Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Omprogrammering primära fostervatten och membran celler att Pluripotency Xeno-fria förhållanden

doi: 10.3791/56003 Published: November 27, 2017

Summary

Det här protokollet beskriver omprogrammering av primära amniotiska vätskan och membran mesenkymala stamceller till inducerade pluripotenta stamceller med en icke-integrerande episomal metod i helt kemiskt definierade villkor. Förfaranden utvinning, kultur, omprogrammering och karakterisering av de resulterande inducerade pluripotenta stamcellerna av stränga metoder är detaljerade.

Abstract

Autologa cellbaserade terapier fick ett steg närmare verkligheten med införandet av inducerade pluripotenta stamceller. Fetala stamceller, såsom fostervatten och membran mesenkymala stamceller, representerar en unik typ av odifferentierade celler med löfte i vävnadsteknik och för omprogrammering i iPSC för framtida pediatric interventioner och stamceller bank. Det protokoll som presenteras här beskriver en optimerad förfarandet för att extrahera och odlingsskålar primära amniotiska vätskan och membran mesenkymala stamceller och generera episomal inducerade pluripotenta stamceller från dessa celler i helt kemiskt definierade kultur villkor utnyttja mänskliga rekombinant Aktiebolaget Trav & galopp och E8 medium. Karakterisering av de nya raderna genom att tillämpa stränga metoder – flödescytometri, confocal imaging, teratoma bildandet och transkriptionell profilering – beskrivs också. De nyligen genererade linjerna express markörer av embryonala stamceller – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – samtidigt vara negativa för den SSEA-1. Stamcellslinjer bildar Teratom i scid-beige möss i 6-8 veckor och Teratom innehåller vävnader representativa för alla tre groddar lager. Transkriptionell profilering av rader av microarray datasändning i globala uttryck till ett bioinformatiska pluripotency bedömning algoritmen anses alla linjer pluripotenta och därför detta synsätt är ett attraktivt alternativ till djurförsök. De nya iPSC linjerna kan lätt användas i nedströms experiment med optimering av differentiering och tissue engineering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tekniken för inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) medför potentiella ersättare cellterapi, sjukdom och utvecklingsmässiga modellering, och drog och toxikologisk screening1,2,3. Ersättning terapier kan begreppsmässigt uppnås genom cell injektionen, in vitro differentierade vävnad (såsom hjärt patchar) implantation eller guidade regenerering genom vävnadsteknik. Fostervatten (AFSC) och membran stamceller (AMSC) är en utmärkt källa av celler för dessa insatser antingen direkt4,5,6,7 eller som en start cell befolkningen för omprogrammering till pluripotens8,9,10,11,12.

Tidiga metoder används odefinierad kultur system eller omprogrammering metoder som kräver innebär genomisk integration av konstruerar9,10,11,12. En senare studie anställd en xeno-fri medium, även om en mindre definierade basalmembranet fastsättning matris (BMM) användes, att generera iPSC från fostervatten vätska epitelceller. Teratoma bildandet analysen ingick dock inte i studien tillsammans med en rikedom av in vitro- och molekylära data. Fostervatten vätska epitelceller konstaterades ha en ungefär 8-faldigt högre omplanering effektivitet jämfört med neonatal fibroblaster13. En annan studie hittades också mesenkymala stamceller från fostervatten omprogrammeras till iPSC med en mycket högre effektivitet12.

Pluripotenta stamceller kan göras åtskillnad mellan in i vävnader representant för alla 3 groddar lager och således har den bredaste potentialen. Pediatriska patienter kunde dra nytta av skörd, omprogrammering och vävnadsteknik deras autolog amniotiska vätskan stamceller prenatalt och fostervatten membran stamceller perinatalt. Dessutom kunde relativt låga grad av differentiering av fetala stamceller (lägre än adulta stamceller14,15) teoretiskt stöd i att hantera observerade lagring av epigenetiska bias från källcellerna i iPSC16.

Presenterar här vi ett protokoll för omprogrammering fostervatten och membran stamceller till pluripotens i kemiskt definierade xeno-fri E8 medium på rekombinant Aktiebolaget Trav & galopp17 (VTN) använder episomal plasmider18. Den största fördelen med fostervatten vätska och membran celler som en källa av celler för omprogrammering ligger i deras tillgänglighet före och perinatalt och därmed denna metod främst skulle gynna forskningen in pediatric vävnadsteknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet följer institutionella riktlinjer av den etiska kommittén för mänsklig forskning. Skriftligt medgivande av patienten erhölls för att använda fostervattnet för forskning.

Detta protokoll följer politiken som den institutionella djur vård och användning kommittén av University of South Alabama.

