della successiva applicazione.
Nota: Fare riferimento alla sezione 2 del protocollo per la medicina rigenerativa e, sezione 3, del protocollo per lo screening di stupefacenti per dettagli di design. - Importare il disegno per il laser incisione software che accompagna la macchina per incisione laser. Utilizzando le impostazioni di laser secondo le raccomandazioni di fabbrica per la macchina per incisione laser, incisione laser il disegno importato sulla Poly (methymethacrylate) (PMMA) fogli.
- Lavare i chip di matrice microstencil con acqua deionizzata per pulire i detriti da incisione laser. Secca la matrice microstencil chip a 60 ° C. conservare in un sacchetto sigillato a temperatura ambiente per mesi.
- uso un software commerciale a matrici di progettazione di geometrie specifiche, quali cerchi, ellissi, triangoli o trifogli 14, a seconda della successiva applicazione.
- Fabbricazione di chip array microcryogel
- microstencil Place 4 chip sul vassoio di campione di matrice e inserire nel plasma pulitore. Chiudere la porta del pulitore e accendere la pompa del vuoto per 2 min, quindi accendere la potenza RF massima (18 W) per trattare il chip array microstencil nel plasma pulitore per 3 min a temperatura ambiente per aumentare l'idrofilia.
- Aggiungi 0,06 g di gelatina per 1 mL di acqua deionizzata al modulo soluzione di precursore del gelatina 6% (wt/vol) (abbastanza per fare 5 fiches). Calda a 60 ° C in bagnomaria a sciogliere adeguatamente. Incubare in ghiaccio per 5 min.
- Add 3 µ l di glutaraldeide nella soluzione del precursore di gelatina a una concentrazione finale di 0.3%. Mescolare accuratamente.
- Pipetta 200 µ l di soluzione precursore con glutaraldeide sulla superficie superiore del chip array microstencil.
Nota: 200 µ l è sufficiente per un chip di 75 mm x 25 mm indipendentemente dal disegno. Aumentare la quantità proporzionalmente quando viene aumentata la superficie del chip. - Manualmente distribuire la soluzione uniformemente sopra il chip da raschiare indietro avanti e indietro con una bacchetta di vetro piegato 2 o 3 volte.
Nota: Ogni micro-pozzetto sul chip microstencil può essere riempito con soluzione di precursore a causa della loro natura idrofila dopo trattamento al plasma. - Collocare immediatamente il chip matrice precursore-soluzione-riempita in un congelatore a-20 ° C per 16 h per cryogelation.
- Regola i liofilizzatori a-40 ° C per 30 min. Posizionare il chip array dopo cryogelation nei liofilizzatori e lyophilize il chip array per 2 h in vuoto.
Nota: Microcryogels di gelatina con macropori interconnessi si formano perché il ghiaccio formatosi durante cryogelation sublimes nei liofilizzatori. - Procedere alla sezione 2 per il trattamento dell'ischemia critica dell'arto (CLI) e sezione 3 per lo screening di stupefacenti di alto-rendimento.
2. Raccolta individuale Microcryogels per Microtissues 3D forma iniettabile per il trattamento di CLI
- microcryogels individuale di raccolta
- Design matrici (75 mm x 25 mm) di 600 cerchi, ciascuno con 400 µm di diametro, in software commerciale per la costruzione di microtessuti 3D iniettabili. Utilizzare PMMA di 300 µm spessore per la fabbricazione di chip array microstencil come descritto in dettaglio nella sezione 1.1.
- Fabbricare chip array microcryogel come descritto in sezione 1.2.
- Fabbricare una matrice di PDMS estrattore con lo stesso design come passaggio 2.1.1 da litografia soft standard 16 , 17.
- Overlay il chip di matrice microcryogel sulla parte superiore della matrice di estrattore di PDMS, allineando ogni microcryogel con un estrattore sulla matrice. Premere il chip di matrice microcryogel verso la matrice di perno espulsore per spingere il microcryogels fuori i micropozzetti con i perni sporgenti sulla matrice PDMS eiettore pin per la raccolta individuale microcryogels.
- Raccolto il microcryogel nell'acqua e raccoglierli con l'ausilio di filtri a cella. Utilizzare un filtro per raccogliere microcryogels da un unico chip (cioè, 600 microcryogels).
- Microcryogels di lavaggio con 0,1 M NaBH 4 il ghiaccio per 20 min placare ogni residuo reticolato aldeide. Uso 5 mL di 0,1 M NaBH 4 per il circuito integrato. Scartare NaBH 4 e lavare con 5 mL di acqua deionizzata per 15 min 3 a 5 volte, ogni volta.
- Gettare l'acqua dal filtro cella e raccogliere microcryogels in un cluster per filtro cella e posizionare un cluster in una capsula di Petri 35 mm utilizzando una pinzetta curva. Aggiungere 50-70 µ l deionizzata acqua per ogni cluster e coprire il coperchio del piatto Petri. Picchiettare delicatamente la capsula di Petri sul tavolo per livellare tutti i microcryogels, così che nessun microcryogels sono sdraiata sopra un altro microcryogel per formare un monostrato di microcryogels sulla superficie del piatto Petri.
- Congelare il raccolto microcryogels a-20 ° C per 4-16 h prima li liofilizzazione per 2 h (Vedi punto 1.2.7). Conservare microcryogels in un vuoto a temperatura ambiente fino a ulteriore uso.
- Caratterizzazione di microcryogels
- valutare i pori della microcryogels tramite la scansione di formazione immagine di microscopia elettronica (SEM).
- Immobilizzare il microcryogels raccolto e liofilizzato sulla porta campione di nastro adesivo doppio-lato e cappotto con oro con un velo di polverizzazione per 90 s, prima di formazione immagine di SEM 11. Valutare e analizzare la distribuzione dei diametri dei pori in microcryogel da sette diverse immagini di SEM utilizzando software di analisi di immagine.
