Summary

Omprogrammering primära fostervatten och membran celler att Pluripotency Xeno-fria förhållanden

Published: November 27, 2017
doi:

Summary

Det här protokollet beskriver omprogrammering av primära amniotiska vätskan och membran mesenkymala stamceller till inducerade pluripotenta stamceller med en icke-integrerande episomal metod i helt kemiskt definierade villkor. Förfaranden utvinning, kultur, omprogrammering och karakterisering av de resulterande inducerade pluripotenta stamcellerna av stränga metoder är detaljerade.

Abstract

Autologa cellbaserade terapier fick ett steg närmare verkligheten med införandet av inducerade pluripotenta stamceller. Fetala stamceller, såsom fostervatten och membran mesenkymala stamceller, representerar en unik typ av odifferentierade celler med löfte i vävnadsteknik och för omprogrammering i iPSC för framtida pediatric interventioner och stamceller bank. Det protokoll som presenteras här beskriver en optimerad förfarandet för att extrahera och odlingsskålar primära amniotiska vätskan och membran mesenkymala stamceller och generera episomal inducerade pluripotenta stamceller från dessa celler i helt kemiskt definierade kultur villkor utnyttja mänskliga rekombinant Aktiebolaget Trav & galopp och E8 medium. Karakterisering av de nya raderna genom att tillämpa stränga metoder – flödescytometri, confocal imaging, teratoma bildandet och transkriptionell profilering – beskrivs också. De nyligen genererade linjerna express markörer av embryonala stamceller – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – samtidigt vara negativa för den SSEA-1. Stamcellslinjer bildar Teratom i scid-beige möss i 6-8 veckor och Teratom innehåller vävnader representativa för alla tre groddar lager. Transkriptionell profilering av rader av microarray datasändning i globala uttryck till ett bioinformatiska pluripotency bedömning algoritmen anses alla linjer pluripotenta och därför detta synsätt är ett attraktivt alternativ till djurförsök. De nya iPSC linjerna kan lätt användas i nedströms experiment med optimering av differentiering och tissue engineering.

Introduction

Tekniken för inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) medför potentiella ersättare cellterapi, sjukdom och utvecklingsmässiga modellering, och drog och toxikologisk screening1,2,3. Ersättning terapier kan begreppsmässigt uppnås genom cell injektionen, in vitro differentierade vävnad (såsom hjärt patchar) implantation eller guidade regenerering genom vävnadsteknik. Fostervatten (AFSC) och membran stamceller (AMSC) är en utmärkt källa av celler för dessa insatser antingen direkt4,5,6,7 eller som en start cell befolkningen för omprogrammering till pluripotens8,9,10,11,12.

Tidiga metoder används odefinierad kultur system eller omprogrammering metoder som kräver innebär genomisk integration av konstruerar9,10,11,12. En senare studie anställd en xeno-fri medium, även om en mindre definierade basalmembranet fastsättning matris (BMM) användes, att generera iPSC från fostervatten vätska epitelceller. Teratoma bildandet analysen ingick dock inte i studien tillsammans med en rikedom av in vitro- och molekylära data. Fostervatten vätska epitelceller konstaterades ha en ungefär 8-faldigt högre omplanering effektivitet jämfört med neonatal fibroblaster13. En annan studie hittades också mesenkymala stamceller från fostervatten omprogrammeras till iPSC med en mycket högre effektivitet12.

Pluripotenta stamceller kan göras åtskillnad mellan in i vävnader representant för alla 3 groddar lager och således har den bredaste potentialen. Pediatriska patienter kunde dra nytta av skörd, omprogrammering och vävnadsteknik deras autolog amniotiska vätskan stamceller prenatalt och fostervatten membran stamceller perinatalt. Dessutom kunde relativt låga grad av differentiering av fetala stamceller (lägre än adulta stamceller14,15) teoretiskt stöd i att hantera observerade lagring av epigenetiska bias från källcellerna i iPSC16.

Presenterar här vi ett protokoll för omprogrammering fostervatten och membran stamceller till pluripotens i kemiskt definierade xeno-fri E8 medium på rekombinant Aktiebolaget Trav & galopp17 (VTN) använder episomal plasmider18. Den största fördelen med fostervatten vätska och membran celler som en källa av celler för omprogrammering ligger i deras tillgänglighet före och perinatalt och därmed denna metod främst skulle gynna forskningen in pediatric vävnadsteknik.

Protocol

Protokollet följer institutionella riktlinjer av den etiska kommittén för mänsklig forskning. Skriftligt medgivande av patienten erhölls för att använda fostervattnet för forskning. Detta protokoll följer politiken som den institutionella djur vård och användning kommittén av University of South Alabama. 1. isolering och kultur av primära fostervatten mesenkymala stamceller Plätering av fostervatten flytande celler <li…

Representative Results

Informerade samtycke erhölls från patienter före skörd fostervatten för genetisk testning och ägna en liten delmängd av vätska för forskning. Inget samtycke krävs för användning av fostervatten membranet i forskning som moderkakan representerar medicinskt avfall. Amniotiska vätskan och membran stamceller har typiska mesenkymala visningsegenskaper, morfologiskt deras celler är spolformad och fas-ljusa. Vid omprogrammering, cellerna genomgår mesenkymala-till-epitelial (MET) ?…