1. isolering och kultur av primära fostervatten mesenkymala stamceller

  1. Plätering av fostervatten flytande celler
    1. Erhålla minst 2,5 mL fostervatten som skördas i processen fostervattenprov av läkare.
      Obs: All hantering av levande celler och vävnad måste utföras i en steril vävnad-kultur skåp och lämplig personlig skyddsutrustning måste användas. Förtrogenhet med grundläggande cellkultur och steril teknik krävs.
    2. Förbereda den amniotiska vätskan och membran (AFMC) cellodlingsmedium: EBM-2 basala medium, 15% fetalt bovint serum (FBS), 20 ng/mL bFGF 25 ng/mL EGF, 10 ng/mL av IGF. För kultur av primära fostervatten vätska samt fostervatten membran stamceller, bör medium kompletteras med antibiotikum-antimycotic lösning.
    3. Dag 0, blanda 2,5 mL fostervatten med 3,5 mL AFMC odlingsmedium och plattan i en T25 kolv. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för minst 48 h ostört innan kontroll av förekomst av kolonier.
    4. Dag 5 bör kolonier av vidhäftande celler förekomma. Skaka försiktigt kolven för att få bort celler som inte helt följa botten och skräp och vakuum-aspirera den förbrukade medium/fostervatten flytande blandning med hjälp av en Pasteur-pipett. Ersätt med 5 mL färsk AFMC medium.
    5. Kultur i ytterligare 5 dagar. Ändra medium varannan dag som beskrivs i steg 1.1.4.
  2. Isolering av primära mesenkymala stamceller från mänskliga amnionen
    1. Erhålla moderkakor så snart som möjligt efter födseln, inom 24 h på det senast, att maximera cellulär integritet. Skär en 9 cm2 segment av amnionen, ta bort blodproppar och tvätta i en 50 mL centrifugrör med 30 mL PBS kompletteras med antibiotikum-antimycotic lösning.
    2. Finhacka de membran som använder ett par skalpeller till fina bitar i en steril 10 cm vävnadsodling maträtt. Rötning av membran och utvinning av cellerna kommer att uppnås med hjälp av en vävnad dissociation system. Följ tillverkarens protokollet.
      Obs: ju finare bitar av vävnad efter malning, ju högre den cell nummer återhämtade sig efter matsmältningen.
    3. Överför den malda membran vävnad massa med skalpell bladen i en vävnad dissociation röret och blanda med 4,7 mL RPMI 1640 medium. Blanda i de dissociation enzymer (se Tabellen för material).
    4. Montera rören till den vävnad dissociator och kör programmet ”h_tumor_01”. Inkubera rören vid 37 ° C i en gungande plattform för 30 min.
    5. Ytterligare späda ut suspensioner med 35 mL RPMI 1640 och gälla en 70 µm SIL placeras över ett 50 mL samling centrifugrör.
    6. Centrifug beredd för 5 min vid 200 x g vid rumstemperatur, Kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 5 mL RPMI 1640, räkna cellerna med hjälp av en hemacytometer, och plattan på en densitet på 10 000 celler/cm2 i vävnadsodling-behandlade fartyg med nymalen AFMC medium kompletteras med antibiotikum-antimycotic lösning.
      Obs: Vid ofullständig matsmältning, små bitar av vävnad kommer närvara och enstaka celler blir knappa. Snurra ner igen och plattan hela pelleten i en T75 kolv.
  3. Kultur av primära AFSC och AMSC
    1. Passagen kolonier av AFSC/AMSC av vakuum-aspirera tillbringade medium använder en Pasteur-pipett och lägger till 2 mL av cell avlossning enzym i kolven. Inkubera vid 37 ° C i 5-8 min.
    2. Tryck på kolven för att få bort cellerna och blanda fjädringen med en lika stor volym av AFMC medium (antibiotika-antimycotic tillägg bör inte vara nödvändigt från denna punkt på). Centrifugera vid 200 g för 4-5 min. ta bort supernatanten med hjälp av antingen ett glas Pasteur-pipett eller helt enkelt genom invertering röret och tömningen till en avfallsbehållare.
    3. Bläddra längst ned på centrifugröret att bryta upp pelleten till en enda cellsuspension i de återstående droppen vätska och blanda med AFMC medium för plätering. Plattan in T-kolvar med en täthet mellan 2 500 och 5 000 celler/cm2.
    4. Förändring medium varannan dag. Inte för kultur i cellinjer bortom passage 6. För omprogrammering ändamål, använda som låg en passage som möjligt.
    5. Förbereda fryst lager av AFSC och AMSC som back-ups på frysning medium. Skörda kulturerna med en cell avlossning enzym, Centrifugera vid 200 g under 4 ° C i 5 min.
    6. Avlägsna supernatanten med Pasteur pipett och svep botten av röret till singularize cellerna i pelleten. Återsuspendera i fullständig frysning mediet vid en densitet av 1 × 106/ml och alikvot till cryovials. Förvara i en frysning behållare över natten vid-80 ° C. Flytta sedan till flytande kväve för långsiktig lagring.

