Summary

Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

Published: November 27, 2017
doi:

Summary

Questo protocollo descrive la riprogrammazione di primaria amniotico liquido e membrana di cellule staminali mesenchimali in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un approccio episomal non-integrazione in condizioni completamente chimicamente definite. Procedure di estrazione, cultura, riprogrammazione e caratterizzazione delle cellule staminali pluripotenti indotte risultanti dai rigorosi metodi sono dettagliate.

Abstract

Terapie basate su cellule autologhe ha un passo più vicino alla realtà con l’introduzione di cellule staminali pluripotenti indotte. Cellule staminali embrionali, come il liquido amniotico e cellule staminali mesenchimali di membrana, rappresentano un tipo unico di cellule non differenziate con promessa in ingegneria tissutale e per riprogrammare in iPSC per futuri interventi pediatrici e bancaggio delle cellule staminali. Il protocollo presentato qui descrive una procedura ottimizzata per l’estrazione e la coltura primaria amniotico liquido e la membrana delle cellule staminali mesenchimali e generando episomal indotta da cellule staminali pluripotenti da queste cellule in cultura completamente chimicamente definita condizioni che utilizzano umano ricombinante vitronectina e il mezzo di E8. Caratterizzazione delle nuove linee applicando metodi rigorosi – flusso cytometry, imaging confocale, la formazione di teratoma e profiling trascrizionale – inoltre è descritto. Le linee appena generate esprimono marcatori di cellule staminali embrionali – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – pur essendo negativo per il marcatore di SSEA-1. Le linee di cellule staminali formano i teratomas in topi scid-beige in 6-8 settimane e i teratomas contengono tessuti rappresentativi di tutti i tre strati di germe. Profiling trascrizionale delle linee di invio dei dati di microarray di espressione globale a un algoritmo di valutazione pluripotenza bioinformatic ritenute tutte le linee pluripotenti e di conseguenza, questo approccio è un’attraente alternativa alla sperimentazione animale. Le nuove linee di iPSC prontamente possono essere utilizzate in esperimenti a valle che coinvolgono l’ottimizzazione di differenziazione e dell’ingegneria tissutale.

Introduction

La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) comporta potenziali terapie di sostituzione cellulare, malattia e modellazione inerente allo sviluppo e droga e selezione tossicologica1,2,3. Terapie sostitutive concettualmente può essere ottenute tramite l’iniezione delle cellule, in vitro differenziato l’impianto del tessuto (ad esempio di patch cardiaci), o rigenerazione guidata mediante ingegneria tissutale. Liquido amniotico (AFSC) e cellule staminali di membrana (AMSC) sono un’ottima fonte di cellule per questi interventi sia direttamente4,5,6,7 o come una popolazione cellulare iniziale per la riprogrammazione in pluripotenza8,9,10,11,12.

Primi approcci utilizzati sistemi di coltura non definito o riprogrammazione metodi che richiedono l’integrazione genomica comporta dei costrutti9,10,11,12. Uno studio più recente ha impiegato un mezzo privo di xeno, anche se è stata utilizzata una meno definita matrice di attaccamento della membrana basale (BMM), per generare iPSC da cellule epiteliali del liquido amniotico. Tuttavia, l’analisi di formazione di teratoma non era inclusa nello studio insieme a una ricchezza di dati molecolari e in vitro. Cellule epiteliali del liquido amniotic sono state trovate per avere una più o meno 8 volte maggiore efficienza riprogramma rispetto ai fibroblasti neonatali13. In un altro studio, cellule mesenchimali staminali da liquido amniotico inoltre sono state trovate per essere riprogrammato in iPSC con molta efficienza superiore12.

Cellule staminali pluripotenti possono essere differenziate in rappresentante di tessuti di tutti e 3 strati germinali e quindi hanno il potenziale più ampio. Pazienti pediatrici potrebbero beneficiare la raccolta, riprogrammazione e ingegneria tissutale delle loro cellule staminali di liquido amniotic autologhi prenatally amniotic della membrana cellule staminali e perinatale. Inoltre, il livello relativamente basso di differenziazione delle cellule staminali embrionali (inferiore a cellule staminali adulte14,15) teoricamente potrebbe aiutare nell’affrontare la ritenzione osservata di bias epigenetici dalle celle di origine in iPSC16.

Qui presentiamo un protocollo per la riprogrammazione del liquido amniotico e cellule staminali membrana di pluripotenza in chimicamente definito medium E8 senza xeno su ricombinante vitronectina17 (VTN) utilizzando plasmidi episomal18. Il vantaggio principale delle cellule della membrana e del liquido amniotico come fonte di cellule per la riprogrammazione risiede nella loro disponibilità pre- e perinatale e quindi questo approccio principalmente avrebbe vantaggio della ricerca pediatrica tissutale.

