Summary

Reprogrammation du liquide amniotique primaire et cellules de Membrane de pluripotence dans des Conditions sans Xeno

Published: November 27, 2017
doi:

Summary

Ce protocole décrit la reprogrammation des primaires amniotique fluide et membrane de cellules souches mésenchymateuses sur les cellules souches pluripotentes induites en utilisant une approche épisomiques sans intégration dans des conditions totalement chimiquement définies. Les procédures d’extraction, la culture, la reprogrammation et la caractérisation des cellules souches pluripotentes induites qui en résulte par une méthodologie rigoureuse sont reprises.

Abstract

Thérapies à base cellulaire autologues obtenu un pas de plus vers la réalité avec l’introduction de cellules souches pluripotentes induites. Les cellules souches fœtales, tels que le liquide amniotique et la membrane des cellules souches mésenchymateuses, représentent un type unique de cellules non différenciées avec promesse en génie tissulaire et de reprogrammation en iPSC pour futures interventions pédiatriques et cellules souches bancaire. Le protocole présenté ici décrit une méthode optimisée pour l’extraction et la mise en culture primaire amniotique fluide et membrane de cellules souches mésenchymateuses et générant épisomiques induite par les cellules souches pluripotentes de ces cellules en culture entièrement chimiquement définie conditions utilisant la vitronectine recombinante humaine et le milieu E8. Caractérisation des nouvelles lignes en appliquant des méthodes rigoureuses – cytométrie en flux, imagerie confocale, formation de tératome et profilage transcriptionnel – est également décrite. Les lignes nouvellement générés expriment des marqueurs de cellules souches embryonnaires – Oct3/4 a, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – tout en étant négatif pour le marqueur SSEA-1. Les lignées de cellules souches forment des tératomes chez la souris scid-beige dans 6 à 8 semaines et les tératomes contiennent des tissus représentatifs de tous les trois couches de germe. Profilage transcriptionnel des lignes par envoi de données microarray expression globale à un algorithme d’évaluation de pluripotence bioinformatic réputé toutes les lignes pluripotentes et par conséquent, cette approche est une alternative intéressante à l’expérimentation animale. Les nouvelles lignes iPSC utilisable facilement en aval expériences portant sur l’optimisation de la différenciation et l’ingénierie tissulaire.

Introduction

La technologie des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) apporte sur les thérapies de remplacement cellulaire potentielle, maladie et modélisation du développement et drogues dépistage toxicologique1,2,3. Les thérapies de remplacement est possible sur le plan conceptuel par injection de cellules, différenciées implantation tissulaire (par exemple cardiaque “patches”), in vitro, ou régénération guidée au moyen de l’ingénierie tissulaire. Liquide amniotique (AFSC) et la membrane des cellules souches (AMSC) sont une excellente source de cellules pour ces interventions soit directement4,5,6,7 ou comme une population de cellules de départ pour la reprogrammation dans la pluripotence8,9,10,11,12.

Premières approches utilisées systèmes de culture non défini ou reprogrammation méthodes nécessitant l’intégration génomique comportent des constructions9,10,11,12. Une étude plus récente a employé un milieu exempt de xeno, même si une matrice d’attachement membrane basale moins définie (BMM) a utilisé, pour générer l’iPSC de cellules épithéliales du fluides amniotique. Cependant, l’analyse de formation tératome ne figurait pas dans l’étude avec une richesse d’in vitro et les données moléculaires. Cellules épithéliales fluides amniotiques ont été trouvés pour avoir une plus grande efficacité reprogrammation environ 8 fois par rapport aux fibroblastes néonatale13. Dans une autre étude, les cellules souches mésenchymateuses du liquide amniotique se retrouvent également à être reprogrammé dans iPSC avec un beaucoup l’efficacité supérieure12.

Cellules souches pluripotentes peuvent être différenciées en représentant de tissus de tous les 3 couches de germe et donc le potentiel plus large. Les patients pédiatriques pourraient bénéficier de la récolte, la reprogrammation et l’ingénierie tissulaire de leurs cellules de tige fluides amniotiques autologues avant la naissance et cellules de membrane amniotique souches durant la période périnatale. En outre, le niveau relativement faible de la différenciation de cellules souches fœtales (inférieurs à14,de cellules souches adultes15) pourrait théoriquement aider dans la lutte contre la rétention observée de partialité épigénétique des cellules source l’iPSC16.

Nous présentons un protocole pour la reprogrammation du liquide amniotique et membranaires des cellules souches pluripotence dans défini chimiquement milieu E8 xeno-sans le recombinant vitronectine17 (VTN) à l’aide de plasmides épisomiques18. Le principal avantage des cellules du liquide et la membrane amniotique comme source de cellules pour la reprogrammation réside dans leur disponibilité avant et Pendant la période périnatale et donc cette démarche profiterait principalement recherche en génie tissulaire pédiatrique.