- Pesare un cluster di 600 microcryogels liofilizzato in una capsula Petri 35mm per il peso di gelatina secca microcryogels (GMs). Aggiungere 60 µ l deionizzata acqua al cluster di microcryogels liofilizzati e attendere 30 s per microcryogels completamente assorbire acqua e gonfiarsi. Pesare il microcryogels gonfie.
Rapporto gonfiore
- determinare l'equilibrio e la porosità del microcryogels, come il rapporto del peso di gonfio microcryogels a quella di gelatina secchi microcryogels e il rapporto del peso di acqua tenuta in microcryogels a quella di microcryogels idratata, rispettivamente 13.
- Iniettabilità di misura di microcryogels utilizzando una pompa a siringa programmabile integrata con una forza digitale calibro 14.
- Macchia 600 pezzi di microcryogels di Trypan blue e sospendere a 600 µ l 15% di soluzione di gelatina per ottenere una distribuzione omogenea. Caricare microcryogel 1 mL di sospensione in siringa da 1 mL. Iniettare la miscela attraverso un ago calibro 27 collegato alla siringa 1 mL utilizzando una pompa a siringa programmabile con portata di 1 mL/min
- Iniezione in tempo reale monitor forza con la forza digital gauge test e tracciare la curva forza-tempo. Dopo l'iniezione, osservare l'integrità del microcryogels sotto un microscopio.
Nota: GMs sospese in soluzione di gelatina del 15% (wt/vol) possono essere agevolmente iniettato e rimasto intatto dopo l'iniezione.
- Caratterizzano la degradabilità del microcryogels.
- In primo luogo, misurare il peso di un cluster di 600 microcryogels liofilizzato in una capsula Petri 35 mm come il peso a secco. Quindi, immergere 600 microcryogels liofilizzato in 2ml 0,025% (vol/vol) tripsina/EDTA.
- Raccolta microcryogels dalla soluzione utilizzando un colino di cella in diversi momenti (vale a dire, 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70 min). Stoppino via soluzione in eccesso con un fazzoletto. Misurare il peso di microcryogels in diversi momenti e calcolare il grado di degradazione, come il rapporto del peso di microcryogel ad un certo punto del tempo a quello di microcryogel all'istante zero.
- valutare i pori della microcryogels tramite la scansione di formazione immagine di microscopia elettronica (SEM).
- Autoloading delle cellule in microcryogels al modulo 3D microtissues
- microcryogels da passo 2.1.8 per sistema di sterilizzazione di ossido di etilene con l'esposizione di gas 12 h seguita da 12h degasaggio sotto vac di sterilizzareUUM.
- Scelgono adiposo-derivate cellule mesenchimali umane stromali (hMSCs) per il trattamento del hindlimb ischemico del mouse. Isolare cellule seguendo procedure come precedentemente segnalato 18. Supporto di
- cultura hMSCs nella crescita contenente 2% siero bovino fetale (FBS), 10 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF), 10 ng/mL bb fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-bb), 1 X selenio di insulina transferrina (ITS), 10 -8 M desametasone, 10 -4 M 2-fosfato dell'acido ascorbico, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina in DMEM/F12. Passaggio le cellule al rapporto di 1:3 quando confluenti. Utilizzare le celle di passaggio 3 di 5 nei seguenti esperimenti.
- Harvest hMSCs con tripsina e quantificare il numero di cellulare utilizzando una camera di conteggio di Fuchs-Rosenthal e risospendere ad una densità di 8 x 10 6 cellule/mL nel terreno di crescita hMSCs.
- Sospensione hMSCs di pipetta 60 µ l sul monostrato di 600 microcryogels con diametro di 400 µm in un piatto di 35 mm di sezione 2.1. Cellule sono automaticamente assorbite nel micro-strutture porose della microcryogels.
- Mantenere in una camera umidificata e incubare a 37 ° C per 2 h consentire alle cellule di allegare. Dopo 2 h di incubazione, aggiungere 2 mL terreno di coltura. Modificare il mezzo ogni 2 giorni. Cultura microcryogels hMSCs-caricato per 2 giorni formare 3D microtissues.
- Dopo 2 giorni di coltura, pipettare 100 microcryogels hMSCs-caricato per pozzetto su una piastra a 96 pozzetti, 120 µ l di soluzione di lavoro resazurin preparata secondo il produttore ' Istruzione s in ciascun pozzetto. Incubare per 2 ore a 37 ° C.
Fluorescenza
- rileva problemi di resazurin metabolizzato dalle cellule vitali in un lettore di micropiastre con una lunghezza d'onda luce di eccitazione di 560 nm ed emissione luce lunghezza d'onda di 590 nm. Stabilire una curva standard del numero di cell vs fluorescenza usando hMSCs per interpolare il numero di cellulare da intensità di fluorescenza per futuro esperimento secondo il protocollo di kit 13.
- Valutare il numero di hMSCs in microcryogels dal giorno 0 al giorno 4 utilizzando resazurin come descritto nel passo 2.3.7 dal giorno 0 al giorno 4.
- Macchia cellule in microcryogels con diluizione 1: 500 di calceina e diluizione di 1: 250 di ioduro di propidio (conosciuto come live/dead macchiatura) in tampone fosfato salino (PBS) e osservare al microscopio a fluorescenza o microscopio a fluorescenza confocale.
- Iniezione di microtissues 3D in vivo per il trattamento del CLI nel modello del topo
- stabilire ischemia critica hindlimb dei topi nudi femminili di BALB/c come segnalati 11 , 19 per determinare l'effetto terapeutico della terapia a base di microtessuti 3D.
- Trasferire la microtissues dal passaggio 2.3.6 utilizzando una pipetta 5 mL in un colino di cella e filtrare via coltura.
- Risospendere il microtissues 3D hMSCs-caricato in soluzione di gelatina di 15%, con una densità di 100 microcryogels a 100 µ l di soluzione.
- Prima di chirurgia, sterilizzare gli strumenti chirurgici in autoclave ed eseguire un intervento chirurgico in una sala operatoria animale in un centro animale.