Protocol

Il protocollo segue le linee guida istituzionali del comitato etico per la ricerca umana. Consenso scritto del paziente è stata ottenuta per l’utilizzo del liquido amniotico per la ricerca. Questo protocollo segue i criteri del Comitato uso della University of South Alabama e istituzionali Animal Care. 1. isolamento e coltura di cellule staminali amniotiche primario Mesenchymal Placcatura di cellule del liquido amniotico Ottene…

Representative Results

Consenso informato scritto è stato ottenuto dai pazienti prima della raccolta del liquido amniotico per scopi di test genetici e dedicando una piccola aliquota del fluido per la ricerca. Nessun consenso è richiesto per l’uso della membrana amniotica nella ricerca, come la placenta rappresenta rifiuti sanitari. Le cellule staminali della membrana e del liquido amniotico tipico mesenchymal proprietà di visualizzazione, morfologicamente le loro cellule sono fusiformi e fase-brillante. Al …

Discussion

La fase iniziale della generazione di iPSC da cellule staminali embrionali comporta l’estrazione di celle di origine da tessuti fetali, loro cultura, espansione e introduzione dei plasmidi riprogrammazione episomal. Questa fase è seguita da un periodo di cultura di circa 14-18 giorni prima che le prime colonie completamente riprogrammate possono essere espansa. La fase finale è la maturazione dei cloni iPSC. L’iniziale estrazione delle cellule staminali della membrana amniotica è realizzata per mezzo di una combinato …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal Fonds Medizinische Forschung presso l’Università di Zurigo, Forschungskredit dell’Università di Zurigo, The SCIEX NMSCh sotto 10.216 Fellowships e 12.176, The Swiss Society of Cardiology, The Swiss National Science Fondazione sotto Grant [320030-122273] e [310030-143992], il 7 ° programma quadro, la valvola di vita, la Commissione europea sotto Grant [242008], l’Olga Mayenfisch Foundation, la Fondazione EMDO, la concessione di Start-up 2012 dell’ospedale universitario di Zurigo, e finanziamento interno del Mitchell Cancer Institute.

Materials

Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 tissue dissociation system, dissociator
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) Thermo-Fisher 3120032
70 µm cell strainers Corning 10054-456
RPMI 1640 medium Thermo-Fisher 32404014 
rocking platform VWR 40000-300
50 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339652
15 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339650
EBM-2 basal medium Lonza CC-3156 basal medium for AFMC medium
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) Prospec Bio CYT-218 bFGF, supplement for AFMC medium
EGF Human, Pichia Prospec Bio CYT-332  EGF, supplement for AFMC medium
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant Prospec Bio CYT-022 IGF, supplement for AFMC medium
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified Thermo-Fisher 10439024 FBS
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo-Fisher 15240062  for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!
Accutase cell detachment solution StemCell Technologies 07920 cell detachment enzyme
CryoStor™ CS10 StemCell Technologies 07930 complete freezing medium
PBS, pH 7.4 Thermo-Fisher Scientific 10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362 for plasmid isolation
pEP4 E02S EN2K Addgene 20925 EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2K Addgene 20927 ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2L Addgene 20926 M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000C spectrophotometer
Neon® Transfection System Thermo-Fisher MPK5000 transfection system, components:
Neon pipette – transfection pipette
Neon device – transfection device
Neon® Transfection System 10 µL Kit Thermo-Fisher MPK1025 consumables kit for the Neon Transfection System, it contains:
Neon tip – transfection tip
Neon tube – transfection tube
buffer R – resuspension buffer
buffer E – electrolytic buffer
Stemolecule™ Sodium Butyrate StemGent 04-0005 small molecule enhancer of reprogramming
TeSR-E8 StemCell Technologies 05940 E8 medium
Vitronectin XF™ StemCell Technologies 07180 VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer
CellAdhere™ Dilution Buffer StemCell Technologies 07183 vitronectin dilution buffer
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 dilute with PBS to 0.5 mM before use
EVOS® FL Imaging System Thermo-Fisher Scientific AMF4300 LCD imaging microscope system
CKX53 Inverted Microscope Olympus phase contrast cell culture microscope
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo-Fisher 28908 dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week
Perm Buffer III BD Biosciences 558050 permeabilization buffer, chill to -20 °C before use
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 557782 isotype control for Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 557783 isotype control for Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 562139
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 401617 isotype control for TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401618 isotype control for TRA-1-81
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 330613
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330705
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 400129 isotype control for SSEA-1
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401321 isotype control for SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 323010
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 Jackson Immunoresearch 115-606-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 Jackson Immunoresearch 115-546-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
DAPI Thermo-Fisher Scientific D21490 stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution
Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free Corning 356231 basement membrane matrix (BMM)
scid-beige mice, female Taconic CBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50) Qiagen 74134 RNA isolation kit
T-25 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156367
T-75 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156499
Nunc™ tissue-culture dish Thermo-Fisher 12-567-650  10 cm tissue culture dish
6-well plates, tissue-culture treated Thermo-Fisher 140675
Neubauer counting chamber (hemacytometer) VWR 15170-173
Mr. Frosty™ Freezing Container Thermo-Fisher 5100-0001  freezing container
FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml Corning 352058 5 ml polystyrene tubes
Eppendorf tubes, 1.5 ml Thermo-Fisher 05-402-96 1.5 ml microcentrifuge tubes
PCR tubes, 200 µl Thermo-Fisher 14-222-262
pipette tips, 100 to 1250 µl Thermo-Fisher 02-707-407 narrow-bore 1 mL tips
pipette tips, 5 to 300 µl Thermo-Fisher 02-707-410
pipette tips, 0.1 to 10 µl Thermo-Fisher 02-707-437
wide-bore pipette tips, 1000 µl VWR 89049-166 wide-bore 1 mL tips
glass Pasteur pipettes Thermo-Fisher 13-678-20A
ethanol, 200 proof Thermo-Fisher 04-355-451
vortex mixer VWR 10153-842
chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass Thermo-Fisher 155409 glass-bottom confocal-grade cultureware
22G needles VWR 82002-366
insulin syringes Thermo-Fisher 22-253-260
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixation of explanted teratomas
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip Illumina BD-103-0204 expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer
PrimeView Human Genome U219 Array Plate Thermo-Fisher 901605 expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array Thermo-Fisher 902482 expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest
PluriTest® Coriell Institute www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data
CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data

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Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).

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