Summary
ويعتقد أن البكتيريا تلعب دورا رئيسيا في تعريف التنوع الميكروبي في مختلف المنافذ الإيكولوجية. هنا، نحن تصف إجراء فعال لتقييم كيفية البكتيريا تؤثر على الأمعاء تكوين الميكروبيوتا في نموذج حيواني.
Abstract
أسئلة مثيرة للاهتمام جدا تنشأ مع تقدمنا المعرفة حول الأمعاء تكوين الميكروبات الحيوية والعلاقة مع الصحة، لا سيما فيما يتعلق بالعوامل التي تسهم في الحفاظ على التوازن السكاني. ومع ذلك، هناك منهجيات محدودة المتاحة لتقييم هذه العوامل. البكتيريا هي الببتيدات المضادة للميكروبات التي تنتجها العديد من البكتيريا التي قد تمنح ميزة تنافسية للحصول على الغذاء و / أو إنشاء المتخصصة. العديد من سلالات حمض اللاكتيك بروبيوتيك (لاب) سلالات لديها إمكانات كبيرة لتعزيز صحة الإنسان والحيوان عن طريق منع نمو مسببات الأمراض. ويمكن أيضا أن تستخدم للتحوير المناعي، لأنها تنتج البكتيريا. ومع ذلك، فإن النشاط العدائي للبكتريوسينات يتم تحديده عادة من خلال الاختبارات البيولوجية المختبرية في ظل ظروف محددة جيدا ولكن مفرطة في التبسيط مقارنة ببيئة الأمعاء المعقدة في البشر والحيوانات، حيث تواجه البكتيريا تأثيرات متعددة العوامل من المضيف ومئات الأنواع الميكروبية sهارينغ نفس المتخصصة. يصف هذا العمل إجراء كامل وفعال لتقييم التأثير من مجموعة متنوعة من البكتيريا مع مختلف الخصائص المستهدفة في نظام الفئران. يتم رصد التغييرات في تكوين الكائنات الحية الدقيقة خلال العلاج بكتيريوسين باستخدام التركيب 16S ردينا التسلسل. يستخدم نهجنا كلا من منتجي البكتريوسين و المسوخ التي تنتجها غير البكتريوسين المنتجة، وهذا الأخير يعطي القدرة على التمييز بين البكتريوسين ذات الصلة من التعديلات ذات الصلة غير البكتريوسين من الجراثيم. استخلاص الحمض النووي البراز وطرق التسلسل 16S ردينا هي متسقة، جنبا إلى جنب مع المعلوماتية الحيوية، تشكل إجراء قوي لإيجاد تغييرات باهتة في التشكيلات البكتيرية وإقامة الارتباطات، من حيث تركيز الكوليسترول والثلج الثلاثية، بين السكان البكتيرية وعلامات الصحة. بروتوكول لدينا هو عام، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة المركبات الأخرى أو العناصر الغذائية مع القدرة على تغيير ميكروفون المضيفتكوين الروبيوتا، إما عند دراسة السمية أو الآثار المفيدة.
Introduction
البكتيريا هي الببتيدات المضادة للميكروبات التي تنتجها مجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية 1 ، 2 . وقد تم استكشاف هذه المركبات ومنتجيها، وخاصة لاب، واستغلالها في جميع أنحاء العالم لعقود لتطبيقاتها المحتملة في حفظ الأغذية والطب 3 . ومن المعروف أن العديد من البكتيريا لقتل مسببات الأمراض الهامة، بما في ذلك أنواع الليستيريا، المعوية، المكورات العنقودية، وعصية . بعض البكتيريا حتى لديهم القدرة على تعديل الاستجابة المناعية 4 . العديد من البكتيريا لديها أطياف ضيقة نسبيا، وهي الملكية التي هي محل تقدير كبير في بعض التطبيقات. على سبيل المثال، بعض البكتيريا الضيقة الطيف يمكن استخدامها لتوجيه نشاط معين ضد مجموعات مختارة من البكتيريا إشكالية، دون الكثير من الاضطراب على النباتات كومنزال أو مفيدة تقاسم نفس مكانة؛ وهذا أمر ضروري خاصة في إنفير الأمعاء، حيث العديد من الميكروبات المفيدة تزدهر بطريقة تفاعلية وديناميكية 5 . البكتيريا هي أيضا جذابة جدا للاستخدام الوقائي أو بروبيوتيك، لأنها يمكن أن تقمع (خارج) نمو مسببات الأمراض، باثوبيونتس، أو البكتيريا الانتهازية التي قد عدم التوازن التوازن الأمعاء 6 ، 7 .