Protocol

Le protocole suit les directives institutionnelles du Comité d’éthique pour la recherche. Consentement écrit du patient a été obtenue pour utiliser le liquide amniotique pour la recherche. Ce protocole suit les politiques de l’animalier institutionnel et le Comité d’urbanisme de l’Université de South Alabama. 1. isolement et Culture des cellules souches mésenchymateuses primaires amniotique Placage de cellules du liquides amniotiqu…

Representative Results

Consentement éclairé a été obtenu chez les patients avant la récolte du liquide amniotique pour des fins de tests génétiques et de consacrer une petite aliquote du liquide pour la recherche. Aucun consentement n’est requis pour l’utilisation de la membrane amniotique dans la recherche car le placenta représente les déchets médicaux. Des cellules de tige de fluide et membrane amniotique Afficher Propriétés mésenchymateuses typiques, morphologiquement leurs cellules sont fu…

Discussion

La phase initiale de l’iPSC génération de cellules souches fœtales implique l’extraction de cellules source dans les tissus fœtaux, leur culture, expansion et introduction des plasmides reprogrammation épisomiques. Cette phase est suivie d’une période de culture d’environ 14 à 18 jours avant que les premières colonies entièrement reprogrammés peuvent être étendus. La phase finale est la maturation des clones iPSC. L’extraction initiale de cellules souches de membrane amniotique se faite au moyen d?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Fonds Medizinische Forschung à l’Université de Zurich, Forschungskredit de l’Université de Zurich, la NMS SCIEXCh sous ° 10.216 bourses et 12.176, The Swiss Society of Cardiology, The Swiss National Science Fondation au titre de la subvention [320030-122273] et [310030-143992], le 7e Programme-cadre, la soupape de vie, la Commission européenne au titre de la subvention [242008], la Fondation de Mayenfisch Olga, la Fondation EMDO, la subvention de démarrage 2012 de l’hôpital universitaire de Zurich, et le financement interne de l’Institut de Cancer de Mitchell.

Materials

Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 tissue dissociation system, dissociator
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) Thermo-Fisher 3120032
70 µm cell strainers Corning 10054-456
RPMI 1640 medium Thermo-Fisher 32404014 
rocking platform VWR 40000-300
50 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339652
15 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339650
EBM-2 basal medium Lonza CC-3156 basal medium for AFMC medium
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) Prospec Bio CYT-218 bFGF, supplement for AFMC medium
EGF Human, Pichia Prospec Bio CYT-332  EGF, supplement for AFMC medium
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant Prospec Bio CYT-022 IGF, supplement for AFMC medium
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified Thermo-Fisher 10439024 FBS
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo-Fisher 15240062  for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!
Accutase cell detachment solution StemCell Technologies 07920 cell detachment enzyme
CryoStor™ CS10 StemCell Technologies 07930 complete freezing medium
PBS, pH 7.4 Thermo-Fisher Scientific 10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362 for plasmid isolation
pEP4 E02S EN2K Addgene 20925 EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2K Addgene 20927 ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2L Addgene 20926 M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000C spectrophotometer
Neon® Transfection System Thermo-Fisher MPK5000 transfection system, components:
Neon pipette – transfection pipette
Neon device – transfection device
Neon® Transfection System 10 µL Kit Thermo-Fisher MPK1025 consumables kit for the Neon Transfection System, it contains:
Neon tip – transfection tip
Neon tube – transfection tube
buffer R – resuspension buffer
buffer E – electrolytic buffer
Stemolecule™ Sodium Butyrate StemGent 04-0005 small molecule enhancer of reprogramming
TeSR-E8 StemCell Technologies 05940 E8 medium
Vitronectin XF™ StemCell Technologies 07180 VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer
CellAdhere™ Dilution Buffer StemCell Technologies 07183 vitronectin dilution buffer
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 dilute with PBS to 0.5 mM before use
EVOS® FL Imaging System Thermo-Fisher Scientific AMF4300 LCD imaging microscope system
CKX53 Inverted Microscope Olympus phase contrast cell culture microscope
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo-Fisher 28908 dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week
Perm Buffer III BD Biosciences 558050 permeabilization buffer, chill to -20 °C before use
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 557782 isotype control for Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 557783 isotype control for Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 562139
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 401617 isotype control for TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401618 isotype control for TRA-1-81
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 330613
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330705
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 400129 isotype control for SSEA-1
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401321 isotype control for SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 323010
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 Jackson Immunoresearch 115-606-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 Jackson Immunoresearch 115-546-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
DAPI Thermo-Fisher Scientific D21490 stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution
Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free Corning 356231 basement membrane matrix (BMM)
scid-beige mice, female Taconic CBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50) Qiagen 74134 RNA isolation kit
T-25 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156367
T-75 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156499
Nunc™ tissue-culture dish Thermo-Fisher 12-567-650  10 cm tissue culture dish
6-well plates, tissue-culture treated Thermo-Fisher 140675
Neubauer counting chamber (hemacytometer) VWR 15170-173
Mr. Frosty™ Freezing Container Thermo-Fisher 5100-0001  freezing container
FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml Corning 352058 5 ml polystyrene tubes
Eppendorf tubes, 1.5 ml Thermo-Fisher 05-402-96 1.5 ml microcentrifuge tubes
PCR tubes, 200 µl Thermo-Fisher 14-222-262
pipette tips, 100 to 1250 µl Thermo-Fisher 02-707-407 narrow-bore 1 mL tips
pipette tips, 5 to 300 µl Thermo-Fisher 02-707-410
pipette tips, 0.1 to 10 µl Thermo-Fisher 02-707-437
wide-bore pipette tips, 1000 µl VWR 89049-166 wide-bore 1 mL tips
glass Pasteur pipettes Thermo-Fisher 13-678-20A
ethanol, 200 proof Thermo-Fisher 04-355-451
vortex mixer VWR 10153-842
chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass Thermo-Fisher 155409 glass-bottom confocal-grade cultureware
22G needles VWR 82002-366
insulin syringes Thermo-Fisher 22-253-260
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixation of explanted teratomas
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip Illumina BD-103-0204 expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer
PrimeView Human Genome U219 Array Plate Thermo-Fisher 901605 expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array Thermo-Fisher 902482 expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest
PluriTest® Coriell Institute www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data
CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data

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Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).

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