2. omprogrammering till pluripotens

  1. Få de omprogrammering plasmidsna
    1. Köpa de omprogrammering plasmidsna genom en ideell plasmid-databasen. Ett avtal om dataöverföring Material behövs.
    2. Förvandla plasmidsna till E. Coli behöriga celler och isolera de plasmider som använder en kommersiell plasmid utvinning kit. Följ tillverkarens instruktioner.
    3. Mätning av koncentrationen av plasmid DNA med en spektrofotometer. Sträva efter en hög resulterande plasmid koncentration, helst runt 1 µg/µL att undvika utspädning av provet under transfection.
    4. Mätning av koncentrationerna av de enskilda plasmider som med hjälp av en UV-spektrofotometer och alikvot dem individuellt.
    5. Blanda ihop 3 µg, 3 µg och 2 µg av EN2K, ET2K och M2L plasmider, respektive. Detta är den omprogrammering plasmid-lösningen. Mängden plasmid lösningen är nog att transfect 1 x 106 celler. Förbereda flera sådana alikvoter.
    6. Lagra alla alikvoter vid-80 ° C.
  2. Förbereda mål kultur plattor
    1. Coat en 6-well platta med Aktiebolaget Trav & galopp – tillsätt 1 mL förtunningsbuffert Aktiebolaget Trav & galopp i varje brunn och blanda i 40 µL av VTN stamlösning (1 µg/cm2). Lämna vid rumstemperatur (RT) eller i inkubatorn vid 37 ° C för 1 h.
    2. Vakuum-aspirera om lösningen med en Pasteur-pipett och ersätta med 2 mL av AFMC medium i varje brunn. Lagra vid 37 ° C tills cellerna är att vara klädd.
      Obs: Viktigt: The AFMC medium som används i det här steget bör inte innehålla någon antibiotika eller antimycotic lösningar.
  3. Skörda odlade primära AFSC/AMSC
    Obs: Expandera AFSC/AMSC kultur nog att göra frysta bestånd på en låg passage nummer och ägna en T-75 kolv för omprogrammering. Eftersom så få som 100 000 celler är tillräcklig för ett experiment, syftar skörd omkring 500.000 celler för att kompensera för förluster och om optimering av transfection parametrar eller olika odlingsbetingelser är att testas.
    1. På den tidigaste bekvämligheten på en låg passage, skörda den AFSC/AMSC använder cell avlossning enzym mix som beskrivs i steg 1.3.1 att 1.3.2. När cellerna har varit centrifugeras, vidare till nästa steg.
    2. Återsuspendera pelleten i 1 mL PBS och blanda väl att tvätta serum komponenter. Räkna de celler som använder en hemacytometer. Justera cell densiteten till 100 000/mL PBS och delprov i 1,5 mL mikrocentrifugrör. Detta garanterar endast en minimal kontakttid mellan cellerna och bufferten används för transfection.
    3. Placera mikrocentrifug röret ovanpå 5 mL polystyren rör (som adaptrar, kommer att tillåta centrifugering i en vanlig swing rotor) och centrifugera vid 200 x g under 4 minuter i rumstemperatur. Vänd rören och kasta bort supernatanten till en avfallsbehållare. Använd inte en fast vinkel rotor.
    4. Utföra en ytterligare centrifugeringssteget vid 200 x g under 3 minuter vid rumstemperatur. Detta gör att de återstående vätska från väggarna i röret för att samla in längst ned. Aspirera försiktigt allt det med 200 µL pipett.
  4. Transfection med omprogrammering plasmider
    1. För omprogrammering experiment, kommer (se Tabell för material) en transfection systemet att användas att leverera omplanering plasmider in i cellerna. Placera transfection tips, transfection rör, resuspension buffert och elektrolytiska buffert i vävnadsodling skåpet. Satsreagenser hålls på RT tills de öppnas, då de lagras vid 4 ° C.
      Obs: Vi använder den 10 µL versionen av kit.
    2. Flytta transfection enheten Stäng så att dess tube station kan placeras direkt i skåpet. Fyll en transfection tub med 3 mL elektrolytisk buffert och montera röret i station genom att trycka den hela vägen inuti facket.
    3. Ta omplanering plasmiden lösning alikvoter bereddes i steg 2.1.5-80 ° C med lagringsutrymme och låt dem Tina i RT i kulturen skåp.
    4. På transfection enheten, Välj följande transfection parametrar: 950 V, 40 ms, och 1 puls.
    5. Återsuspendera pelleten som innehåller 100 000 celler i 10 µL resuspension buffert. Arbeta snabbt från denna punkt på eftersom resuspension buffert är mindre giftiga och en ökad exponeringstid resulterar i en märkbart lägre cellviabilitet.
    6. Blanda i 1/10 av omplanering plasmid lösningen (lösningen alikvotens förbereddes för sammanlagt 1 x 106 celler).
    7. Montera ett transfection tips på transfection pipetten.
    8. Sug upp cellsuspensionen i transfection spetsen försiktigt, undvika bildandet av luftbubblor. Om bubblor observeras, utvisa fjädringen och upprepa strävan. Luftbubblor kommer att hindra transfection.
    9. Infoga transfection pipetten i transfection röret och tryck på knappen ”START” på skärmen på transfection enheten. Vänta tills skärmen meddelandet informerar om framgången för transfection och avlägsna pipetten från röret omedelbart.
    10. Utvisa suspensionen in 1 väl Skyltens mål 6-väl förberedda i avsnitt 2.2. Blanda i mediet från en närliggande väl och fördela suspensionen lika i båda brunnarna (resulterande cell densiteten blir 50.000 per brunn).
    11. Upprepa transfection för alla mikrocentrifugrör innehållande AFSC/AMSC individuellt. Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
  5. Kultur av transfekterade AFSC/AMSC
