Summary
Denne protokollen beskriver omprogrammering av primære amniotic væske og membran mesenchymal stamceller til indusert pluripotent stamceller med en ikke-integrere episomal tilnærming i fullt kjemisk definerte forhold. Prosedyrer for utvinning, kultur, omprogrammering og karakterisering av resulterende indusert pluripotent stamceller strenge metoder er detaljerte.
Abstract
Autologous cellen-basert behandling fikk et skritt nærmere virkeligheten med innføringen av indusert pluripotent stamceller. Fetal stamceller, som fostervann og membran mesenchymal stamceller, representerer en unik udifferensierte celler med løfte vev engineering og omprogrammere til iPSC for fremtidige pediatric intervensjoner og stilk cellen bank. Protokollen presenteres her beskriver en optimalisert prosedyre for å trekke ut og dyrking primære amniotic væske og membran mesenchymal stamceller og generere episomal indusert pluripotent stamceller fra disse cellene i fullt kjemisk definerte kultur forhold menneskelige rekombinant vitronectin og E8 medium. Karakterisering av de nye linjene ved å bruke strenge metoder-flowcytometri, AC confocal imaging, teratoma dannelse og transcriptional profilering-er også beskrevet. De nyopprettede linjene uttrykke markører av embryonale stamceller-Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4-samtidig er negativt for SSEA-1 markøren. Stamcelleforskningen linjer danner teratomer i scid-beige mus i 6-8 uker og i teratomer inneholder vev representant for alle tre bakterie lag. Transcriptional profilering av linjene ved sending av globale uttrykk microarray data til en bioinformatic pluripotency vurdering algoritme anses alle linjer pluripotent og derfor denne tilnærmingen er et attraktivt alternativ til dyreforsøk. De nye iPSC linjene kan lett brukes i nedstrøms forsøk med optimalisering av differensiering og vev engineering.
Introduction
Teknologien for indusert pluripotent stamceller (iPSC) bringer om potensielle celle erstatning terapi, sykdom og utviklingsmessige modellering, og narkotika og toksikologisk screening1,2,3. Erstatning terapi kan konseptuelt oppnås ved celle injeksjon, in vitro differensiert vev (som cardiac patcher) implantasjon, eller guidet fornyelse ved hjelp av vev engineering. Fostervann (AFSC) og membran stamceller (AMSC) er en utmerket kilde til celler for disse intervensjonene enten direkte4,5,6,7 eller som en start celle befolkningen omprogrammere i pluripotency8,9,10,11,12.
Tidlig tilnærminger brukt udefinert kultur systemer eller omprogrammering metoder som krever innebære genomisk integrering av konstruerer9,10,11,12. En nyere studie ansatt en xeno-fri medium, selv om en mindre definerte kjelleren membran vedlegg matrise (BMM) ble brukt, generere iPSC fra amniotic væske epitelceller. Imidlertid var teratoma formasjon analysen ikke inkludert i studien en rekke in vitro og molekylære data. Amniotic væske epitelceller ble funnet for å ha en omtrent 8-fold høyere reprogramming effektivitet sammenlignet med neonatal fibroblaster13. I en annen studie fant også mesenchymal stamceller fra fostervann omprogrammeres til iPSC med en mye høyere effektivitet12.
Pluripotent stamceller kan differensieres til vev representant for alle 3 bakterie lag og dermed har den bredeste muligheten. Pediatriske pasienter kan dra nytte av høsting, omprogrammering og vev utvikling av sine autologous amniotic væske stamceller prenatally og amniotic membran stamceller øye. Videre kan på relativt lavt nivå av (lavere enn voksne stamceller14,15) fetal stamceller teoretisk hjelpe i adressering observert oppbevaring av epigenetic bias fra kildecellene i iPSC16.
Presenterer her vi en protokoll for å omprogrammere fostervann og membran stamceller til pluripotency i kjemisk definert xeno-fri E8 medium på rekombinant vitronectin17 (VTN) bruker episomal plasmider18. Den største fordelen med amniotic væske og membran celler som cellene omprogrammere ligger i tilgjengelighet pre og øye og dermed denne tilnærmingen vil hovedsakelig nytte forskning i pediatric tissue engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger institusjonelle retningslinjer av den etiske komiteen for menneskelig forskning. Skriftlig samtykke fra pasienten ble oppnådd for bruk av amniotic væ for forskning.
Denne protokollen følger retningslinjene i institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av University of South Alabama.
1. isolering og kultur av primære Amniotic Mesenchymal stamceller
-
Plating av amniotic væske celler
- Få minst 2,5 mL fostervann høstet under amniocentesis av lege.
Merk: Alle håndtering av levende celler og vev må utføres i et sterilt vev-kultur skap og riktig personlig verneutstyr må brukes. Kjennskap til grunnleggende cellekultur og steril teknikk er nødvendig. - Forberede amniotic væske og membran celle (AFMC) kultur medium: EBM-2 basale medium, 15% fosterets bovin serum (FBS), 20 ng/mL bFGF, 25 ng/mL EGF, 10 ng/mL av IGF. For kultur av primære amniotic væske samt amniotic membran stamceller, bør medium suppleres med antibiotika-antimycotic løsning.