Discussion

Den inledande fasen av iPSC generation från fetala stamceller medför utvinning av källcellerna från fostrets vävnader, deras kultur, expansion och införandet av de episomal omprogrammering plasmidsna. Denna fas följs av en kultur runt 14-18 dagar innan de första helt omprogrammeras kolonierna kan utökas. Den sista fasen är mognaden av iPSC klonerna. Initial utvinning av fostervatten membran stamceller uppnås genom en kombinerad mekanisk och enzymatisk nedbrytning av amnionen. Vi hittade som en inkubationstid a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av en Fonds Medizinische Forschung vid universitetet i Zürich, Forschungskredit av universitetar av Zurich, The SCIEX NMSCh under stipendier 10.216 och 12.176, den schweiziska kardiologföreningen, The Swiss National Science Stiftelsen under Grant [320030-122273] och [310030-143992], den 7: e ramprogrammet, liv ventil, Europeiska kommissionen under Grant [242008], Olga Mayenfisch stiftelsen, Stiftelsen Ingrid, startpeng 2012 av Universitetssjukhuset Zürich, och intern finansiering för Mitchell Cancer Institute.

Materials

Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 tissue dissociation system, dissociator
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) Thermo-Fisher 3120032
70 µm cell strainers Corning 10054-456
RPMI 1640 medium Thermo-Fisher 32404014 
rocking platform VWR 40000-300
50 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339652
15 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339650
EBM-2 basal medium Lonza CC-3156 basal medium for AFMC medium
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) Prospec Bio CYT-218 bFGF, supplement for AFMC medium
EGF Human, Pichia Prospec Bio CYT-332  EGF, supplement for AFMC medium
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant Prospec Bio CYT-022 IGF, supplement for AFMC medium
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified Thermo-Fisher 10439024 FBS
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo-Fisher 15240062  for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!
Accutase cell detachment solution StemCell Technologies 07920 cell detachment enzyme
CryoStor™ CS10 StemCell Technologies 07930 complete freezing medium
PBS, pH 7.4 Thermo-Fisher Scientific 10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362 for plasmid isolation
pEP4 E02S EN2K Addgene 20925 EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2K Addgene 20927 ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2L Addgene 20926 M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000C spectrophotometer
Neon® Transfection System Thermo-Fisher MPK5000 transfection system, components:
Neon pipette – transfection pipette
Neon device – transfection device
Neon® Transfection System 10 µL Kit Thermo-Fisher MPK1025 consumables kit for the Neon Transfection System, it contains:
Neon tip – transfection tip
Neon tube – transfection tube
buffer R – resuspension buffer
buffer E – electrolytic buffer
Stemolecule™ Sodium Butyrate StemGent 04-0005 small molecule enhancer of reprogramming
TeSR-E8 StemCell Technologies 05940 E8 medium
Vitronectin XF™ StemCell Technologies 07180 VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer
CellAdhere™ Dilution Buffer StemCell Technologies 07183 vitronectin dilution buffer
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 dilute with PBS to 0.5 mM before use
EVOS® FL Imaging System Thermo-Fisher Scientific AMF4300 LCD imaging microscope system
CKX53 Inverted Microscope Olympus phase contrast cell culture microscope
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo-Fisher 28908 dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week
Perm Buffer III BD Biosciences 558050 permeabilization buffer, chill to -20 °C before use
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 557782 isotype control for Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 557783 isotype control for Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 562139
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 401617 isotype control for TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401618 isotype control for TRA-1-81
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 330613
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330705
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 400129 isotype control for SSEA-1
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401321 isotype control for SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 323010
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 Jackson Immunoresearch 115-606-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 Jackson Immunoresearch 115-546-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
DAPI Thermo-Fisher Scientific D21490 stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution
Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free Corning 356231 basement membrane matrix (BMM)
scid-beige mice, female Taconic CBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50) Qiagen 74134 RNA isolation kit
T-25 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156367
T-75 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156499
Nunc™ tissue-culture dish Thermo-Fisher 12-567-650  10 cm tissue culture dish
6-well plates, tissue-culture treated Thermo-Fisher 140675
Neubauer counting chamber (hemacytometer) VWR 15170-173
Mr. Frosty™ Freezing Container Thermo-Fisher 5100-0001  freezing container
FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml Corning 352058 5 ml polystyrene tubes
Eppendorf tubes, 1.5 ml Thermo-Fisher 05-402-96 1.5 ml microcentrifuge tubes
PCR tubes, 200 µl Thermo-Fisher 14-222-262
pipette tips, 100 to 1250 µl Thermo-Fisher 02-707-407 narrow-bore 1 mL tips
pipette tips, 5 to 300 µl Thermo-Fisher 02-707-410
pipette tips, 0.1 to 10 µl Thermo-Fisher 02-707-437
wide-bore pipette tips, 1000 µl VWR 89049-166 wide-bore 1 mL tips
glass Pasteur pipettes Thermo-Fisher 13-678-20A
ethanol, 200 proof Thermo-Fisher 04-355-451
vortex mixer VWR 10153-842
chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass Thermo-Fisher 155409 glass-bottom confocal-grade cultureware
22G needles VWR 82002-366
insulin syringes Thermo-Fisher 22-253-260
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixation of explanted teratomas
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip Illumina BD-103-0204 expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer
PrimeView Human Genome U219 Array Plate Thermo-Fisher 901605 expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array Thermo-Fisher 902482 expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest
PluriTest® Coriell Institute www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data
CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
  4. Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
  5. Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
  6. Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
  7. Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
  8. Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
  9. Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  10. Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
  11. Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
  12. Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
  13. Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
  14. Kang, N. -. H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
  15. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  16. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  20. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  21. Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  22. Müller, F. -. J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
  23. Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
  24. Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
  25. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  26. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
  27. Müller, F. -. J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
  28. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).

Play Video

Cite This Article
Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).

View Video