- Posizionare il mouse nella camera di induzione di anestesia contenenti 1-3% isoflurane in 100% di ossigeno ad un flusso di 1 L/min eritromicina applica sugli occhi del mouse per evitare l'essiccazione. Attraverso un'incisione della pelle lunga 1 cm, legare l'arteria femorale e dei relativi rami con 5-10 punti di sutura seta ed accise 19.
- Inject indocianina verde (ICG) (0,1 mL di 100 µ g/mL) attraverso la vena caudale iniezione per monitorare il flusso di sangue. Eseguire imaging di fluorescenza di ICG utilizzando un sistema di formazione immagine di fluorescenza (qui, sistema artigianale) in riflettanza geometria 11.
- Iniettare per via intramuscolare microtissues in tre siti del muscolo gracilis attorno all'incisione dell'arteria usando una siringa da 1 mL con un ago di 23 gauge.
- Dopo la chirurgia, tenere il mouse caldo con un pad riscaldato nella gabbia recupero. Iniettare per via sottocutanea meloxicam per alleviare il dolore e monitorare continuamente fino a quando sveglio.
- Dopo 28 giorni, per monitorare l'efficacia terapeutica dell'arto trattato microtessuti 3D fluorescenza imaging 11.
Nota: Iniettare per via sottocutanea meloxicam per alleviare il dolore quando il mouse ha mostrato amputazione spontanea. - Euthanize topi con anidride carbonica dopo il completamento degli esperimenti.
Nota: Qui, l'eutanasia con l'anidride carbonica è stata eseguita secondo un rigido protocollo approvato dal comitato di etica animale il centro di analisi biomedica, Università di Tsinghua.
3. Assemblea di microtessuti Chip Array per droga di High-throughput Screening
- assemblaggio della matrice di microcryogel per la coltura cellulare su chip
- modifica la struttura nella sezione 1.1 secondo dimensioni piastre multi-pozzetto convenzionali, cioè, per formato 384-multi-pozzo, progettare una matrice di 16 × 24 pozzetti (riga di colonna), ciascuno di 2 mm di diametro e 4,5 mm di distanza centro--centro.
- Laser incide su una lastra di PMMA spessore 500 µm, come descritto nella sezione 1.1. Microcryogels
- fabbrichi come descritto in sezione 1.2 utilizzando da che il chip di matrice 384-multi-bene ottenuto punto 3.1.2. Questa matrice contenenti microcryogel è designata come il chip di matrice microcryogel.
- Lavare il chip di matrice microcryogel con 50 mL 0,1 M NaBH 4 per placare qualsiasi aldeide residuo reticolato, quindi sciacquare ripetutamente con 50 mL di acqua deionizzata per 3 volte, 2 h ogni volta.
- Gettare l'acqua, congelare il chip di matrice microcryogel a-20 ° C per 4-16 h prima liofilizzazione secondo punto 1.2.7.
- Design di array modifica 384-multi-pozzo al punto 3.1.1 per contenere 16 × 24 pozzetti, ciascuna della spaziatura di 3 mm di diametro e 4,5 mm da centro a centro.
- Rimuovere un lato del supporto da un foglio di ultra-sottile (10 µm) biocompatibili doppio nastro biadesivo e incollarlo su un lato di un pezzo di foglio di PMMA spessore 3 mm. Laser incide il disegno dal punto 3.1.4 su questo strato di PMMA spessore mm 3 conformemente al punto 1.1. Questa matrice viene designata come la matrice serbatoio.
- Allinea la matrice microcryogel chip con il chip di matrice serbatoio e aderire insieme strettamente per assemblare il chip di matrice 3D microcryogel per la coltura delle cellule su chip. Sterilizzi con radiazione ultravioletta per 1 h.
- Matrice 3D microcryogel store scheggia nel vuoto a temperatura ambiente per ulteriori esperimenti.
- Drug screening 3D microtessuti matrici
- riempire una casella bagnata con 25 mL di acqua deionizzata sterile per servire come una camera umida per la coltura cellulare. Pre-riscaldare in un umidificata 5% CO 2 incubatore a 37 ° C.
- Raccolta di cellule di cancro del polmone non a piccole cellule (NCI-H460) e cellule di carcinoma epatocellulare (HepG2) dalle piastre di coltura del tessuto secondo protocollo standard e risospendere in terreni di coltura ad una densità finale di 1.0 x 10 6 cellule/mL. Mescolare accuratamente.
Nota: RPM1640 con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina viene utilizzato per NCI-H460. Utilizzare DMEM con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina per HepG2. - Rimuovere la camera di umidità da incubatrice. Utilizzare una pinzetta per attentamente posto il 3D assemblato microcryogel chip array dal punto 3.1.9 in camera umidostatica. Fare attenzione di non bagnare la microcryogels con acqua nella camera di.
- Mescolare la sospensione cellulare accuratamente, quindi aliquota 3 µ l di sospensione cellulare direttamente sul microcryogel in ciascun pozzetto.
Nota: La punta della pipetta deve toccare leggermente la superficie della microcryogel prima di espellere la sospensione cellulare. Le cellule sono auto-caricato in microcryogel di assorbimento. Non effettuare il seeding cellule nei pozzetti periferici. - Aggiungere 10 μL di media in ciascun pozzetto dopo che le cellule sono seminate in microcryogel utilizzando la pipetta multicanale, ad esempio un gestore di liquido 96 canali. Medio è anche aggiunto ai pozzetti periferici.
Nota: Uso RPM1640 media con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL streptomycin per le cellule H460. Utilizzare supporti DMEM con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 100 µ g/mL per le cellule di HepaG2. - Cultura la matrice cellulare-caricato microcryogel chip in camera umidostatica per 24 h in un umidificata 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per matrice di microtessuti 3D form.
- Sciogliere doxorubicina e IMMLG-8439 9 a solfossido dimetilico (DMSO) per formare una soluzione stock di 10 mM. Diluire farmaci con terreno di coltura per formare un gradiente di concentrazione di 10 volte diluizione da 2 nM a 200 µM. Beh
- aggiungere 10 µ l delle soluzioni di droga in ciascuno. Utilizzare 0,1% DMSO (diluito in mezzo) come controllo. Incubare la matrice di microtessuti 3D caricati di droga in un umidificata 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per 24 h.