    1. Kultur de transfekterade cellerna för 2-5 dagar. Växla sedan till omplanering medium bestående av E8 kompletteras med 100 µM av natrium butyrate på dag 3.
      Obs: Sekundära passage kan utföras för att undvika överväxt av källan AFSC/AMSC. Dock kommer att den passaging inaktivera alternativet för att beräkna omplanering effektivitet korrekt om den här parametern är av intresse.
    2. Ändra det omprogrammering mediet varje dag till varannan dag för 10 dagar. Ändra på medellång varje dag från dag 10 på.
  6. Manuell plockning av fullt reprogramed kolonier för klonal expansion
    1. Helt omprogrammeras kolonier visas runt dag 14. Tillåta kolonier att expandera i storlek och blir kompakt. De kan vara manuellt plockade och överförs till färska plattor så tidigt som dagen 15-16.
    2. 1 h innan plockning förfarandet, coat 24 brunnar med 8 µL av VTN i 300 µL förtunningsbuffert Aktiebolaget Trav & galopp per brunn (1 µg/cm2) och inkubera vid RT eller 37 ° C. Byt ut lösningen med E8 medium utan natrium butyrate.
    3. Välj kolonier av en tillräcklig storlek (helst över 400 µm i diameter) i en steril kultur skåp. Fas kontrast Mikroskop eller ett stereomikroskop kan användas.
    4. För plockning, kommer en LCD imaging mikroskopet placeras i skåpet att användas eftersom dess ordningsmanen eliminerar behovet av informationsprojicering. Sterilisera Mikroskop scenen med 70% etanol.
    5. Använder en vanlig cell kultur faskontrastmikroskop, Välj Markera och notera antalet kolonier som ska plockas. Detta är viktigt att se till att tid inte slösas bort för den här processen under den faktiska plockningen.
    6. Fylla ett antal PCR-rör som är lika med eller större än antalet kolonier plockas med 30 µL av 0,5 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i PBS. Kolonierna kommer att placeras i dessa rör för partiell dissociation före plätering.
    7. Planerar att plocka 5 kolonier i taget från plattorna med 10 µL pipett inställd på 2 µL. Håll pipettspetsen i vinkel på kolonin kanten och försiktigt och gradvis skrapa hela kolonin från ytan. Omedelbart sug upp hela kolonin i pipettspetsen och överför det till en av de beredda PCR-rör med EDTA.
    8. Upprepa med resterande 4 kolonierna. Inkubera vid RT för 4-6 min.
    9. Pipettera suspensionen upp och ner försiktigt med en större pipettspetsen för att bryta kolonin i mindre klumpar. Undvik att skapa en enda cellsuspension.
    10. Plåt upphängningen direkt i ett mål väl på en 24-well platta bereddes i steg 2.6.2. Upprepa med resterande kolonierna.
    11. Upprepa steg 2.6.6 genom 2.6.10 om fler än 5 kolonier ska plockas men inte plocka mer än 5 kolonier i taget. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
  7. Klonal expansion och mognaden av iPSC
    1. Tillåta kolonier att växa och bli kompakt. 3-6 dagar är tillräckliga. Ändra odlingssubstratet dagligen. Använd mellan 400 µL och 1 mL E8 medium baserat på cell densiteten.
    2. Brunnar i 24-väl plattan med tillräcklig kolonin täthet kommer att utökas i 6-väl plattor. 1 h innan passaging, coat 6-väl plattorna med VTN (som i steg 2.2.1). Sedan ersätta lösningen i brunnen med 2 mL E8 medium per brunn.
    3. Aspirera använt medlet från källa brunnarna med 1 mL pipett och ersätta med 300 µL 0,5 mm EDTA att tvätta. Aspirera omedelbart med samma pipettspetsen och ersätta med 300 µL 0,5 mm EDTA igen, sedan Inkubera vid RT för 5 min. Aspirera all vätska med 1 mL pipett.
    4. Ställa den 1 mL pipetten till kapacitet, montera en 1 mL wide-bore spets på det och sug upp E8 mediet från målet väl i spetsen. Tvätta den källa iPSC kulturen med en ström av mediet.
    5. Över till målet väl och Pipettera upp och ner flera gånger för att bryta upp kolonier i klumpar av 20-50 celler. Kontrollera att de fördelas jämnt i brunnen av mild gunga och skaka plattan och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
    6. Ändra medium dagligen och passage varje 3 till 4 dagar. Eventuella särskiljande kolonier kan märkas under faskontrastmikroskop och bort med en pipettspetsen i kulturen skåp. Detta möjliggör selektiv förökningen av hög kvalitet ren iPSC kultur.
    7. 1 h innan passaging, coat brunnarna 6-well platta med VTN som i steg 2.2.1. Sedan ersätta lösningen med 2 ml E8 medium per brunn.
    8. Rutinmässig passaging liknar den ursprungliga passaging gjort med 0,5 mM EDTA (steg 2.7.2 till 2.7.5). Ersätta förbrukade medium i ett väl 6-well platta med 1 mL av EDTA att tvätta och kassera.
    9. Tillsätt 1 mL av EDTA och inkubera vid RT i 5-7 min för partiell dissociation. Optimera inkubationstiden om nödvändigt, att se till en suspension av runt 20 - till 50-cell klumpar produceras. Undvika dissociationen till enstaka celler.
    10. Kassera EDTA-lösningen och aspirera 1 mL av E8 medium med 1 mL pipett från målet långt in en wide-bore pipettspetsen.
    11. Tvätta bort den källa iPSC kulturen med en ström av E8 medium upprepade gånger tills en önskad del av det släpptes från ytan och överför till målet väl. Denna del representerar delningsfaktorn (t.ex., 1/8 av kultur kan överföras för förhållandet 1:8.)
    12. Passagen varje 3-4 dagar. Tillåta iPSC linjer att mogna av odla dem för minst 15 passager innan du använder dem i nedströms experiment