- På dag 0, blande 2,5 mL av amniotic væske med 3,5 mL AFMC kultur medium og plate i en T25 kolbe. Ruge på 37 ° C og 5% CO2 minst 48 h uforstyrret før du sjekker for tilstedeværelsen av kolonier.
- På dag 5 skal kolonier av tilhenger celler vises. Forsiktig rock kolbe å dislodge celler som ikke fullt ut overholder bunnen og rusk og vakuum-leveringstanken brukte medium/amniotic væske blandingen med en Pasteur pipette. Erstatt med 5 mL av fersk AFMC medium.
- Kultur for en annen 5 dager. Endre medium annenhver dag som beskrevet i trinn 1.1.4.
- Få minst 2,5 mL fostervann høstet under amniocentesis av lege.
-
Isolering av primære mesenchymal stamceller fra menneskelig amnion
- Få placentas så snart som mulig etter fødselen, innen 24 timer på den siste, maksimere mobilnettet integritet. Skjær et 9 cm2 segment av amnion, fjerne blodpropp og vask i et 50 mL sentrifuge rør med 30 mL av PBS med antibiotika-antimycotic løsning.
- Hakke membraner med en skalpeller fine stykker i sterilt 10 cm vev kultur parabol. Fordøyelsen av membraner og utvinning av cellene vil oppnås med en vev dissosiasjon system. Følg produsentens protokollen.
Merk: jo finere biter av vev etter hakking, jo høyere celle tall gjenopprettet etter fordøyelsen. - Overføre hakket membran vev massen bruker skalpell bladene inn i en vev dissosiasjon rør og bland med 4,7 mL RPMI 1640 medium. Bland i dissosiasjon enzymer (se Tabell for materiale).
- Montere rør på vev dissociator og kjøre programmet "h_tumor_01". Inkuber rørene på 37 ° C på en rocking plattform for 30 min.
- Videre fortynne suspensjoner med 35 mL RPMI 1640 og gjelder en 70 µm sil plassert over et 50 mL samlingen sentrifuge rør.
- Sentrifuger tilberedt 5 min 200 x g i romtemperatur, kast nedbryting, resuspend pellet i 5 mL av RPMI 1640, telle celler ved hjelp av en hemacytometer, og plate på en tetthet av 10.000 celler/cm2 i vev kultur-behandlet fartøy med fersk AFMC medium med antibiotika-antimycotic løsning.
Merk: Ved ufullstendig fordøyelsen, små biter av vev finnes og enkeltceller blir knappe. Nedspinning igjen og tallerkenen hele pellet i en MT75 kolbe.
-
Primære AFSC og AMSC
- Passasjen kolonier av AFSC/AMSC av vakuum-aspirating brukt middels bruker en Pasteur pipette og legge 2 mL av cellen avdeling enzym i flasken. Ruge på 37 ° C i 5-8 min.
- Trykk på kolbe å dislodge cellene og bland suspensjon med en like volum av AFMC medium (antibiotika-antimycotic supplement bør ikke være nødvendig fra dette punktet). Sentrifuge 200 g i 4-5 min. Fjern nedbryting bruker enten et glass Pasteur pipette eller bare med invertere røret og tømme den i en avfallsbeholderen.
- Bla nederst sentrifuge røret for å bryte opp pellets til en enkeltcelle suspensjon i gjenværende dråpe flytende og bland med AFMC medium for plating. Platen i T-flasker på en tetthet mellom 2500 og 5000 celler/cm2.
- Endre medium annenhver dag. Ikke kultur cellelinjer utover passasjen 6. Omprogrammere formål, bruk så lavt en passasje som mulig.
- Forberede frosne bestander av AFSC og AMSC som sikkerhetskopier ved hjelp av frysing medium. Høste kulturer ved hjelp av en celle avdeling enzym, sentrifuge 200 g for 4 ° C i 5 minutter.
- Fjern nedbryting bruker en Pasteur pipette, og bla til bunnen av røret for å singularize cellene i pellet. Resuspend i fullstendig frysing medium på en tetthet av 1 × 106/mL og aliquot i cryovials. Oppbevares i en fryser emballasjen overnatting på-80 ° C. Deretter gå til flytende nitrogen for langtidslagring.
2. omprogrammering i Pluripotency
- Få reprogramming plasmider
- Kjøpe reprogramming plasmider gjennom et non-profit plasmider oppbevaringssted. En materiale overføring avtale er nødvendig.
- Plasmider forvandle E. Coli kompetent celler og isolere plasmider bruker en kommersiell plasmider utvinning kit. Følg instruksjonene fra produsenten.
- Måle konsentrasjonen av plasmider DNA bruker et spektrofotometer. Mål for høy resulterende plasmider konsentrasjon, ideelt rundt 1 µg/µL å unngå fortynning av prøven under hva.
- Måle konsentrasjonen av enkelte plasmider bruker UV-spektrofotometer og aliquot dem individuelt.