- Aggiungere 4 µ l di soluzione di riserva di resazurin in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C per la matrice di 2 h. posto il 3D microtessuti nel lettore di micropiastre e rilevare la fluorescenza di resazurin metabolizzato dalle cellule vitali ad una lunghezza d'onda luce di eccitazione di 560 nm ed emissione luce lunghezza d'onda di 590 nm.
- Sottrarre il segnale di linea di base di resazurin da tutti i pozzetti prima di ulteriore elaborazione dei dati. Calcolare la frazione di attuabilità delle cellule di ciascun pozzetto dividendo il segnale di fluorescenza dal segnale di fluorescenza media nei pozzetti di controllo.
- Tracciare la curva dose-risposta nel software di tracciato con la frazione di attuabilità delle cellule come l'asse y e il logaritmo in base 10 della concentrazione di farmaco come l'asse x. Interpolare la concentrazione di inibizione di 50% (IC50) presso la frazione di attuabilità delle cellule di 0,5.
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Representative Results
Fabbricazione e caratterizzazione di microcryogels per la formazione di microtessuti 3D.
Secondo questo protocollo, microcryogels sono stati fabbricati a forma il 3D microtissues e microcryogels individuali o matrici di microcryogel e sono state applicate alla terapia rigenerativa e, rispettivamente di screening di stupefacenti (Figura 1). Microstencil chip array fabbricato da PMMA sono stati applicati come micromolds per i chip array microcryogel. Disegno geometrico variabile potrebbe essere preparati per il chip di matrice microstencil. Abbiamo scelto un rappresentante 45 x 14 mm microstencil matrice chip come un esempio, che conteneva varie forme (cioè, cerchio, ellisse, triangolo e trifoglio) e un chip di matrice microstencil a forma di cerchio con diverse dimensioni (diametri = 100, 200, 400 e 800 µ m). per migliorare la visibilità del micromolds sui chip matrice, immagini epi-illuminazione luce sono stati osservati (Figura 2A, B). Microcryogels raccolte dal chip array ha esibito desiderate forme e dimensioni (Figura 2, D). Tali microcryogels con caratteristiche geometriche desiderate possibilmente potrebbe essere applicato come modelli per formare unità cellulari differenti che imitano alcune architetture dei tessuti nativi. Il raccolto GMs (gelatina microcryogels) aveva forme pre-definite e dimensioni (Figura 3A). Osservazione di SEM ha dimostrato che microcryogels contenuto macroporosa interconnessi strutture con dimensioni dei pori nel range di 30-80 µm (Figura 3B).
Iniettabilità avanzata di microtissues hMSCs-caricato per salvataggio dell'arto ischemico migliorata
Utilizzando la pompa a siringa programmabile integrato con un vigore digitale calibro14, iniettabilità di GMs è stata valutata quantitativamente. Ad una portata di 1 mL/min, il GMs con una densità di 1.000 microcryogels / mL sono stato iniettato sotto i 6 anni N, che era più bassa rispetto alla forza clinicamente accettabile di 10 N20 (Figura 3F). Basando sulla protezione cellulare abilitata da GMs, hMSCs in GMs ha avuto alta attuabilità e mantenuto grande capacità proliferativa dopo iniezione durante i 5 giorni di cultura (Figura 3 H).
Il modello di ischemia dell'arto del mouse è stato scelto per valutare l'efficacia terapeutica dell'iniettabili hMSC-caricato microtissues. Lo stato fisiologico delle arti ischemici è stato esaminato 28 giorni dopo l'intervento chirurgico (Figura 4A). Nessun salvataggio dell'arto è stata osservata nel gruppo finto o nel gruppo di controllo di GMs. Nel gruppo di trattamento di 105 cella libera, amputazione della punta totale 50%, 25% punta parziale amputazione e amputazione parziale di 25% sono state osservate entro 7 giorni, con conseguente perdita del membro di 80% e amputazione della punta totale 20% dopo 28 giorni. Al contrario, il trattamento microtissues con 105 hMSCs realizzato salvataggio dell'arto migliorata (75%) con solo 25% topi hanno mostrato amputazione della punta spontanea dopo 28 giorni. 106 hMSCs, il numero di cella effettivo minimo utilizzato nella maggior parte degli studi precedente, è stato scelto come il controllo positivo21. Solo 2 dei 4 topi ha mostrato il salvataggio dell'arto, ma tutti avevano minore necrosi.
Aspersione di sangue era monitorato e valutato a favore del verde indocianina (ICG), un agente di contrasto angiografico approvato dalla FDA. Il risultato ha mostrato che segnali di fluorescenza è apparso nei topi trattati con microtessuti e nei 106 gratis hMSCs-trattati topi. Non ci è segnale di fluorescenza evidente nelle zampe posteriori ischemico nella farsa o gruppo GM fino al giorno 28 (Figura 4B).
Questi risultati ha ulteriormente confermato che la terapia 3D assistita microtessuti hMSCs realizzato superiori effetti terapeutici per il trattamento di CLI che rappresenta il minimo dosaggio efficace per la terapia cellulare nel modello murino finora.
Screening di citotossicità di farmaci ad alta velocità su chip array microtessuti 3D
Una matrice di microcryogel 3D ready-to-use per la coltura cellulare su chip potrebbe essere fabbricata facilmente mantenendo microcryogels sul chip PMMA dopo liofilizzazione e combinando con il chip di pozzo-matrice corrispondente con nastri adesivi biocompatibili (Figura 1 e Figura 5A). In questa matrice di cultura cellulare in due parti, il chip di pozzo-matrice superiore servita come serbatoi per il terreno di coltura, soluzioni di droga e reagenti, mentre le cellule sono state coltivate nel microcryogel 3D immobilizzato sul chip della matrice di fondo. I nastri adesivi tra il chip di matrice superiore e inferiore permesso generazione di 384 pozzetti singoli per la coltura cellulare 3D ad alta velocità (figura 5B), fornendo in tal modo uno strumento pratico per la scoperta di nuovi farmaci.