3. karakterisering och bekräftelse av pluripotens

Obs: Se kompletterande filer för detaljer på flödescytometri och konfokalmikroskopi.

  1. Teratoma bildandet assay
    1. Så den institutionella politiken avseende djurens vård och användning, planera att ge tid för inlämning av lämpliga protokollet avgör iPSC förmåga att differentieras till vävnader som är representativa för alla tre groddar lager av teratoma bildandet assay dokument. Teratoma bildandet i möss tar mellan 6-10 veckor.
    2. Kultur 4 brunnar i en 6-well platta per iPSC linje i 4 dagar. Det ungefärliga antalet celler injiceras i ena flanken av en mus är 0,5 till 1 x 106 celler. Valfritt: en extra väl kan användas för att fastställa ett representativt cell nummer i en väl genom enstaka cell dissociation med en cell avlossning enzym och räknar.
    3. Beräkna volymen av E8/BMM blandningen iPSC klumpar inaktiveras i: båda sidorna av en mus injiceras, var och en med 150 µL dunge suspension. Tre möss är tillräckliga för att testa teratoma bildande en iPSC-linje. Inkludera en extra 150 µL per nål i den resulterande volymen att kompensera död volymförlust. 1 nål per mus används. Den totala volymen är därför 3 * (150 µL * 2 + 150 µL) = 1350 µL
    4. Delvis avstånd iPSC kolonierna med EDTA som om de skulle vara överförda, som beskrivs i stegen 2.7.8 till 2.7.10. Det är viktigt att kolonierna är separerade i klumpar och inte separeras i enstaka celler.
    5. Tvätta iPSC kolonierna med 675 µL av E8 medium (hälften av den beräknade volymen från steg 3.3.3), använda en wide-bore spets. Över klump till en 5 mL polystyren tub. Placera på is.
    6. Kombinera med 675 µL av BMM. Hålla den resulterande fjädringen på is tills injektionen.
    7. Söva möss för att immobilisera dem med isofluran. Detta bör utföras eller guidad av kunnig personal i ett vivarium.
    8. Vortex 5 mL polystyren röret kort och sug upp dunge suspensionen (450 µL per mus) i en insulinspruta utrustad med en 22 G nål. Injicera 150 µL cellsuspension subkutant. Denna volym innehåller ca 1 x 106 celler (se punkt 3.1.2).
    9. Injicera 3 möss per iPSC linje. Följa ordentlig djurvård praxis för alla förfaranden.
    10. Övervaka hälsan hos möss dagligen.
    11. När Teratom nå en slutpunkt diameter av 1,5 till 2 cm, eutanasi möss, explant Teratom och lagra dem i formalin lösning för vävnad fixering för 24 h.
    12. Ta de fasta Teratom till en histologi core facilitet för hematoxylin eosin (H & E) färgning. En patolog kommer grad förekomsten av vävnader i alla tre groddar lager.
      Anmärkning för Karyotyping: Live iPSC kulturer ska levereras till specialiserade cytogenetiska laboratorier för testning av karyotyp integritet. Det rekommenderas att denna provning utföras varje 5 passager.
  2. Transkriptionell profilering
    1. Kultur 2 brunnar i en 6-well platta i 3-4 dagar för att erhålla en RNA-prov. Använd endast högkvalitativa kulturer, mindre kontaminering med differentiering cellerna kan åtgärdas genom att skrapa dem med ett Pipettera tips.
    2. Isolera RNA från iPSC kulturer använder en kommersiellt tillgänglig kit följande tillverkarens protokoll. Skicka prover till en specialiserad genomisk core facility.
    3. Få de globala transkriptionell profilerna av iPSC raderna med microarrays (se Tabell av material för stöds val) eller RNA-sekvensering.
    4. Skicka ”*.idat” filer för bioinformatiska bedömning av pluripotency via en online-gränssnitt på Coriell Institutet. Alternativt skicka ”* .cel” filer för bioinformatiska identifiering av celltyp, inklusive pluripotenta stamceller, via en online-gränssnitt vid Johns Hopkins University. Se Tabell för material för information om vilka typer av data som de enskilda bioinformatiska analyserna acceptera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Informerade samtycke erhölls från patienter före skörd fostervatten för genetisk testning och ägna en liten delmängd av vätska för forskning. Inget samtycke krävs för användning av fostervatten membranet i forskning som moderkakan representerar medicinskt avfall. Amniotiska vätskan och membran stamceller har typiska mesenkymala visningsegenskaper, morfologiskt deras celler är spolformad och fas-ljusa. Vid omprogrammering, cellerna genomgår mesenkymala-till-epitelial (MET) övergång och förvärva kullersten morfologi och rumsliga organisationen av kolonierna, som anger epitelial boenden. Denna process initieras så tidigt som 48-72 h efter införandet av omprogrammering episomal plasmider. Avsaknad av dessa kolonier av dag 5 av omprogrammering tyder på bristande experimentet. Cellerna i MET kolonierna föröka sig och därmed kolonierna blir kompakt, mellan dag 5 och 14. Kompakt MET kolonier består av celler som inte är lätt individuellt märkbar (figur 1A). På runt dag 14, visas fullt omprogrammerade kolonier med celler arrangerade i en enskiktslager, transporterar framträdande, lätt urskiljbar kärnor och nucleoli. De är redo att mekaniskt isoleras och expanderade när kolonierna når en lämplig storlek och blir kompakt (figur 1B).

Helt och delvis omprogrammeras kolonier är närvarande i kulturerna under hela omplanering perioden, men delvis omprogrammeras kolonier inte nödvändigtvis förvärvar full pluripotency. Figur 2 visar en representant flow flödescytometrisk analys av embryonala stamceller (ESC) markör uttryck i fullt och delvis pluripotenta kolonier och deras motsvarande morfologier. Full pluripotency associeras med uttryck för Oct4, Nanog, Sox2, TRA antigener och SSEA-4, medan SSEA-1 uttryck är negativa19,20,21 (figur 2A). Delvis uttrycker pluripotenta celler, dock inte Nanog och TRA antigener20 (figur 2B). Uttryck och lokalisering av ESC markörer bör bekräftas av immunocytochemical färgning och avbildas med wide-fält eller confocal Mikroskop (figur 3).

En funktionell bekräftelse av pluripotency uppnås genom att visa raderna iPSC förmåga att bilda Teratom efter subkutan injektion av cellerna i scid-beige möss. 6-8 veckor behövs för de Teratom att nå slutpunkten storlek. H & E färgning av vävnader och undersökning av en patolog utförs sedan för att bekräfta förekomsten av vävnader representant för alla tre groddar lager-endoderm, neuroectoderm och mesoderm (figur 4A). Ett alternativ till djurförsök är att analysera den transkriptionell signatur pluripotency av Tillämpningsinriktad inställning som cDNA microarrays22,23. Andelen av transkriptionell profilen som överlappar med en av en pool av väletablerade iPSC och ESC rader kan sedan kvantifieras av programvaran online bioinformatiska pluripotency utvärdering i form av en tomt på två klassificerare – pluripotency och nyhet (figur 4B). Ju högre pluripotency poäng, den mer fråga iPSC raden liknar de etablerade linjerna. En hög nyhet poäng, dock bero på avvikelser eller ens kromosomavvikelser, trots en hög pluripotency Poäng (t.ex. i teratocarcinoma linjer)22. Alla iPSC rader genereras genom att följa de protokoll som presenteras här har bedömts pluripotenta av flödescytometri, imaging, teratoma bildandet och transkriptionell analysmetoder.