- Bland sammen 3 µg, 3 µg og 2 µg av EN2K, ET2K og M2L plasmider, henholdsvis. Dette er reprogramming plasmider løsningen. Mengden av plasmider løsning er nok å transfect 1 x 106 celler. Forbered flere slike dele.
- Lagre alle dele på-80 ° C.
- Forberede mål kultur plater
- Coat en 6-vel plate med vitronectin-Legg 1 mL av vitronectin fortynning buffer i hver brønn og bland i 40 µL VTN lager løsning (1 µg/cm2). La ved romtemperatur (RT) eller i kuvøse på 37 ° C 1t.
- Vakuum-leveringstanken løsningen ved å benytte en Pasteur pipette og erstatte med 2 mL AFMC medium i hver brønn. Lagre på 37 ° C til cellene er å være belagt.
Merk: Viktig: The AFMC mediet brukes i dette trinnet kan ikke inneholde noen antibiotika eller antimycotic løsninger.
- Høste kulturperler primære AFSC/AMSC
Merk: Utvid AFSC/AMSC i kultur nok å gjøre frosne aksjer i noen lav passasje og dedikere en T-75 kolbe omprogrammere. Siden så få som 100.000 celler er tilstrekkelig for et eksperiment, sikte på høsting rundt 500.000 celler for å kompensere for tap og hvis optimalisering av hva parametere eller annen kultur betingelser skal testes.- Når den tidligste på en lav passage, høste AFSC/AMSC bruker celle avdeling enzym blanding som beskrevet i trinn 1.3.1 til 1.3.2. Når cellene har vært sentrifugeres, gå videre til neste trinn.
- Resuspend pellets i 1 mL av PBS og bland godt å vaske serum komponenter. Telle celler ved hjelp av en hemacytometer. Justere celle tettheten til 100.000/mL PBS og aliquot inn i 1,5 mL microcentrifuge rør. Dette sikrer bare minimal kontakt tid mellom cellene og bufferen for hva.
- Sett microcentrifuge røret på 5 mL polystyren rør (som adaptere, vil tillate sentrifugering i en vanlig swing rotor) og sentrifuge 200 x g for 4 min ved romtemperatur. Invertere rør og kast nedbryting i en avfallsbeholderen. Ikke bruk en bestemt vinkel rotor.
- Utføre et ekstra sentrifugering skritt på 200 x g for 3 min ved romtemperatur. Dette vil gi de resterende flytende fra veggene i røret å samle nederst. Nøye Sug opp alt med en 200 µL pipette.
- Hva med reprogramming plasmider
- Omprogrammere eksperimenter, brukes en hva systemet (se Tabellen for materiale) å levere omprogrammering plasmider inn i cellene. Plasser transfection tips, hva rør, rørets buffer og elektrolytisk buffer i vev-kultur kabinettet. Kit reagensene holdes i RT før de åpnes, og de lagres på 4 ° C.
Merk: Vi bruker 10 µL versjonen av pakken. - Flytte transfection enheten lukker slik at dens undergrunnsstasjon kan plasseres direkte inn i skapet. Fyll en transfection tube med 3 mL elektrolytisk buffer og montere røret til stasjonen ved å skyve den helt inne i sporet.
- Ta den reprogramming plasmider løsning dele forberedt i trinn 2.1.5 av-80 ° C lagring og tillate dem å tine på RT i kulturen kabinett.
- På hva apparat, Velg følgende transfection parametere: 950 V 40 ms, og 1 puls.
- Resuspend pellets med 100.000 celler i 10 µL rørets buffer. Arbeide raskt fra dette punktet på siden rørets bufferen er litt giftig og en økt eksponeringstid fører til et merkbart lavere celle levedyktighet.
- Bland i 1/10 av reprogramming plasmider løsningen (løsningen aliquot var forberedt for totalt 1 x 106 celler).
- Montere et transfection tips på transfection pipette.
- Sug opp cellen suspensjon i transfection spissen nøye unngå dannelse av luftbobler. Hvis boblene er observert, utvise suspensjon og gjentar aspirasjon. Luftbobler vil hindre transfection.
- Hva pipette inn transfection røret og trykk på "START"-knappen på skjermen på transfection enheten. Vente på skjermen meldingen informerer om suksessen til transfection og fjerne pipette fra tuben umiddelbart.
- Utvise suspensjon i 1 godt av målet 6-vel plate i delen 2.2. Bland i medium fra en nærliggende godt og distribuere suspensjon like i begge brønner (resulterende celle tettheten blir 50000/vel).
- Gjenta transfection for alle microcentrifuge rør som inneholder AFSC/AMSC individuelt. Plass platen i inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
- Omprogrammere eksperimenter, brukes en hva systemet (se Tabellen for materiale) å levere omprogrammering plasmider inn i cellene. Plasser transfection tips, hva rør, rørets buffer og elektrolytisk buffer i vev-kultur kabinettet. Kit reagensene holdes i RT før de åpnes, og de lagres på 4 ° C.