Come descritto nel protocollo, 3D microtessuti matrice era formata da seminare direttamente le cellule nella microcryogels prima di aggiungere il supporto ai serbatoi. Utilizzando cellule RFP-etichetta NIH-3T3, abbiamo dimostrato che le cellule sono state distribuite uniformemente con multi-strati all'interno dell'architettura 3D di microcryogels (Figura 5, D). Immagini al SEM ha mostrato che le cellule attenuti alle pareti dei pori e persino esibito filopodi estesa lungo o attraverso pareti adiacenti di macropori in microcryogels (Figura 5E).
Abbiamo poi mostrato la fattibilità dell'applicazione di questa matrice di microtessuti 3D per high throughput test utilizzando due linee cellulari di cancro e due composti anti-droga. Cellule di carcinoma epatocellulare (HepG2) sono state trattate con doxorubicina, mentre le cellule tumorali del polmone non a piccole cellule (NCI-H460) sono state trattate con IMMLG-8439, un nuovo inibitore del tumore. Cinque-nove discrete concentrazioni di ogni droga sono state amministrate ai sei pozzetti adiacenti come repliche, con 0,1% DMSO in terreno di coltura come controllo negativo. Un'analisi di citotossicità è stata eseguita allo stesso modo per le cellule coltivate in piastre multi-pozzetto 2D tradizionale. Dopo 24 h di incubazione, l'analisi di attuabilità delle cellule è stata usata per valutare le risposte di droga delle cellule in sia in 2D che in 3D. Curve di risposta della droga sono state tracciate utilizzando tassi di attuabilità delle cellule normalizzato alle concentrazioni farmacologiche diverse, e il IC50 quindi è stato interpolato da queste curve. Un più alto valore di IC50 indicherebbe che le cellule sono più resistenti ai farmaci. Figura 5F e 5I, abbiamo osservato un aumento significativo nella resistenza ai farmaci quando le cellule sono state coltivate su matrice di microtessuti 3D che in 2D. Il IC50 di doxorubicina contro cellule HepG2 raggiunto 165.959 µM, relativo 18.239 nM su 2D; Il IC50 di IMMLG-8439 sulle cellule NCI-H460 allo stesso modo è stato elevato a 331.894 nM in 3D pur richiedendo solo 1.294 nM il 2D. Tale osservazione era in concordanza con i rapporti di farmacoresistenza aumentata in 3D cultura cultura 2D da altri ricercatori22,23.
Abbiamo attribuito tale aumento nella resistenza ai farmaci per la complessità del microambiente 3D rispetto allaconfigurazione planare della cultura 2D. Immagini al SEM ha rivelato che le cellule HepG2 riunivano come sferoidi decorare le superfici di macropori nella microcryogel. Queste cellule sono strettamente raggruppate e tale interazione cellula-cellula rafforzata potrebbe essere una fonte di farmacoresistenza in HepG222. E ' stato anche interessante notare che questi gruppi di cellule non erano sferoidi liberamente sospesi come hanno mantenuto ancora qualche adesione alla matrice (Figura 5, H). Al contrario, epiteliale-mesenchymal-transizione (EMT) è stato speculato che si sono verificati quando le cellule di cancro del polmone non a piccole, NCI-H460, sono state coltivate su microcryogels 3D. NCJ-H460 cellule sparse come fibroblasti (Figura 5J, K) invece di clustering come HepG2. Quindi, abbiamo speculato che l'aumento nella resistenza ai farmaci potrebbe essere un risultato da una transizione delle cellule epiteliali di NCI-H460 a un più maligno stato18,19,20,21,22 ,23.
Figura 1 : Schematico di microtessuti 3D fabbricazione e applicazione nella terapia rigenerativa e lo Screening di stupefacenti. Brevemente, chip di dimensioni e forma-controllabile microcryogel fu fabbricata in un chip di PMMA di matrice da cryogelation di gelatina. Il chip di microcryogel può essere raccolto off-chip come singoli microcryogels e microcryogels più ulteriormente, individuali può essere caricato automaticamente con le cellule e coltivate per formare microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile. Un'altra applicazione di microcryogel chip è da montare con un chip di matrice del serbatoio e quindi ulteriormente, celle di carico e cultura in matrici di microtessuti 3D per lo screening di stupefacenti di alto-rendimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2:Microstencil Array scheggia. (A, B) Fotografie di due chip di microstencil PMMA contenente schierati micropozzetti con forme diverse (cioè, cerchio, ellisse, triangolo e trifoglio) e di forma circolare con differenti dimensioni (diametro: 100, 200, 400 e 800 µm), rispettivamente (A), e due chip corrispondente (B) della matrice di microcryogel. (C, D) Immagini microscopiche del microcryogels individuali raccolte dal chip array di due microcryogels. Barra della scala = 500 µm. Questa figura è stata modificata con il permesso di riferimento14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Caratterizzazione di 3D iniettabili Microtissues. (A) fotografie di microcryogels raccolto. (B) Scanning electron microfotografia (SEM) immagini di microcryogels risultati interconnessi e strutture macroporosa. (C, D) Fluorescenza microscopica e 3D ricostruite immagini confocal di hMSCs-caricato microtissues macchiato da live/dead e rodamina falloidina. (E) quantificazione delle hMSCs autocaricamento e proliferazione in GMs con densità di carico iniziale diversa. Forza (F) iniezione in tempo reale le curve di misurazione per triple iniezioni di 1.000 GMs in 1 mL di soluzione di gelatina di 15% (wt/vol) ad 1 mL/min velocità di iniezione (1.000-1-15%). (G) Live/dead cell analisi di attuabilità delle hMSCs-caricato microtissues pre- iniezione e post-iniezione. (H) proliferazione delle hMSCs caricato in post-iniezione GMs dopo 1, 3 e 5 giorni di cultura (n = 3). * p < 0,05, One-way ANOVA rispetto al giorno 1. I dati sono presentati come media ± SEM Questa figura è stata modificata con il permesso di riferimento11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4:migliorato salvataggio e potenziato l'angiogenesi in ischemici posteriori trattati con 3D iniettabili Microtissues. (A) fotografie rappresentative di sham (n = 4), microcryogels in bianco (n = 4), gratis hMSCs (105) (n = 8), hMSCs (105)-caricato microtissues (n = 8) e gratuito hMSCs (106) (n = 4) a 0, 3, 7 e 28 giorni dopo il trattamento. (B) fluorescenza immagini ottenute 100 s dopo l'iniezione di ICG il giorno 28. Questa figura è stata modificata con il permesso di riferimento11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : 3D microtessuti Array per lo Screening di stupefacenti di High-throughput. Fotografia (A) della matrice di microtessuti 3D in formato 384-multi-bene dopo il montaggio e (B) analisi di attuabilità delle cellule resazurin eseguita sulla matrice. Cellule 3T3-RFP (C) all'interno di microcryogel post-semina (barra della scala = 200 µm). (D) ricostruzione 3D dei nuclei colorazione raffigurante la distribuzione omogenea delle cellule a multi-strati in microcryogel. (E) Scanning electron microfotografia immagine delle cellule 3T3-RFP diffondere ampiamente il macroporosa pareti in microcryogels (barra della scala = 20 µm). Test di citotossicità della doxorubicina (F) su cellule HepG2 e (mi) IMMLG-8439 il NCI-H460 cellule nella matrice 3D microtessuti risultati aumentato IC50 confronto alle loro controparti 2D. I dati sono mostrati come media ± piccole sferoidi SD. (G) delle cellule HepG2 in microcryogel (barra della scala = 100 µm), con aderenza parziale (asterischi in H) sulla parete microcryogel (barra della scala = 20 µm). (J) NCI-H460 cellule aderito e diffusione all'interno del microcryogel (barra della scala = 100 µm). (K) NCI-H460 cellule espositrici fibroblastic morfologia (barra della scala = 20 µm). Questa figura è stata modificata con il permesso di riferimento9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Rigenerativi modelli medicina e in vitro per lo screening di stupefacenti sono due importanti applicazioni per tessuto ingegneria5,6,7,8,9. Mentre queste due applicazioni hanno esigenze molto diverse, un terreno comune tra di loro si trova nella necessità di un più biomimetici coltura condizione per migliorare la cellula funzioni19. Solo con le funzioni delle cellule migliorata nella ricerca noi possiamo trattare malattie meglio20,21, e se cellule coltivate riflettono più accuratamente le risposte farmacologiche possiamo accelerare il drug discovery6,7. La sopravvivenza delle cellule dopo attecchimento in vivo è un requisito fondamentale per la medicina rigenerativa, mentre velocità effettiva è importante per lo screening di stupefacenti per gestire migliaia di composti in una sola volta. Questi due requisiti sono specifici per le loro rispettive applicazioni, e raramente una tecnologia può soddisfare entrambi i requisiti. Così, in modo univoco abbiamo integrato tecnologia microfabbricazione con cryogel preparazione per produrre macroporosa microcryogels, che potrebbe essere raccolto fuori del chip come singoli vettori cellulare-caricato per la terapia rigenerativa, oppure conservati su chip per ulteriori assemblaggio in matrice per lo screening di stupefacenti di alto-rendimento. La microscala e macroporosità di questi microcryogels romanzo consentono automatico e caricamento delle cellule da semplice assorbimento omogeneo. Utilizzando il romanzo microstencil fabbricazione di chip array microcryogel, centinaia e migliaia di Microscala Criogel con caratteristiche geometriche uniforme e riproducibile potrebbe essere facilmente ed efficientemente generata. Il microcryogels potrebbe essere preparati e conservati da sottovuoto come un prodotto standard, ready-to-use per agevolare la preparazione degli microtissues 3D in comune con laboratori per le applicazioni successive. Utilizzando questa tecnica di fabbricazione, siamo stati in grado di soddisfare sia il terreno comune (condizione di cultura 3D per meglio biomimicry) e specifici per le due diverse applicazioni (elasticità per proteggere le cellule durante l'iniezione per la medicina rigenerativa e alto-rendimento in un formato di matrice per lo screening di stupefacenti).
Terapia cellulare tiene la grande promessa per la riparazione di vari tessuti danneggiati o organi24. Tuttavia, la conservazione delle cellule, la sopravvivenza delle cellule e riproducibilità del trattamento sono ancora poveri a causa di danni meccanici durante l'iniezione, elevata dispersione ai tessuti circostanti e l'ischemia e l'infiammazione nell'ambiente in vivo all'interno della lesione tessuti25. Alcuni ricercatori hanno usato preformati aggregati cellulari per migliorare iniezione cella libera. Tuttavia, richiede una grande quantità di cellule a formare aggregati di cellule, che conduce ad alto costo, le dimensioni non uniforme e incontrollabile numeri complessivi26. Inoltre, il danno meccanico e morte delle cellule sono ancora inevitabili durante l'iniezione. In alternativa, terapia assistita biomateriale cellulare è stata sviluppata in cui reattivi biomateriali (ad es., termica o pH sensibili idrogel) possono essere miscelati con le cellule e gelificazione in situ per rendersi conto delle cellule ritenzione27. Tuttavia, in situ reticolato biomateriali non consentono adescamento di cellule in vitro e risultato in esposizione immediata delle cellule di un microambiente ischemico ed infiammatorio al luogo della lesione. È urgente per risolvere questi problemi per migliorare l'efficienza del trattamento. Un vantaggio importante di microcryogels fabbricato utilizzando questo protocollo è loro iniettabilità desiderata a causa loro dimensioni miniaturizzate e un'eccezionale elasticità, facilitare la loro applicazione nella consegna delle cellule. L'iniettabilità di microcryogels consente la protezione delle cellule durante la consegna delle cellule, quindi potrebbe essere costituite in 3D microtissues iniettabili dopo l'innesco in vitro delle cellule in microcryogel per migliorare le proteine della matrice extracellulare (ECM) deposizione, nonché interazioni cellula-cellula. Il 3D microtissues iniettabili provocare Microscala tessuto-come ensemble che rappresenta una strategia di consegna ottimale per facilitare la protezione delle cellule, attecchimento, sopravvivenza e quindi migliorare gli effetti terapeutici ultimati al luogo della lesione.