Figure 1
Figur 1: morfologiska progression av celler under omprogrammering. (A) de fostervatten och membran stamceller, som företräder källcellerna för omprogrammering, visar en typisk mesenkymala morfologi, långsträckt och fas-ljus (vänster) tills de genomgår mesenkymala-till-epitelial övergången (MET) som leder till förvärv av epitelial boenden och bildandet av kolonier med cobble sten-liknande celler (center). Dessa kolonier föröka sig och skapa oregelbundna cellulära massor av MET celler (höger). (B) på de senare stadierna av omprogrammering (start från runt dag 14), kolonier av fullt Omstyrda celler växa fram – individuellt märkbar celler med framstående kärnor och nucleoli ordnade i enskiktslager, med väldefinierade gränser (i mitten) – och är närvarande tillsammans med MET kolonier som är talrikare (vänster). En helt omprogrammeras isolerade mogen klon avbildas till höger. Skalstapeln = 100 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Flow flödescytometrisk analys av uttryck för ESC markörer i helt och delvis (MET) omprogrammeras cell kolonier. (A) den pluripotenta uttryck profilen är positivt för Oct4, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81 och SSEA-4, medan negativa för SSEA-1. (B) pluripotenta celler kolonier – de som har genomgått MET men misslyckades att gå vidare till full pluripotency – är delvis positivt för Oct4 och Sox2 men Nanog och TRA SSEA antigener är frånvarande. De associerade morfologier ingår för sida-vid-sida jämförelse. Skala barer = 200 µm och 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Confocal imaging analys av uttryck för ESC markörer i mogen amniotiska vätskan iPSC. Transkriptionsfaktorer Oct3/4A, Nanog och Sox2 är lokaliserade i kärnor medan TRA och SSEA antigener är glykoproteiner lokaliserade på membranet. Skalstapeln = 50 µm. bilder av större förstoring (2 X Merge) inkluderades för Oct3/4, Nanog och Sox2 för bättre visualisering av deras cellkärnelokalisering. Skalstapeln = 25 µm. överförbara – bilder förvärvade den genomlysning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Teratoma bildandet och transkriptionell profilering i mogen amniotiska vätskan och membran iPSC. (A) Teratom odlas i scid-beige möss subkutant innehåller vävnader representativa för alla tre groddar lager (100 X förstoring). (B) de globala uttryck microarray profilerna lämnas till online pluripotency programvara återvände en tomt på två klassificerare – pluripotency och nyhet. Hög pluripotency noter och låg nyhet noter - röda moln - ange ett uttryck profil av en typisk ESC/iPSC-linje. Blå molnet representerar ett kluster område för differentierade celler, medan svaga blå molnet representerar ett kluster område för delvis pluripotenta celler. De fostervatten (3 rader) och membran (4 rader) iPSC ansågs pluripotenta av testet. En ESC linje WA25 ingick som en kontroll och identifieras här med en svart pil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den inledande fasen av iPSC generation från fetala stamceller medför utvinning av källcellerna från fostrets vävnader, deras kultur, expansion och införandet av de episomal omprogrammering plasmidsna. Denna fas följs av en kultur runt 14-18 dagar innan de första helt omprogrammeras kolonierna kan utökas. Den sista fasen är mognaden av iPSC klonerna. Initial utvinning av fostervatten membran stamceller uppnås genom en kombinerad mekanisk och enzymatisk nedbrytning av amnionen. Vi hittade som en inkubationstid av 30 min resulterade i det högsta antalet celler utvinns med den högsta lönsamheten. Förfarandet för matsmältningen kan producera små bitar av vävnads- och klumpar. Om andelen av dessa i förhållande till enstaka celler är hög, rekommenderar vi plätering alla klumpar och enstaka celler till ett kärl eftersom alla kan bidra till utväxter av vidhäftande celler. Plätering amniotiska vätskan stamceller är okomplicerat som cellerna endast blandas med odlingssubstrat och inkuberas tills kolonier av vidhäftande celler når en tillräcklig storlek. Regelbundna vävnadsodling-behandlade plasticware är perfekt och vi rekommenderar inte specialitet ytor, även om de är avsedda för förbättrad primär cellkultur, sedan med dessa vi observerat lägre förmåga och svårigheter med den passaging processen.

Amniotiska vätskan och membran stammen celler bör utvidgas och lager frysta men på den tidigaste bekvämligheten, cellerna kan användas som källa celler för omprogrammering. I syfte att införandet av de episomal plasmidsna i cellerna, transfection systemet används här med transfection parametrar anges till 950 V, har 40 ms, och 1 puls presterat väldigt bra, med alla rader försökt ytterst framgångsrikt omprogrammerade) över 10 linjer). Den huvudsakliga konkurrerande leveranssystem som opererar på en liknande princip producerar inte ett framgångsrikt omplanering experiment i våra händer.

De transfekterade cellerna är seedade på Aktiebolaget Trav & galopp-belagd rätter i AFMC medium för de första 3-5 dagarna, då mediet är bytt till E8 kompletteras med 100 µM natrium butyrate. Detta ökar andelen full pluripotency förvärv. De första tecknen på morfologiska transformation kan ses så tidigt som 48-72 h. Källcellerna genomgår MET och kolonier av celler med epitelial morfologi visas. Dessa gradvis föröka sig och bli kompakt. En delmängd av kolonierna kommer att förvärva de morfologiska egenskaperna fullt pluripotenta stamceller – individuellt märkbar celler med framstående kärnor och nucleoli, observerats platta kolonier med väldefinierade gränser, i motsats till de luddiga gränserna i delvis pluripotenta MET kolonier. Vid tidpunkten för förvärvet av full pluripotens, kompakt MET cell kolonierna förvärva framstående kärnor och de enskilda cellerna blir märkbar när du skapar ett unikt morfologiska mönster. Att ett tränat öga är detta mönster ett tydligt tecken på framgångsrika omprogrammering. Att en utredare som saknar PSC kulturutbildning, kräver identifiering av kolonier som framgångsrikt har nått full pluripotency dock noggrann utvärdering som MET och iPSC kloner kan misstas för varandra. Figur 1 och figur 2 ger exempel på båda. Om MET kloner plockas istället, grundlig Flödesanalys flödescytometri kommer att avslöja misstaget och i synnerhet de TRA-1-60 och TRA-1-81 antigenerna sannolikt kommer att vara frånvarande som visas i figur 2. TRA antigener befanns faktiskt tidigare vara stränga pluripotency markörer. Dock kan delvis pluripotenta MET celler vara av intresse för cancer forskning25.