- Kulturen av transfekterte AFSC/AMSC
- Kultur transfekterte cellene i 2-5 dager. Deretter bytte til omprogrammering middels bestående av E8 supplert med 100 µM av natrium butyrate dag 3.
Merk: Sekundær passasje kan utføres for å unngå overvekst av AFSC/AMSC. Men deaktiverer den passaging muligheten til å beregne reprogramming effektiviteten riktig hvis denne parameteren er av interesse. - Endre reprogramming mediet hver dag til annenhver dag 10 dager. Endre mediet hver dag fra dag 10 på.
- Kultur transfekterte cellene i 2-5 dager. Deretter bytte til omprogrammering middels bestående av E8 supplert med 100 µM av natrium butyrate dag 3.
- Manuell plukking av fullt reprogramed koloniene for klonal ekspansjon
- Fullt omprogrammeres kolonier vises rundt dag 14. Tillate kolonier ekspandere i størrelse og kompakt. De kan manuelt plukket og overført til frisk platene så tidlig som i dag 15-16.
- 1 time før plukke prosedyren, pels 24-vel plater med 8 µL av VTN i 300 µL vitronectin fortynning bufferen per brønn (1 µg/cm2) og Inkuber RT eller 37 ° C. Erstatt løsningen med E8 medium uten natrium butyrate.
- Velg kolonier av en tilstrekkelig størrelse (ideelt over 400 µm i diameter) i en steril kultur kabinett. Fase kontrast mikroskop eller en stereomicroscope kan brukes.
- For plukking, vil en LCD tenkelig mikroskop plassert i regjeringen bli brukt siden sin skjerm eliminerer behovet for okulars. Sterilisere mikroskop scenen med 70% etanol.
- Bruker vanlig kontrast celle kultur mikroskop, Velg, merke, og noter nummeret kolonier skal plukkes. Dette er viktig å sørge for tiden ikke er bortkastet for denne prosessen under faktiske plukking.
- Fylle en rekke PCR-rør som er lik eller større enn antall kolonier skal plukkes med 30 µL av 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i PBS. Kolonier plasseres i disse rør for delvis dissosiasjon før plating.
- Skal plukke 5 kolonier om gangen fra platene med en 10 µL pipette satt til 2 µL. Hold pipette spissen i en vinkel på kolonien kanten og nøye og gradvis skrape hele kolonien av overflaten. Umiddelbart Sug opp hele kolonien i pipette spissen og overføre den til en av forberedt PCR rør med EDTA.
- Gjenta med de resterende 4 koloniene. Ruge på RT for 4-6 min.
- Pipetter suspensjon opp og ned forsiktig med en større pipette tips for å bryte kolonien ned i mindre klumper. Unngå å opprette en enkeltcelle suspensjon.
- Plate suspensjon direkte i et mål godt av en 24-vel plate i trinn 2.6.2. Gjenta med de resterende koloniene.
- Gjenta trinn 2.6.6 gjennom 2.6.10 Hvis mer enn 5 kolonier skal plukkes men plukkes ikke mer enn 5 kolonier samtidig. Ruge på 37 ° C og 5% CO2.
- Klonal ekspansjon og modning av iPSC
- Tillate koloniene til å vokse og bli kompakt. 3-6 dager er tilstrekkelig. Endre kultur medium daglig. Bruk mellom 400 µL og 1 mL av E8 medium basert på celle tetthet.
- Brønner på 24-vel platen med en koloni tettheten vil bli utvidet i 6-vel platene. 1 time før passaging, pels 6-vel platene med VTN (som i trinn 2.2.1). Deretter erstatte løsningen i brønnen med 2 mL av E8 medium per brønn.
- Sug opp brukte medium fra kilde brønnene ved hjelp av en 1 mL pipette og erstatte med 300 µL av 0,5 mM EDTA å vaske. Sug opp umiddelbart med samme pipette spissen erstatte med 300 µL av 0,5 mM EDTA igjen, og ruge på RT for 5 min. Sug opp alle væske med en 1 mL pipette.
- Angi 1 mL pipette kapasitet, montere en 1 mL wide-fødte tips på den og Sug opp E8 mediet målet godt i spissen. Vask kilde iPSC kultur med en strøm av mediet.
- Overføre suspensjon i målet godt og Pipetter opp og ned flere ganger for å bryte opp kolonier i klumper av 20-50 celler. Kontroller at de få distribuert jevnt i brønnen av milde rocking og risting platen og ruge på 37 ° C og 5% CO2.
- Endre medium daglig og passasje hver 3-4 dager. Unike kolonier kan merkes under kontrast mikroskopet og fjernet bruker en pipette tips i kulturen kabinett. Dette gir selektiv formering av høy kvalitet ren iPSC kultur.
- 1 time før passaging, pels brønnene av en 6-vel plate med VTN som i trinn 2.2.1. Deretter erstatte løsningen med 2 ml av E8 medium per brønn.
- Rutinemessig passaging er lik den opprinnelige passaging gjort med 0,5 mM EDTA (trinn 2.7.2 til 2.7.5). Erstatt brukte medium i en brønn av en 6-vel-plate med 1 mL av EDTA å vaske og forkaste.