Oltre ad avanzati effetti terapeutici per la terapia cellulare, i nostri risultati erano anche indicativi dell'impatto complesso del microambiente 3D sulle risposte cellulari droga. Utilizzando condizioni di coltura biomimicking, sarebbe possibile ottenere in vitro cellular droga risposte più rappresentative di in vivo le risposte, quindi accelerando droga scoperta6,7, 28. Sferoidi sono popolare scelta della configurazione di cultura cellulare 3D e molte tecniche sono state sviluppate per assistere i ricercatori generano sferoidi. Coltura del tessuto basso-adesivo piastre29 o piastra superfici che vengono modificate con nano-impressioni8 erano usate anche per costringere le cellule da aggregare impedendo l'adesione cellula-matrice. Mentre queste tecniche sono relativamente semplici da usare, problemi quali perdita di sferoidi durante il cambio medio e altre operazioni come pure la variabilità di dimensione di sferoidi sono problemi che ostacolano l'adozione su vasta scala di tale tecnologia6. Sferoidi più omogenee potrebbero essere formate usando sospensione goccia30,31,32,33, tuttavia è alta intensità di manodopera se non utilizzando specializzata piastre. Utilizzando specializzata appeso goccia piastre multi-pozzetto e l'integrazione con automatizzato di liquid handling systems6,31, high throughput screening potrebbe essere realizzato. Lo svantaggio più grande della cultura sferoide è la mancanza di ECM, che è stato identificato a svolgono un ruolo fondamentale in tutte le fisiologiche e patologiche del tessuto sviluppi34. Uno studio di modello del cervello ha rivelato che sferoidi coltivate all'interno di un'impalcatura di ECM, rispetto al Puri sferoidi, avevano aumentato la resistenza ai farmaci, enhanced acidosi a causa della maggiore produzione di lattato e migliorato l'angiogenesi con l'aumento dell'espressione dei relativi fattori34. Altri studi hanno anche dimostrato che la presenza della matrice potrebbe fornire mechano-segnalazione necessarie per promuovere la ricapitolazione EMT e supporta funzionalità di tumore ad esempio di invasione e metastasi3,35,36 , 37.
Con la crescente comprensione dell'importanza dell'ECM in sviluppo patologico, non c'è dubbio che incorporare ECM in metodi di coltura 3D potrebbe contribuire a imitare in vivo situazioni meglio6. Idrogeli di materiali naturali o sintetici sono stati applicati per generare diversi in vitro del tumore 3D modelli per la valutazione di chemioterapici per la loro flessibilità e controllabilità delle proprietà biofisiche (quali rigidità)38 , 39 , 40 , 41 , 42. mentre gli idrogel con proprietà biofisiche sintonizzabile avevano modellato infatti importanti caratteristiche biologiche delle cellule del tumore per facilitare più accurati screening di stupefacenti, diversi svantaggi di questo metodo hanno ostacolato il suo uso diffuso in droga screening. Reticolazione di polimeri in presenza di cellule è necessario incapsulare le cellule all'interno della matrice di idrogel, che potrebbe potenzialmente danneggiare le cellule. Non solo quindi, idrogeli di diverse proprietà biofisiche presentano diverse sfide per cellule incapsulate all'interno. In morbidi idrogeli, elevato contenuto di acqua potrebbe sostenere la crescita delle cellule ma tali idrogeli si degradano rapidamente, dando sostegno a breve termine per la coltura cellulare 3D. D'altra parte, più rigido idrogel con alta reticolazione potrebbe rallentare di degrado ma basso contenuto d'acqua non potrebbe sostenere la crescita delle cellule e crosslinker alta concentrazione solitamente induce ad alta cytotoxicity43,44. Non solo quindi, preparazione di colture cellulari 3D con idrogeli è laborioso e non è compatibile con la maggior parte alto-rendimento liquido, sistemi di movimentazione come controllo della temperatura della soluzione di precursore di idrogel è importante e jamming di sottili punte di erogazione potrebbe comportare da gelificazione di idrogel entro le punte. Questi svantaggi hanno spinto così la ricerca di alternative ECM surrogati, cioè, basato su impalcatura ECM34.
Utilizzando ponteggi pre-formate, cellule potrebbero essere esentate dal processo di fabbricazione di biomateriale e quindi prevedono la possibilità per più controllo sulla fabbricazione di impalcatura come condizioni più severe potrebbero essere usate senza timore di danneggiare le cellule. Diversi studi hanno dimostrato che le cellule tumorali coltivate in impalcature 3D display superiore resistenza ai farmaci rispetto alle cellule coltivate in 2D a causa di aumentata malignità e avanzata cella-ECM interazione45,46, 47. tali osservazioni sono coerenti con i nostri risultati qui presentati. Nei nostri altri lavori, abbiamo ulteriormente dimostrato la versatilità della matrice 3D microtessuti e suoi vantaggi rispetto ad altre tecniche di cui sopra. In un recente lavoro, siamo stati in grado di migliorare la funzione epatica promuovendo il fenotipo epiteliale delle cellule HepaRG da coltura su una matrice di microtessuti 3D e tale matrice è stato applicato alla droga epatotossicità valutazione47. A causa della uniformità delle dimensioni dei pori all'interno di impalcature 3D macroporoso, siamo in grado di controllare la dimensione delle sferoidi delle cellule di fegato a cadere entro 50-80 µm, indipendentemente dalla densità cellulare-seeding iniziale. Ciò fornisce un vantaggio significativo rispetto gratis-formare sferoidi con dimensioni non uniforme. Non solo fanno sferoidi crescere uniformemente all'interno di ogni impalcatura, cellule tra pozzi anche uniformemente sono seminate, dando il coefficiente di variazione (CV) comparabili con le cellule di semina in 2D (cioè, CV = 0.09 in 3D microtessuti matrice e CV = 0.05 in 2D piastra commerciale ; dati non mostrati). In un altro lavoro, abbiamo dimostrato che siamo stati in grado di formare microtumor del fegato sulla matrice 3D microtessuti ricapitolare interazioni tumore-stroma per lo screening di terapia combinatoria riprogrammato lo stroma48. Microtumors del fegato sono stati generati da co-coltura a lungo termine (5 giorni) dei fibroblasti con le cellule tumorali ad alta densità. Abbiamo osservato le barriere verso la diffusione della droga a causa della cellula compatta e struttura di ECM formata nella microtumor del fegato, che allo stesso modo è stata osservata in vivo32. Usando le cellule tumorali con etichetta luciferase e cellule stromali meccanicamente-innescato, combinate con luminescenza di luciferina come la lettura specifica per le cellule tumorali, high throughput screening di nuovi agenti terapeutici o combinazioni contro tumore-stroma l'interazione è resa possibile.