Kultur är detta suboptimal för källa AFSC/AMSC och så småningom deras spridning kommer att sakta ner och de kommer att förvärva en plattare, fibroblast-liknande morfologi. Källcellerna bildar vävnader som kan lossna från ytan under de senare stadierna av omprogrammering, även om detta inte negativt påverkar omplanering processen. Tvärtom leder processen ibland till befriande upp utrymme för reprogrammerade kolonierna, samtidigt som det eliminerar oönskade un-omprogrammerade cellulära material. Fristående vävnader kan lätt kastas med hjälp av en steril pipettspetsen, lämnar delvis och helt pluripotenta kolonier bakom, vilket förenklar manuellt val nedströms.

För manuell plockning av fullt omprogrammerade kolonierna använder vi en LCD imaging system, som kan placeras i skåpet säkerhet, saknas några delar som sticker ut som skulle störa luftflödet. Än detta imaging system behövs ingen speciell utrustning som att plocka själv kan utföras med regelbundna pipetter. De plocka kolonierna dissocieras delvis i EDTA/PBS lösning innan att vara klädd i målet brunnar växa ut som kloner. Beroende på raden och klonen, för flera passager, kan kulturer vara kontaminerade med spontant skilja celler. Manuell manipulation och seriell passaging eliminera oftast detta problem. Kloner översållad med omfattande differentiering ska kasseras, men dyrbara kloner kan räddas med olika grader av framgång med hjälp av upprepade manuell plockning av pluripotenta kolonier i stället för att avyttra skilja celler. Episomal plasmider visades att ta cirka 15 passager försvinner helt från den iPSC26. Därför är det tillrådligt att tillåta klonerna att växa för minst det antalet passager innan du använder dem för nedströms tillämpningar och analyser, med undantag för rutinmässig övervakning av TRA antigen uttryck och karyotyp. TRA antigen uttryck kan enkelt övervakas av flödescytometri som beskrivs här i protokollet, eftersom analysen endast kräver cirka 200 000 celler, och kan utföras när forskarna är i tvivel om huruvida de odlade klonerna är att upprätthålla pluripotency ordentligt. Flödesanalys flödescytometri av ESC markör uttrycket anses inte vara tillräckligt för att bekräfta pluripotency i kandidat linjer19.

Teratoma bildandet analysen är det standard avgörande pluripotency test27. PSC odlas i kemiskt definierade, xeno-fri villkor är särskilt mottagliga för dissociation-inducerad död och därför att injicera dem subkutant som klumpar är nödvändigt för deras lyckad implantation8,28. Efter injektion, vanligen 4-6 veckor är nog för tillväxten av xeno-grafterna ska vara synlig och innan vecka 8, alla kan skördas, H & E-färgade och analyserade. Djurskydd, kostnad och lång testning perioder behövs är skäl att utveckla alternativa metoder. Genomiska analyser kombineras med avancerade, machine learning-drivna bioinformatiska metoder kan ge en korrekt utvärdering av globala uttryck profiler. Kostnaden för att erhålla sådana uppgifter är jämförbar med kostnaden för teratoma bildandet analysen, dock det genomiska tillvägagångssättet är betydligt snabbare och inga djur måste användas. En sådan analys är en bioinformatiska pluripotency utvärdering programvara22. Det är implementerat som en online-gränssnitt (Tabell för material). Den växande populariteten och sjunkande kostnaden av RNA-sekvensering kommer att kontinuiteten i denna strategi. Ett alternativ till denna pluripotency programvara är tillgänglig från Johns Hopkins University23 (cellnet.hms.harvard.edu) och är baserad på en liknande strategi och kan acceptera microarray data för att analysera transkriptom mänskliga prover. Fördelen med denna programvara är att det har förmågan att identifiera inte bara pluripotenta stamceller men också differentierade celler och, sedan dess kurator datamängder härleddes från primära vävnader, nivån på likheten mellan i-vitro odlade celler / vävnader och in vivo - vävnader kan vara beslutsam, som ger en utmärkt kvalitetskontroll för utveckling av differentiering protokoll eller vävnadsteknik. Testet har kapacitet att klassificera frågor i 20 olika cell eller vävnadstyper. För närvarande kräver det microarray data men författarna arbetar mot expanderande alternativen plattform till RNA sekvensering samt.