- Legg 1 mL av EDTA og ruge på RT i 5-7 min for delvis dissosiasjon. Optimalisere inkubasjon tiden hvis nødvendig, sørge for en suspensjon av rundt 20-50-cellen til klumper produseres. Unngå dissosiasjon i enkeltceller.
- Forkast EDTA løsningen og Sug opp 1 mL av E8 mediet bruker en 1 mL pipette fra målet godt inn i en wide-fødte pipette tips.
- Vask av kilde iPSC kultur med en strøm av E8 mediet gjentatte ganger til en ønsket del av det var befridd fra overflaten og overføre til målet godt. Denne delen representerer delt forholdet (f.eks1/8 av kultur kan overføres til en 1:8 ratio.)
- Passasje hver 3-4 dager. Tillate iPSC linjer modnes ved dyrking dem for minst 15 ganger før du bruker dem i nedstrøms eksperimenter
3. karakterisering og bekreftelse av Pluripotency
Merk: Se utfyllende filene for detaljer på flowcytometri og AC confocal mikroskopi.
-
Teratoma formasjon analysen
- For å avgjøre kapasiteten til iPSC å skille ut vev representant for alle tre bakterie lag av teratoma formasjon analysen, følg de institusjonelle retningslinjene for dyr omsorg og bruk, planlegge fremover for å gi tid for innlevering den riktige protokollen dokumenter. Teratoma dannelsen i mus vil ta mellom 6-10 uker.
- Kultur 4 brønner av en 6-vel plate per iPSC linje for 4 dager. Antall celler injiseres i en flanke museklikk er 0,5 til 1 x 106 celler. Valgfritt: ekstra godt kan være dedikert til å bestemme en representant celle nummer på et godt med enkeltcelle dissosiasjon med en celle avdeling enzym og teller.
- Beregne volumet av E8/BMM blandingen iPSC klumper sperres i: begge flanken av en mus er injisert, hver med 150 µL av klynge suspensjon. Tre mus er tilstrekkelig å teste teratoma dannelsen av en iPSC linje. Inkluder en ekstra 150 µL per pinne i volumet å kompensere for død volum tap. 1 nål per mus brukes. Det totale volumet er derfor 3 * (150 µL * 2 + 150 µL) = 1350 µL
- Delvis distansere iPSC koloniene med EDTA som om de skulle være passaged, som beskrevet i trinn 2.7.8 til 2.7.10. Det er viktig at koloniene være atskilt i klumper og ikke delt i enkeltceller.
- Vask av iPSC koloniene med 675 µL av E8 medium (halvparten av beregnet fra trinn 3.3.3), bruker en bred-fødte tips. Overføre klump suspensjon i en 5 mL polystyren rør. Plasser på isen.
- Kombiner med 675 µL av BMM. Holde resulterende suspensjon på is til injeksjon.
- Bedøve mus å nakkens dem ved hjelp av isoflurane. Dette bør utføres eller guidet av dyktige personell i vivarium.
- Vortex 5 mL polystyren rør kort og Sug opp klump suspensjon (450 µL per mus) til en insulinsprøyte utstyrt med en 22 G nål. Injisere 150 µL av cellen suspensjon subcutaneously. Dette volumet inneholder ca 1 x 106 celler (se trinn 3.1.2).
- Injisere 3 mus per iPSC linje. Følg riktig dyr omsorg praksis for alle prosedyrer.
- Overvåke tilstanden til mus daglig.
- Når teratomer når et endepunkt på 1,5 til 2 cm i diameter, euthanize musene, explant av teratomer og lagre dem i formalin løsning for vev fiksering 24 h.
- Bringe de faste teratomer på et histology kjernen anlegg for hematoxylin eosin (H & E) flekker. En patologen vil karakteren tilstedeværelsen av vev av alle tre bakterie lag.
Merknad for Karyotyping: Live iPSC kulturer bør sendes til spesialiserte cytogenetic laboratorier for å teste integriteten til karyotype. Det anbefales at denne testingen utføres hver 5 passasjer.
-
Transcriptional profilering
- Kultur 2 brønner i en 6-vel plate for 3-4 dager å få ett RNA utvalg. Bruk kun høy kvalitet kulturer, mindre forurensning med differensiering cellene kan rettes ved skraping dem ved hjelp av et Pipetter tips.
- Isolere RNA fra iPSC kulturer ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig utstyr etter produsentens protokoll. Skipet prøver til et spesialisert genomisk kjernen.
- Få globale transcriptional profiler iPSC linjene microarrays (se Tabell for materiale for støttede valg) eller RNA sekvensering.
- Sende "*.idat" filer bioinformatic vurdering av pluripotency via et webgrensesnitt ved Coriell Institute. Eventuelt sende "* .cel" filer for bioinformatic identifikasjon av cellen, inkludert pluripotent stamceller, via et webgrensesnitt ved Johns Hopkins University. Se Tabellen for materiale for informasjon om datatypene personlige bioinformatic analyser godta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienter før høsting fostervann for genetisk testing formål og dedikere en liten aliquot væske for forskning. Ingen samtykke er nødvendig for bruk av amniotic membranen i forskning som morkaken representerer medisinsk avfall. Amniotic væske og membran stamceller vise typiske mesenchymal egenskaper, morphologically sine celler er spindel-formet og fase-lyse. Ved reprogramming, cellene gjennomgår mesenchymal-til-epitelial (MET) transition og erverve brosteinsbelagte-lignende morfologi og romlig organisering koloniene, indikerer epithelial egenskaper. Denne prosessen er igangsatt så tidlig som 48-72 h etter innføringen av omprogrammering episomal plasmider. Fravær av disse kolonier av dag 5 med reprogramming skulle tilsi svikt av eksperimentet. Sprer celler MET koloniene og resultatet koloniene blitt kompakt, mellom dag 5 og 14. Kompakt MET kolonier består av celler som ikke lett individuelt merkbar (figur 1A). På rundt dag 14, vises fullt omprogrammeres kolonier med celler ordnet i en monolayer, bærer fremtredende, lett merkbar kjerner og nucleoli. De er klare mekanisk isolert og utvidet når koloniene når en passende størrelse og blitt kompakt (figur 1B).
Fullstendig og delvis omprogrammeres kolonier finnes i kulturer gjennom hele reprogramming perioden, selv om delvis omprogrammeres koloniene ikke nødvendigvis kjøpe full pluripotency. Figur 2 viser en representant flyte cytometric analyse av embryonale stamcelleforskningen (ESC) markør uttrykk i helt og delvis pluripotent kolonier og deres tilsvarende morphologies. Full pluripotency er assosiert med uttrykk for Oct4, Nanog, Sox2, TRA antigener og SSEA-4, mens SSEA-1 uttrykk er negativ19,20,21 (figur 2A). Delvis uttrykke pluripotent celler, men ikke Nanog og TRA antigener20 (figur 2B). Uttrykk og lokalisering av ESC merketrådene skal bli bekreftet av immunocytochemical flekker og fotografert med et bredt felt eller AC confocal mikroskop (Figur 3).
En funksjonell bekreftelse pluripotency oppnås ved å demonstrere evnen til iPSC linjene til skjemaet teratomer etter injeksjon av cellene i scid-beige mus. 6-8 ukens er nødvendig for teratomer å nå end-point størrelsen. H & E farging av vev og undersøkelse av en patologen utføres da for å bekrefte tilstedeværelse av vev representant for alle tre bakterie lag-endoderm, neuroectoderm og mesoderm (figur 4A). Et alternativ til dyr testing er å analysere transcriptional signaturen tilknyttet pluripotency ved genomisk tilnærminger som cDNA microarrays22,23. Andelen transcriptional profilen som overlapper med en av en pool av veletablert iPSC og ESC linjer kan deretter kvantifiseres av online bioinformatic pluripotency evaluering i form av en tomt på to klassifiserere-pluripotency og nyheten (figur 4B). Jo flere pluripotency poeng, mer i spørringen iPSC linjen ligner etablerte linjene. En høy nyhet score, men kan indikere avvik eller selv chromosomal avvik, til tross for en høy pluripotency score (for eksempel i teratocarcinoma linjer)22. Alle iPSC linjer genereres av følger protokollen presenteres her har vært ansett pluripotent av flowcytometri, bildebehandling, teratoma dannelse og transcriptional analyseteknologi.
Figur 1: morfologiske progresjon av cellene under omprogrammering. (A) den amniotic væske og membran stamceller, som representerer kildecellene omprogrammere, viser en typisk mesenchymal morfologi, langstrakt og fase-lys (venstre) før de gjennomgå mesenchymal-til-epitelial overgangen (MET) som fører til oppkjøpet av epitelial egenskaper og dannelsen av kolonier med brolegge stein-aktig celler (midten). Disse kolonier sprer og opprette uregelmessig mobilnettet masser av MET celler (høyre). (B) i fasen med reprogramming (starter fra rundt dag 14) kolonier av fullt omprogrammeres celler dukker – individuelt merkbar celler med fremtredende kjerner og nucleoli arrangert i monolayers, med godt definerte grenser (midten)- og stede sammen med MET kolonier som er mer tallrike (venstre). En fullt omprogrammeres isolert eldre klone er avbildet til høyre. Skala bar = 100 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: flyt cytometric analyse av uttrykk for ESC markører i fullt og delvis (MET) omprogrammeres celle kolonier. (A) pluripotent uttrykk profilen er positivt for Oct4, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81 og SSEA-4, mens negativ for SSEA-1. (B) pluripotent celle koloniene-de som har gjennomgått MET, men kunne ikke videre til full pluripotency-er delvis positivt for Oct4 og Sox2, men Nanog, TRA og SSEA antigener er fraværende. De tilknyttede morphologies er inkludert for side-ved-side-sammenligning. Skalere barer = 200 µm og 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: AC Confocal imaging analyse av uttrykk for ESC markører i eldre amniotic væske iPSC. Transkripsjonsfaktorer Oct3/4A, Nanog og Sox2 er lokalisert i kjerner mens TRA og SSEA antigener er glykoproteiner lokalisert på membranen. Skala bar = 50 µm. bilder av større forstørrelse (flettingen 2 X) ble inkludert for Oct3/4, Nanog og Sox2 for bedre visualisering av deres kjernefysiske lokalisering. Skala bar = 25 µm. overførbare-bilder ble anskaffet lyset. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Teratoma dannelse og transcriptional profilering i eldre amniotic væske og membran iPSC. (A) Teratomas dyrket i scid-beige mus subcutaneously inneholde vev representant for alle tre bakterie lag (100 X forstørrelse). (B) global uttrykket microarray profiler innsendt til online pluripotency programvare returnerte et plott av to klassifiserere-pluripotency og nyheten. Høy pluripotency score og lav nyhet score - røde Sky - angi et uttrykk profil av en typisk ESC/iPSC linje. Blå skyen representerer en klynge område for differensierte celler, mens svak blå skyen representerer en klynge område for delvis pluripotent celler. Den amniotic væske (3 linjer) og membran (4 linjer) iPSC var anses pluripotent av testen. En ESC linje WA25 var inkludert som en kontroll og identifiseres her med en svart pil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den innledende fasen av iPSC generasjon fra fetal stamceller innebærer utvinning av kildecellene fra fosterets vev, kultur, utvidelse og innføring av episomal reprogramming plasmider. Denne fasen er etterfulgt av en kultur periode på rundt 14-18 dager før første fullt omprogrammeres koloniene kan utvides. Sluttfasen er modning iPSC kloner. Første utvinning av amniotic membran stamceller oppnås ved hjelp av en kombinert mekanisk og enzymatiske fordøyelsen av amnion. Vi fant som en inkubering periode av 30 min resulterte i høyeste antall celler utdraget med høyeste levedyktighet. Fordøyelsen prosedyren kan produsere små biter av vev og celle klumper. Hvis disse i forhold til enkeltceller er høy, anbefaler vi plating alle klumper og enkeltceller i et kar siden alle kan bidra til utvekster tilhenger celler. Kontaktflate amniotic væske stamceller er enkelt som cellene er bare blandet med kultur medium og ruges til kolonier av tilhenger celler kommer en tilstrekkelig størrelse. Vanlig vev kultur-behandlet plasticware er perfekt egnet og anbefales ikke spesialitet overflater, selv om de er beregnet for forbedret primære cellekultur, siden med disse observerte vi lavere viabilities og problemer med den passaging prosessen.
Den amniotic væske og membran stilk celler skal ekspanderes og aksjer frosset men når den tidligste, kan cellene brukes som kildecellene omprogrammere. For innføring av episomal plasmider i cellene, hva systemet brukes her med transfection parametere angitt til 950 V har 40 ms og 1 puls utført veldig bra, med alle linjer forsøkte () til slutt lykkes omprogrammeres over 10 linjer). Viktigste konkurrerende levering systemet opererer på et lignende prinsipp produserer ikke en vellykket reprogramming eksperiment i våre hender.
Transfekterte cellene er seeded på vitronectin-belagt retter i AFMC medium for de første 3-5 dagene, så medium er slått til E8 supplert med 100 µM natrium butyrate. Dette øker kraftig frekvensen av full pluripotency oppkjøpet. De første tegnene til morfologiske transformasjon kan sees så tidlig som 48-72 h. Kildecellene gjennomgå MET og kolonier av celler med epithelial morfologi vises. Dette gradvis spre seg og blitt kompakt. Et delsett av koloniene får den morfologiske funksjoner i fullt pluripotent stamceller-individuelt merkbar celler med fremtredende kjerner og nucleoli, observert flat kolonier med godt definerte grenser, i motsetning til fuzzy grenser i delvis pluripotent MET kolonier. På tidspunktet for oppkjøpet av full pluripotency, kompakt MET celle koloniene skaffe fremtredende kjerner og de enkelte cellene bli merkbar når du oppretter en unik morfologiske mønster. En trenet øye er dette mønsteret et klart tegn på vellykket omprogrammering. Men til en etterforsker som mangler PSC kultur opplæring, krever identifikasjon av koloniene som har med hell kommet til full pluripotency nøye vurdering som MET og iPSC kloner kan forveksles for hverandre. Figur 1 og figur 2 gir eksempler på begge. Hvis MET kloner plukkes i stedet grundig flyt cytometri analyse vil avdekke feil og spesielt TRA-1-60 og TRA-1-81 antigener vil mest sannsynlig være fraværende som vist i figur 2. Faktisk ble TRA antigener tidligere funnet for å være strenge pluripotency markører. Men kan delvis pluripotent MET celler være av interesse for kreft forskning25.
Dette kultur er ikke kilden AFSC/AMSC og til slutt deres spredning vil avta og de vil få en flatere, fibroblast-lignende morfologi. Kildecellene danner vev som kan løsne fra overflaten under av reprogramming, selv om dette ikke negativt påvirke reprogramming prosessen. Tvert imot, fører prosessen noen ganger til befrier opp mellomrom for omprogrammeres koloniene, mens de eliminerer uønsket un omprogrammeres mobilnettet materiale. Frittstående vev kan lett bli forkastet et sterilt pipette tips, forlater delvis og fullt pluripotent kolonier bak, sterkt forenkle manuelt valg nedstrøms.
Manuell plukking fullt omprogrammeres koloniene bruker vi en LCD tenkelig system, som kan plasseres i sikkerhet regjeringen, mangler noen deler stikker ut som ville forstyrre luftstrømmen. Enn denne tenkelig system, er ingen spesielt utstyr nødvendig som plukking selv utføres med vanlig pipetter. Plukket koloniene er delvis atskilt i EDTA/PBS løsning før blir belagt i målet brønnene å vokse ut som kloner. Avhengig av linjen og klone, for flere passasjer, kan kulturer være forurenset med spontant skille celler. Manuell manipulasjon og føljetong passaging eliminere vanligvis dette problemet. Kloner riddled med omfattende differensiering bør forkastes, men dyrebare kloner kan reddes med ulike grader av suksessen med gjentatte manuelle plukke pluripotent kolonier i stedet for å kvitte seg med differensiering cellene. Episomal plasmider ble vist å ta rundt 15 ganger tapt helt fra iPSC26. Derfor er det tilrådelig å tillate kloner å vokse i minst det antallet ganger før du bruker dem for nedstrøms programmer og analyser, med unntak av TRA antigen uttrykk og karyotype. TRA antigen uttrykk kan lett overvåkes av flowcytometri som beskrevet her i protokollen, siden analysen bare krever rundt 200.000 celler, og kan utføres når forskerne er i tvil om kulturperler kloner opprettholder pluripotency riktig. Flyt cytometri analyse av ESC markør uttrykket anses ikke å være tilstrekkelig til å bekrefte pluripotency i kandidat linjer19.
Teratoma formasjon analysen er standard avgjørende pluripotency test27. Derfor injisere dem subcutaneously som klumper er nødvendig for sin vellykkede implantasjon8,28PSC vokst i kjemisk definerte, xeno-fri forhold er spesielt utsatt for dissosiasjon narkotikainduserte dødsfall. Etter injeksjon, vanligvis 4-6 uker er nok for veksten av xeno-graftene skal vises og før uke 8, alle kan være høstet, H & E-farget og analysert. Dyrevelferd, kostnad og lange tester perioder som er nødvendig er grunner for å utvikle alternative metoder. Genomic analyser kombinert med avanserte, maskinen læring-drevet bioinformatic tilnærminger kan gi en nøyaktig vurdering av globale uttrykket profiler. Prisen for innhenting slike data kan sammenlignes med kostnaden av teratoma formasjon analysen, men genomisk tilnærmingen er betydelig raskere og ingen dyr må brukes. En slik analysen er en bioinformatic pluripotency evaluering programvare22. Det er implementert som et webgrensesnitt (Tabell for materiale). Den økende populariteten og plummeting kostnaden av RNA sekvensering vil sikre kontinuitet av denne tilnærmingen. Et alternativ til dette pluripotency programvare er tilgjengelig fra Johns Hopkins University23 (cellnet.hms.harvard.edu) og er basert på en lignende tilnærming og godta microarray data for å analysere transcriptome i prøver fra mennesker. Fordelen med denne programvaren er at den har evnen til å identifisere ikke bare pluripotent stamceller men også differensierte celler og, siden dens kuratert datasett var avledet fra primære vev, nivået av likheten mellom in vitro vokst celler / vev og i vivo vev kan bestemmes, gir en utmerket kvalitetskontroll for utvikling av differensiering protokoller eller vev engineering. Testen har kapasitet til å klassifisere spørringene i 20 ulike celle eller vev typer. I dag, det krever microarray data, men forfatterne arbeider mot å utvide alternativene plattform til RNA sekvensering også.
Ved å følge presentert protokollen, kan forskere generere iPSC linjer fra amniotic væske og membran stamceller med en svært høy reproduserbarhet fullt kjemisk definert og xeno-fri medium og bruker en ikke-integrere reprogramming metode. Disse linjene kan brukes i grunnleggende forskning å optimalisere differensiering protokoller og til slutt i sykdom modellering, narkotika sortering, eller pediatric tissue engineering studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Fonds Medizinische Forschung Universitetet i Zurich, Forschungskredit Universitetet i Zurich, The SCIEX NMSlm under stipend 10.216 og 12.176, den sveitsiske Society of Cardiology, The Swiss National Science Foundation under Grant [320030-122273] og [310030-143992], 7th Framework Programme, livet Valve, Europakommisjonen under Grant [242008], Olga Mayenfisch Foundation, EMDO stiftelsen, oppstart stipendet 2012 universitetssykehus Zürich, og intern finansiering av Mitchell Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette - transfection pipette Neon device - transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip - transfection tip Neon tube - transfection tube buffer R - resuspension buffer buffer E - electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
- Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
- Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
- Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
- Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
- Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
- Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
- Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
- Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
- Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
- Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
- Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
- Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Martí, M., et al.
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
- Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
- Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
- Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