Nonostante i molti vantaggi unici della nostra tecnica, un inconveniente di microcryogels corrente è non-trasparenza, ostacolando dettagliate osservazione ottica delle cellule in microcryogels. Ulteriori miglioramenti per queste microcryogels includerebbe fine-tuning loro proprietà ottiche per migliorare l'imaging delle cellule in microcryogels per l'osservazione. Inoltre, importante proprietà biofisiche quali rigidità non sono state esplorate nella nostra tecnica, che dovrà essere affrontata se vogliamo imitare meglio tessuti fisiologici e patologici di diverse proprietà biofisiche.
Mentre la nostra tecnica consente una semplice generazione di microtissues 3D, alcune precauzioni devono essere presi per esperimenti di successo. Quando fabbrica 3D microcryogels il chip array microstencil, è importante assicurare che il microcryogels rimanere congelati quando sono immessi nei liofilizzatori. Quindi è essenziale per pre-raffreddare la liofilizzatori e trasferire microcryogels dal congelatore a-20 ° C per i liofilizzatori rapidamente. Lo scioglimento dei microcryogels prima liofilizzazione o durante la liofilizzazione causerà pori al collasso e quindi influenzare la porosità del microcryogels fabbricato. Quando la coltura microtissues 3D nel formato matrice, attenzione è necessaria per garantire che l'adesività tra due matrici è sufficiente per evitare la contaminazione incrociata tra pozzetti. Inoltre, mentre miniaturizzazione coltura cellulare ha il suo vantaggio ad aumentare la produttività e riducendo il consumo di reagente, il suo svantaggio è che il volume di cultura bassa non supporta coltura cellulare a lungo termine senza rifornimento di mezzi frequenti. Non solo quindi, è fondamentale per mantenere l'umidità dell'ambiente cultura per prevenire influenza sull'attuabilità delle cellule a causa dell'evaporazione media, poiché solo pochi microlitri di sospensione cellulare o media è aggiunto. Evaporazione influirà anche la vitalità delle cellule nei pozzetti periferici, quindi è fondamentale per evitare la coltura delle cellule in questi pozzi.
Ciò nonostante, la nostra tecnica robusta fornisce un'opzione per generare microtissues 3D in un modo facile da usare, che potrebbe potenzialmente fare cultura 3D un metodo di manipolazione cellulare comune per la maggior parte dei laboratori, per accelerare la scienza di base e traslazionale avanzamenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni: 81522022, 51461165302). Gli autori si desidera ringraziare tutti i membri del laboratorio di Du per l'assistenza necessaria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | sigma | G7041 | All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated. |
| Glutaraldehyde | J&K | 902042 | Used as crosslinker in preparation of material. |
| Glass cover slip (24 x 50 mm) | CITOGLASS, China | 10212450C | To scrape prcursor solution onto microstencils array chips. |
| Sodium borohydride, NaBH4 | Beijing Chemical Works | 116-8 | To wash remaining glutaraldehyde away after gelation. |
| Vacuum jar | asperts, China | VC8130 | To preserve microgels under vacuum. |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets | Sunjin Electronics Co., Ltd, China | Ordinary PMMA sheets. | |
| Rayjet laser system | Rayjet, Australia | Rayjet 50 C30 | To engrave PMMA sheets to form wells. |
| Plasma Cleaner | Mycro Technologies, USA | PDC-32G | To make PMMA hyphophilic. |
| Lyophilizer | Boyikang, China | SC21CL | To lyophilize materials. |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Zhongkekeao, China | DA0065 | To dye microgels. |
| Doxorubicin hydrochloride | ENERGY CHEMICAL, China | A01E0801360010 | To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel. |
| Live/dead assay | Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) | CS01-10 | To distinguish alive and dead cells. |
| Cell Titer-Blue | Promega (Wisconsin, USA). | G8080 | To test cell viability. |
| Cell strainer | BD Biosciences, USA | 352360 | To collect microgels. |
| D-Luciferin | SYNCHEM (Germany) | s039 | To tack cells. |
| Scanning electron microscope | FEI, USA | Quanta 200 | To characterize microgel morphology. |
| Mechanical testing machine | Bose, USA | 3230 | To measure mechanical features. |
| Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | ALADINI 1000 | To test injactabiliy. |
| Digital force gauge | HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China | H-50 | To test injactabiliy. |
| Ethylene oxide sterilization system | Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC | AN74i | To sterilize microgels with ethylene oxide gas. |
| Microplate reader | Molecular Devices,USA | M5 | To measure fluorescence intensity in micro-array. |
| Confocal microscope | Nikon, Japan | A1Rsi | To observe cell distribution in 3D. |
| Xenogen Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences, USA | IVIS | To track cell in animals. |
| Liquid work stataion | Apricot design,USA | S-pipette | To load medium or cell suspension high-throuputly. |
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