Genom att följa protokollet presenteras, kan forskare generera iPSC linjer från fostervatten vätska och membran stamceller med en mycket hög reproducerbarhet i helt kemiskt definierade och xeno-fri medium och med en icke-integrering omplanering metod. Dessa rader kan användas i grundforskning att optimera differentiering protokoll och slutligen vid sjukdom modellering, drug screening eller pediatric Vävnadsrekonstruktion studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av en Fonds Medizinische Forschung vid universitetet i Zürich, Forschungskredit av universitetar av Zurich, The SCIEX NMSCh under stipendier 10.216 och 12.176, den schweiziska kardiologföreningen, The Swiss National Science Stiftelsen under Grant [320030-122273] och [310030-143992], den 7: e ramprogrammet, liv ventil, Europeiska kommissionen under Grant [242008], Olga Mayenfisch stiftelsen, Stiftelsen Ingrid, startpeng 2012 av Universitetssjukhuset Zürich, och intern finansiering för Mitchell Cancer Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 tissue dissociation system, dissociator
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) Thermo-Fisher 3120032
70 µm cell strainers Corning 10054-456
RPMI 1640 medium Thermo-Fisher 32404014 
rocking platform VWR 40000-300
50 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339652
15 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339650
EBM-2 basal medium Lonza CC-3156 basal medium for AFMC medium
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) Prospec Bio CYT-218 bFGF, supplement for AFMC medium
EGF Human, Pichia Prospec Bio CYT-332  EGF, supplement for AFMC medium
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant Prospec Bio CYT-022 IGF, supplement for AFMC medium
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified Thermo-Fisher 10439024 FBS
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo-Fisher 15240062  for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!
Accutase cell detachment solution StemCell Technologies 07920 cell detachment enzyme
CryoStor™ CS10 StemCell Technologies 07930 complete freezing medium
PBS, pH 7.4 Thermo-Fisher Scientific 10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362 for plasmid isolation
pEP4 E02S EN2K Addgene 20925 EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2K Addgene 20927 ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2L Addgene 20926 M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000C spectrophotometer
Neon® Transfection System Thermo-Fisher MPK5000 transfection system, components:
Neon pipette - transfection pipette
Neon device - transfection device
Neon® Transfection System 10 µL Kit Thermo-Fisher MPK1025 consumables kit for the Neon Transfection System, it contains:
Neon tip - transfection tip
Neon tube - transfection tube
buffer R - resuspension buffer
buffer E - electrolytic buffer
Stemolecule™ Sodium Butyrate StemGent 04-0005 small molecule enhancer of reprogramming
TeSR-E8 StemCell Technologies 05940 E8 medium
Vitronectin XF™ StemCell Technologies 07180 VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer
CellAdhere™ Dilution Buffer StemCell Technologies 07183 vitronectin dilution buffer
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 dilute with PBS to 0.5 mM before use
EVOS® FL Imaging System Thermo-Fisher Scientific AMF4300 LCD imaging microscope system
CKX53 Inverted Microscope Olympus phase contrast cell culture microscope
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo-Fisher 28908 dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week
Perm Buffer III BD Biosciences 558050 permeabilization buffer, chill to -20 °C before use
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 557782 isotype control for Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 557783 isotype control for Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 562139
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 401617 isotype control for TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401618 isotype control for TRA-1-81
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 330613
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330705
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 400129 isotype control for SSEA-1
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401321 isotype control for SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 323010
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 Jackson Immunoresearch 115-606-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 Jackson Immunoresearch 115-546-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
DAPI Thermo-Fisher Scientific D21490 stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution
Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free Corning 356231 basement membrane matrix (BMM)
scid-beige mice, female Taconic CBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50) Qiagen 74134 RNA isolation kit
T-25 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156367
T-75 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156499
Nunc™ tissue-culture dish Thermo-Fisher 12-567-650  10 cm tissue culture dish
6-well plates, tissue-culture treated Thermo-Fisher 140675
Neubauer counting chamber (hemacytometer) VWR 15170-173
Mr. Frosty™ Freezing Container Thermo-Fisher 5100-0001  freezing container
FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml Corning 352058 5 ml polystyrene tubes
Eppendorf tubes, 1.5 ml Thermo-Fisher 05-402-96 1.5 ml microcentrifuge tubes
PCR tubes, 200 µl Thermo-Fisher 14-222-262
pipette tips, 100 to 1250 µl Thermo-Fisher 02-707-407 narrow-bore 1 mL tips
pipette tips, 5 to 300 µl Thermo-Fisher 02-707-410
pipette tips, 0.1 to 10 µl Thermo-Fisher 02-707-437
wide-bore pipette tips, 1000 µl VWR 89049-166 wide-bore 1 mL tips
glass Pasteur pipettes Thermo-Fisher 13-678-20A
ethanol, 200 proof Thermo-Fisher 04-355-451
vortex mixer VWR 10153-842
chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass Thermo-Fisher 155409 glass-bottom confocal-grade cultureware
22G needles VWR 82002-366
insulin syringes Thermo-Fisher 22-253-260
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixation of explanted teratomas
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip Illumina BD-103-0204 expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer
PrimeView Human Genome U219 Array Plate Thermo-Fisher 901605 expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array Thermo-Fisher 902482 expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest
PluriTest® Coriell Institute www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data
CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, (3), 194-200 (2016).
  4. Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116, (11 Suppl), I64-I70 (2007).
  5. Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
  6. Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33, (16), 4031-4043 (2012).
  7. Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25, (4), 300-305 (2016).
  8. Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15, (2), 234-249 (2016).
  9. Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23, (21), 2613-2625 (2014).
  10. Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16, (5), 331-344 (2014).
  11. Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285, (15), 11227-11234 (2010).
  12. Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21, (15), 2798-2808 (2012).
  13. Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6, (1), (2015).
  14. Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19, (8), 517-522 (2012).
  15. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20, (10), 1953-1967 (2012).
  16. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, (7313), 285-290 (2010).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  18. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, (5928), 797-801 (2009).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8, (2), 223-253 (2013).
  20. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27, (11), 1033-1037 (2009).
  21. Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, (7), 803-816 (2007).
  22. Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8, (4), 315-317 (2011).
  23. Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158, (4), 903-915 (2014).
  24. Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25, (3), 723-730 (2007).
  25. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156, (4), 663-677 (2014).
  26. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33, (1), 58-63 (2014).
  27. Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6, (5), 412-414 (2010).
  28. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7, (11), 2029-2040 (2012).
Omprogrammering primära fostervatten och membran celler att Pluripotency Xeno-fria förhållanden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).More

Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter