התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית
Summary
פרוטוקול זה מתאר את התכנות של ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal לתוך תאי גזע pluripotent המושרה באמצעות גישה episomal-שילוב בתנאים מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית. תהליכי מיצוי, תרבות, התכנות, ואפיון של תאי גזע pluripotent המושרה הנוצרת על ידי שיטות מחמירים מפורטים.
Abstract
טיפולים מבוססי תאים עצמיים יש צעד אחד קדימה למציאות עם כניסתה של גזע pluripotent המושרה. תאי גזע עובריים, כגון מי שפיר והממברנה בתאי גזע mesenchymal, מייצגים סוג ייחודי של תאים מובחן עם הבטחה הנדסת רקמות, עבור התכנות לתוך iPSC התערבויות רפואת העתיד, תאי גזע, בנקאות. פרוטוקול המובאת כאן מתאר הליך בלתי אופטימליים עבור חילוץ ו culturing ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal, הפקת episomal המושרה בתאי גזע pluripotent של תאים אלה בתרבות מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית תנאים ניצול אנושי vitronectin רקומביננטי והמדיום E8. אפיון של הקווים החדשים על-ידי החלת שיטות מחמירים – cytometry זרימה, הדמיה קונאפוקלית, טרטומה היווצרות ו פרופיל תעתיק – גם מתואר. הקווים החדש שנוצר אקספרס סמנים של תאי גזע עובריים – Oct3/4A, Nanog, Sox2, טרה-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – בעת היותו שלילי עבור דה מרקר SSEA-1. הקווים תאי גזע טופס teratomas בעכברים scid-בז ‘ ב- 6-8 שבועות ומכילים teratomas רקמות נציג של כל שלוש שכבות הנבט. פרופיל תעתיק של הקווים על ידי הגשת נתונים microarray ביטוי הכללית באלגוריתם הערכה pluripotency bioinformatic ייחשב כל קווי pluripotent, לכן, גישה זו היא חלופה אטרקטיבית לניסויים בבעלי חיים. הקווים iPSC החדש יכול לשמש בקלות בניסויים במורד הזרם מעורבים אופטימיזציה של בידול והנדסת רקמות.
Introduction
הטכנולוגיה של תאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) מביא על פוטנציאל התא החלפת טיפולים, מחלות, מודלים התפתחותיים, ואת סמים ההקרנה רעילות1,2,3. החלפת טיפולים מושגית יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת תא, הפריה הבדיל השרשה רקמות (כגון תיקוני הלב), או מודרכת התחדשות של הנדסת רקמות. מי שפיר (AFSC), קרום תאי גזע (AMSC) הם מקור מצוין של תאים עבור התערבויות אלה גם ישירות4,5,6,7 או כאוכלוסייה התא ההתחלתי עבור התכנות לתוך pluripotency8,9,10,11,12.
גישות מוקדם בשימוש מערכות התרבות לא מוגדר או התכנות בפעולות שירות הדורשות אינטגרציה הגנומי קשור בתזמון של בונה9,10,11,12. מחקר עדכני יותר מועסקים מדיום קסנו-חופשית, אף-על-פי מטריצה מצורף קרום המרתף פחות מוגדר (BMM) שימש, כדי ליצור iPSC מתאי אפיתל נוזל מי השפיר. עם זאת, וזמינותו היווצרות טרטומה שאינו נכלל את המחקר יחד עם שפע של הפריה הנתונים המולקולריים. נמצאו תאים אפיתל נוזל מי השפיר יש בערך 8-fold יעילות גבוהה יותר התיכנות בהשוואה neonatal fibroblasts13. במחקר אחר, גזע mesenchymal של נוזל מי השפיר נמצאו גם כדי לתכנת לתוך iPSC עם הרבה יותר יעילות12.
גזע pluripotent יכול להיות מובחן רקמות נציגם של כל שכבות הנבט 3, ולכן יש את הפוטנציאל הרחב ביותר. ילדים יכולים להרוויח מן קציר, התכנות, הנדסת רקמות של שלהם תאי גזע של נוזל מי השפיר עצמיים prenatally, קרום מי השפיר גזע תאים perinatally. יתר על כן, הנמוכות יחסית של ההתמיינות של תאי גזע עובריים (נמוך יותר מאשר14,תאי גזע בוגרים15) יכול לסייע באופן תיאורטי בהתייחסות השמירה שנצפו של epigenetic הטיה מתאי המקור iPSC16.
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור התכנות השפיר, קרום תאי גזע כדי pluripotency ב מוגדרים כימי בינוני E8 קסנו-חופשית vitronectin רקומביננטי17 . עולמיים בנויים (. לצרכיך המדויקים) בעזרת פלסמידים episomal18. היתרון העיקרי של נוזל מי השפיר ותאי ממברנה כמקור של תאים עבור התכנות טמון זמינותם מראש, perinatally ובכך גישה זו בעיקר ירוויחו מחקר לתוך הנדסת רקמות לילדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב הראשוני של דור iPSC של תאי גזע עובריים מצריכה הפקת תאי המקור של רקמות העובר שלהם, הרחבה, ותרבות הקדמה של פלסמידים התיכנות episomal. שלב זה ואחריו תקופת תרבות בסביבות 14-18 ימים לפני ניתן להרחיב את המושבות מלא reprogrammed הראשון. השלב האחרון הוא התבגרותם של שיבוטים iPSC. החילוץ הראשוני של תאי גזע קרום ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Medizinische Forschung Fonds באוניברסיטת ציריך, Forschungskredit של אוניברסיטת ציריך, NMS SCIEX שלCh תחת מלגות 10.216 ו- 12.176, שוויצרי החברה לקרדיולוגיה, את המדע הלאומית השוויצרית קרן תחת גרנט [320030-122273] ו- [310030-143992], לתכנית המסגרת השביעית, שסתום החיים, הנציבות האירופית תחת גרנט [242008], קרן Mayenfisch אולגה, קרן EMDO, המענק סטארט-אפ 2012 של בית החולים האוניברסיטאי בציריך, ו מימון פנימי של מכון הסרטן מיטשל.
Materials
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette – transfection pipette Neon device – transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip – transfection tip Neon tube – transfection tube buffer R – resuspension buffer buffer E – electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
- Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
- Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
- Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
- Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
- Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
- Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
- Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
- Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
- Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
- Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
- Kang, N. -. H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
- Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Müller, F. -. J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
- Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
- Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
- Müller, F. -. J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