من حيث طبيعتها والخصائص الفيزيائية والكيميائية، البكتيريا هي متنوعة جدا، كما أن لديها هياكل مختلفة، والخصوصيات المستهدفة، وطرق العمل، وما إلى ذلك وقد درست معظم البكتيريا في تفاصيل كبيرة في المختبر ، ولكن تم اختبار عدد قليل جدا في الغذاء المصفوفات 8 ، 9 أو في الجسم الحي، كما هو الحال في أمعاء الحيوان 6 ، 10 . الخصائص في المختبر يمكن أن تختلف إلى حد كبير عند تقييمها في الجسم الحي بسبب تعقيد سوبيئة الأمعاء وأيضا للآثار غير المقصودة المفترضة على البكتيريا المفيدة. معظم البروبيوتيك هي لاب. أنها تنتج مجموعة من الأيضات الأخرى، بما في ذلك الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، والتي من المعروف أن تؤثر على علم وظائف الأعضاء من المضيف، وكذلك لإظهار خصائص مضادة للميكروبات تجاه بعض البكتيريا. لذلك، في حالة سلالات بروبيوتيك التي تنتج البكتيريا، فمن الأفضل لإقامة مقايسات واقعية، مثل الحيوانات السليمة مع الميكروبات الطبيعية.
في هذه الدراسة، ونحن نقدم استراتيجية تسمح لتقييم تأثير سلالات مختلفة البكتريوسين المنتجة، والتي بكتيريوسينز لها أطياف مثبطة مختلفة، على الفئران صحية. وتشمل استراتيجيتنا تغذية الفئران مع المسوخ غير البكتريوجين إيسوجينيك، والتي تمكن من التمايز بين آثار بوسيريوسين بوساطة من الآثار غير البكتريوسين بوساطة. تسلسل 16S ردينا يسمح لمتابعة التغيرات الديناميكية من السكان البكتيرية في القناة الهضمية. الغواصاتالتحليل الإحصائي المتساوي للروابط بين الأنواع البكتيرية وأيضا بين الأنواع البكتيرية والمعلمات الفسيولوجية المقاسة (على سبيل المثال، وزن الجسم، والمعلمات الكيميائية الحيوية في الدم، وما إلى ذلك ). ونحن نعتقد أن البروتوكول المقدم في هذه الدراسة ينطبق أيضا على تطبيقات أخرى بروبيوتيك أو ما قبل الجراثيم بعد دراسة البكتيريا في الحيوانات الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويجب القيام بالرعاية والمناولة في وحدة متخصصة لرعاية الحيوان. تمت الموافقة على الإجراءات الموصوفة هنا من قبل لجنة الأخلاقيات المعنية من جامعة فالنسيا والسلطات المحلية، وفقا لمبادئ الرعاية الحيوانية المختبرية إلزامية من قبل قانون الاتحاد الأوروبي و 2010/63 / الاتحاد الأوروبي والحكومة الاسبانية أردي 53/2013 بشأن حماية الحيوانات تستخدم لأغراض علمية، من أجل احترام مبدأ 3R في التجارب على الحيوانات (استبدال، والحد من، صقل).
1. المجمدة البكتيرية الثقافات المستخدمة لتطعيم الفئران
- تطعيم سلالات فردية من لاب في 5 مل من الدماغ ضخ القلب (بهي) المتوسطة وتنمو لمدة 20-24 ساعة (بين عشية وضحاها) في 30 درجة مئوية.
- تمييع كل ثقافة بكتيرية بين عشية وضحاها 100 أضعاف في بهي عن طريق نقل 2 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 200 مل من بهي. تنمو لهم في 30 درجة مئوية لمدة 20-24 ساعة.
ملاحظة: يتم سرد السلالات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1. - الحصاد سيلس بواسطة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف وغسل الخلايا مرتين عن طريق تعليق كل خلية بيليه في 100 مل من الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (بس) وجمع الخلايا كما في الخطوة 1.3.
- بعد غسل الثاني، وتعليق كل بيليه خلية في 20 مل من الجليد الباردة 15٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني.
- قسامة تعليق الخلية في أحجام 1-مل في أنابيب ثم تخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: يجب استخدام الخلايا في غضون 1-2 أشهر بعد هذه النقطة. - تحديد عدد الخلايا قبل التخزين وقبل الإدارة بحيث يعرف عدد الخلايا الحية التي تعطى للفئران.
- لعد الخلايا، وجعل التخفيفات عشرة أضعاف تسلسلات الخلايا في الجليد الباردة 0.9٪ كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) حل. انتشار 100 ميكرولتر من كل التخفيف على لوحة أجار بهي. احتضان بين عشية وضحاها (20-24 ساعة) في 30 درجة مئوية لنمو الخلايا وتكوين مستعمرة، وهذا الأخير لتحديد وحدات تشكيل مستعمرة (كفو) / مل.
- لجعل مياه الشرب المحتوية على البكتيريا، تمييع الخلايا من كل ثقافة الأسهم البكتيرية في 100 مل من مياه الشرب المعقم، وتصفيتها، مع متوسط كفو النهائي من 10 9 / مل من الماء. لتقييم البكتيريا البقاء على قيد الحياة، عد الخلايا الحية بعد تخفيف وبعد 24 ساعة مرة واحدة في الأسبوع خلال الأسبوعين الأولين من العلاج البكتيريا.
2. فحص الفئران والتصميم التجريبي
ملاحظة: هناك حاجة محددة الممرضة خالية (سف) بالب / ج الفئران الإناث الشابة (6 - 8 أسابيع) لهذه التجربة. هنا، تم شراء ما مجموعه 100 الحيوانات.
- توفير الفئران مع حرية الوصول إلى الكريات الغذاء والماء طوال التجربة.
- تصميم التجربة وحساب الطاقة.
- إذا كان لكل معاملة سيطرتها الخاصة، تطبيق تصميم التحكم في الحالة المقترنة (t- اختبار). استخدام مقايسة أولية لحساب المتوسط والخطأ القياسي من أهم تأثير (ق) التي سيتم تحديدها. تحسين قوة الفحص وعدد الحيوانات اللازمة لكل مجموعة باستخدام أساليب مختلفة وبرامج متاحة بحرية 11 .
- لاختبار آثار البكتريوسين المنتج مقابل سلالات غير المنتجة، واستخدام 9 الحيوانات في حالة تجريبية.
ملاحظة: تم تحديد هذا الرقم استنادا إلى الخطأ القياسي التجريبي ووفرت قوة مرضية (0.7 - 1.0) ومستوى دلالة أقل من 0.05.
ملاحظة: في المثال المعطى، قدمت 11 مجموعة من الفئران، واحد في قفص. عشرة أقفاص تتوافق مع العلاجات مع 5 سلالات المنتجة باتيريوسين والسلالات المقابلة 5 إيسوجينيك غير المنتجة؛ وكان القفص 11 عشر 10 الفئران وتشكل السيطرة غير المعالجة.
- بعد وصول الفئران إلى مرافق تربية، وتوزيعها في أقفاص وتسمية الأذن الحيوانات للسماح للتتبع الفردية. أكليماتيز الفئران إلى مرافق وظروف تربية لمدة أسبوع قبل proceeding.
- إعداد البكتيريا التي تحتوي على مياه الشرب، كما هو موضح في الخطوة 1.8، ووضع زجاجات مياه الشرب في أقفاص مستقلة المقابلة التي يتم تحديدها بوضوح بحيث الفئران في كل قفص حصة نفس زجاجة المياه.
ملاحظة: يجب أن تبقى مجموعة السيطرة في قفص منفصل، مع عدم وجود اتصال مع البكتيريا اختبارها. - إعداد زجاجة جديدة مع مياه الشرب العذبة (100 مل) كل يوم وإضافة تعليق البكتيريا الطازجة الطازجة. قم بذلك لمدة 15 يوما متتالية.
- اتبع العلاج البكتيريا مع فترة أسبوعين، وخلال الفئران الوقت شرب البكتيريا خالية من المياه ( الشكل 1 ).
3. جمع العينات
- جمع عينات البراز.
- إعداد أقفاص تعقيمها (فارغة) وملقط معقم وتسمية العقيمة أنابيب 1.5 مل لكل الماوس.
- جمع العينات في نفس الوقت من اليوم لتجنب الاختلافات في تكوين الميكروبات خلال ثه دورة من اليوم. للحصول على أفضل النتائج، وجمع عينات جديدة بشكل منفصل.
ملاحظة: يفضل، وجمع البراز في الصباح الباكر، عندما الفئران تميل إلى التغوط بشكل عفوي. - تنظيف قفص فارغ مع الكحول 70٪ ووضع الماوس داخل. السماح لها بالتبرز، وجمع 2-4 الكريات البراز باستخدام ملقط معقم، ووضعها في أنابيب 1.5 مل.
ملاحظة: في بعض الأحيان يكفي للحفاظ على ذيل الماوس صعودا. ويمكن بعد ذلك يتم جمع البراز مباشرة من فتحة الشرج في أنبوب. - جمع عينات البراز من كل الماوس مرة واحدة في الأسبوع خلال تجربة لمدة أربعة أسابيع ( الشكل 1 ). جمع العينات الأولى في يوم واحد (T0، وقت الصفر)، قبل التعرض للفئران للبكتيريا. جمع عينات البراز التالية في أيام 7 و 14 و 21 و 28.
- تبريد العينات في 4 درجات مئوية حتى نقلها إلى المختبر، حيث يتم تجميدها في -80 درجة مئوية. خطة مقدما وتوفير ما يكفي من صناديق التخزين، وعدد كبير من فيسيتم جمع عينات كال خلال التجربة.
- تزن كل الفئران كل أسبوع على يوم جمع البراز.
- جمع عينات الدم من الوريد الوجهي من جميع الفئران في اليوم ال 15، في اليوم الأخير من إدارة البكتيريا، وتحديد مستويات الدهون الثلاثية، والكوليسترول الكلي والبروتين الدهني عالي الكثافة (هدل)، والبروتين الدهني منخفض الكثافة (لدل) في مصل الدم.
ملاحظة: يجب على الموظفين ذوي الخبرة جمع الدم للحد من الإجهاد في الحيوانات.
4. العد العدوى والبكتريوسين النشاط
- تزن بيليه البراز واحد من كل عينة في أنبوب 1.5 مل وإضافة حجم كاف من الجليد الباردة 0.9٪ كلوريد الصوديوم لتحقيق حل 10٪ (ث / ت). استخدام ميكروبيستليس العقيمة ل 1.5 مل أنابيب لتجانس تعليق برازي وإعداد التخفيفات عشرة أضعاف المسلسل في الجليد الباردة 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
- احسب العدد الإجمالي لخلايا لاب.
- نقل الخلايا المخففة (100 ميكرولتر) إلى 4 مل من بريوارمد مان روجوسا شارب (مرس) أجار لينة (50 درجة مئوية، أجار 0.8٪). مزيج بواسطة فورتيكسينغ قبل صب الخلايا على لوحة أجار مرس الصلبة (1.5٪ أجار).
- تجفيف لوحة عن طريق اتخاذ غطاء قبالة لمدة 5-10 دقيقة في غطاء محرك السيارة العقيمة قبل احتضان الخلايا لمدة 20-24 ساعة في 30 درجة مئوية لنمو الخلايا وتشكيل مستعمرة.
- عد الخلايا المنتجة للبكتيريا.
- نقل الخلايا المخففة (100 ميكرولتر) من المنتج بكتيريوسين إلى 4 مل من بريوارمد مرس أجار لينة (50 درجة مئوية، أجار 0.8٪)، مزيج من فورتيكسينغ، وتصب الخلايا على لوحة أجار مرس (أجار 1.5٪). ويشار إلى هذه الطبقة باسم الطبقة الأولى.
- نقل آخر 4 مل من الخلية خالية من الآجار مرس لينة (0.8٪ آجار) على الطبقة الأولى لتضمين جميع الخلايا داخل أجار لينة.
ملاحظة: هذه الطبقة هو المقصود لمنع الخلايا من النمو كما المستعمرات على سطح لوحات أجار. الخلايا التي تزرع على السطح بسهولة النازحين عند صب خلايا مؤشر على القمة (الخطوة 4.3.4) ووبالتالي تعقد تفسير النتائج. يشار إلى هذه الطبقة بالطبقة الثانية. - تجفيف لوحة عن طريق اتخاذ غطاء قبالة لمدة 5-10 دقيقة في غطاء محرك السيارة العقيمة قبل احتضان لمدة 20-24 ساعة في 30 درجة مئوية لنمو الخلايا وتشكيل مستعمرة.
- لتحديد المستعمرات المنتجة للبكتريوسين، مزيج 40 ميكرولتر من ثقافة بين عشية وضحاها من سلالة مؤشر مناسب، كما هو مبين في الجدول 1 ، مع 4 مل من أجار لينة قبل الحلمة. صب الخليط على لوحة. ويشار إلى هذه الطبقة باسم الطبقة الثالثة.
- تجفيف لوحة عن طريق اتخاذ غطاء قبالة لمدة 5-10 دقيقة في غطاء محرك السيارة العقيمة قبل احتضان لمدة 20-24 ساعة في 30 درجة مئوية لنمو الخلايا وتشكيل مستعمرة.
ملاحظة: البكتريوسين المنتجة للمستعمرات لديها واضحة (تثبيط) مناطق حول المستعمرات ( الشكل 2 ).
5. استخراج الحمض النووي، 16S ردينا التضخيم، والتسلسل
ملاحظة: الخطوات fأو استخراج الحمض النووي لاستخدام مجموعة تجارية (على سبيل المثال، ريالبور "سس" كيت).
- تعليق 1 - 2 الكريات الفئران البراز (~ 200 ملغ) في 300 ميكرولتر من محلول تحلل.
- نقل العينة إلى ميكروتوب 2 مل في حوالي 0.5 غرام من الخرز الزجاجي (قطر: 0.1 ملم) قد وضعت سابقا.
- إضافة 1 ميكرولتر من موتانوليسين في 10 U / ميكرولتر و 2 ميكرولتر من الليزوزيم في 20 ملغ / مل لكل عينة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 40-60 دقيقة. المضي قدما في واحدة من البروتوكولات القياسية لاستخراج الحمض النووي من عينات البراز 12 .
- تطبيق دورتين من الخطوات حبة الخافق، 1 دقيقة لكل منهما.
- إضافة 2 ميكرولتر من بروتينز K وتخلط جيدا.
- احتضان لمدة 20 دقيقة ودوامة كل 5 دقائق.
- تبريد العينات إلى 37 درجة مئوية وإضافة 1 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز إلى العينة. تخلط جيدا.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 - 60 دقيقة.
- تبريد العينات لدرجة حرارة الغرفة وإضافة 180 ميكرولترمن البروتين حل هطول الأمطار. دوامة بقوة في أقصى سرعة لمدة 20-30 ثانية.
- أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 5 دقائق. إذا كان هناك أي جسيمات عائمة في طاف، احتضان العينات في الجليد لمدة 5 دقائق ثم الطرد المركزي مرة أخرى.
- نقل طاف تحتوي على الحمض النووي إلى 1.5 ميكروتوب جديد مل يحتوي 300 ميكرولتر من الأيزوبروبانول.
- مزيج عن طريق قلب أنابيب 20-30 مرات واحتضان لمدة 1 ساعة في -20 درجة مئوية. بدلا من ذلك، احتضان الأنابيب لفترة أطول (على سبيل المثال، بين عشية وضحاها).
- أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 2 دقيقة.
- إزالة طاف وتجفيف أنبوب على ورقة ماصة. إضافة 300 ميكرولتر من الايثانول 70٪ لغسل بيليه الحمض النووي.
- أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف، وترك بيليه لتجف لمدة 15 دقيقة.
- مرة واحدة بيليه جافة، إضافة 100 ميكرولتر من الماء المعقم أو تريس (10 ملم) / إدتا (1 ملم) العازلة و ريسوسبيند بيليه.
- للقضاء على أي مثبط ممكنالمركبات خلال الخطوات اللاحقة، وتنظيف الحمض النووي. مزيج استخراج الحمض النووي مع 2 مجلدات (200 ميكرولتر) من العازلة نتي لضبط شروط ملزمة للخطوة 5.15.
- وضع غشاء السيليكا التي تحتوي على ير تنظيف العمود في أنبوب جمع (2 مل) وتحميل العينة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 11،000 x ز. تجاهل تدفق من خلال.
- غسل غشاء السيليكا مع 700 ميكرولتر من العازلة NT3 وكرر الخطوة 5.16.
- تجفيف غشاء السيليكا بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 11000 x ج لإزالة أي الإيثانول المتبقية التي تحتوي على غسل العازلة NT3.
- نقل العمود إلى 1.5 مل جديد ميكروتوب واحتضان لمدة 2 - 5 دقائق في 70 درجة مئوية لإزالة الكلي من الإيثانول.
- إضافة 30 ميكرولتر من المياه ير الصف واحتضان لمدة 5 دقائق عند 70 درجة مئوية. أزل بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 11،000 x ز.
- تحديد الحمض النووي باستخدام الأشعة فوق البنفسجية / فيس الطيفي أو طريقة فلوروميتريك.
- تطبيع وتجميع عينات الحمض النووي من الفئران تقاسم نفس القفص في إي نقطة الزمن تش.
- لمراقبة الفروق الفردية خلال الوقت، تسلسل عينات الحمض النووي من ثلاثة الفئران التي تم اختيارها عشوائيا من السيطرة واثنين من أقفاص عشوائية أخرى في أيام 0 و 14 و 28.
6. 16S الرنا الريباسي التضخيم الجيني والتسلسل
- إعداد مكتبة من الجينات 16S الرنا الريباسي تضخيم. تضخيم المنطقة V3-V4 من الجينات 16S الريباسي الجراثيم 5 باستخدام الاشعال إلى الأمام وعكس مع محولات المتراكمة المناسبة:
5'- تسغ تسغ غسا غغ تسا غات غغ تات عغ أغا كاغ كت أسغ غن غك وغ أغ-3 '
5-غك تسغ تغغ غكت كغغ أغا تغت غتا تا غاغ أكا غا كتا تشف غ تات كتا أتس C-3 ' - تحقق من العصابات تضخيم باستخدام الكهربائي مع 1٪ هلام الاغاروز.
- تنظيف المنتجات تفاعل البوليميراز سلسلة (ير) باستخدام الخرز المغناطيسي لتنقية أمبليكون.
- المضي قدما في الخطوات التالية كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة وفقا لمنصة تسلسل ضخمة المستخدمة> 6.
7 - تحليل البيانات والإحصاءات
- تصفية الجودة (عادة ما يتم تنفيذها في مرافق التسلسل).
- تصفية الخام يقرأ البيانات و دي-مولتيبلكس باستخدام البرنامج المرفق مع المعدات.
- معالجة يقرن نهاية يقرأ باستخدام أوبيرز خط أنابيب 13 تنفيذها في وسيرتش 14 (الإصدار 7.0.1090). دمج النهايات المقترنة وتطبيق تصفية الجودة باستخدام الحد الأقصى الخطأ المتوقع (ماكسي) قيمة 1.0. تجاهل تسلسل أقل من 150 نت. تسلسل ديريبليكات لتجاهل سينجليتونس.
- تجميع التتابعات في وحدات التصنيف التشغيلية (أوتوس) على هوية تسلسل 97٪ واستخدام أوشيم 15 لتصفية متواليات خيالية.
- أوتو قطف، والتصنيف التصنيفي والتعمير النشوء، وتحليلات التنوع والتصورات.
- معالجة أوتوس باستخدام رؤى الكمية إنتo البيئة الميكروبية (كيم) 16 .
- اختيار ومحاذاة أوتوس ممثل ضد قاعدة البيانات الأساسية غرينجينيس 17 باستخدام بيناست 18 مع الحد الأدنى من هوية 75٪ (الافتراضي).
- تعيين التصنيف إلى تسلسل الانحياز باستخدام برنامج تصنيف قاعدة بيانات ريبوسومال (رديب) 19 مع الثقة من 0.8.
- تطبيع الجدول أوتو إلى عدد تسلسل العينة مع عمق تسلسل أدنى.
- بناء شجرة النشوء من تسلسل الانحياز باستخدام شجرة سريع 20 بعد خطوة الترشيح من أجل إزالة المناطق والمواقف متغير للغاية التي هي كل الثغرات. استخدام هذه الشجرة لحساب ألفا وبيتا التنوع ولحساب منحنيات النادرة ومؤشرات شانون.
- لتوليد وتصور مقاييس المسافة ونيفراك غير مرجحة 21 ، استخدم تحليل الإحداثيات الرئيسية (يكوا).
ملاحظة: sالتحليل الإحصائي، يمكن استخدام حزم برامج مختلفة، مثل R 22 أو الأدوات الإحصائية المنفذة داخل كيميمي 16 . - للمقارنة بين مؤشرات شانون للتنوع بين العلاجات المختلفة، استخدم أنكوفا، معتبرا الوقت كمتغير تابع مستمر في R.
- مقارنة المسافات بين العلاجات في بوا في كيم باستخدام اختبار من طرفين تي تي وحساب القيم p غير نونبارامتريك مع 1000 مونتي كارلو التباديل باستخدام تصحيح بونفيروني.
- تحليل للارتباطات بين وفرة النسبية من أوتو محددة وغيرها من المعلمات المقاسة، مثل مستويات المصل من الكولسترول، هدل، لدل، وما إلى ذلك ، وذلك باستخدام تحليل ارتباط بيرسون. تحقيقا لهذه الغاية، استخدم كونيت 23 مع التصور اللاحق من شبكات الارتباط باستخدام سيتوسكيب 3.1.1 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد اعتبر إنتاج الجراثيم ميزة بروبيوتيك إيجابية في لاب، كما كان من المفترض أن تمنع نمو البكتيريا الانتهازية ومسببات الأمراض. وكان الهدف من هذا العمل لإظهار قدرة البكتيريا لتعديل الأمعاء الجراثيم السكان في نموذج الماوس. لهذا الغرض، تم تطوير إجراء لمقارنة تأثير تناول السلالات المنتجة للبكتريوسين والسلالات غير المنتجة إيسوجينيك. ويرد الإجراء للتلقيح والوقت تمديد الفحص في الشكل 1 . تم تجميع الفئران في أحد عشر قفصا: السيطرة دون أي علاج، خمسة أقفاص تعامل مع سلالات بكتيريوسين منتج، وخمسة أقفاص تعامل مع المسوخ إيزوجينيك المقابلة التي خفضت أو لا إنتاج البكتيريا. وقد تم تلخيص المختبر الذي تم إنتاجه من البكتريوسين، وكذلك التعداد الخاص به (كفو / مل) في مياه الشرب والتعداد في البراز، في
الشكل 1: مخطط عرض تصميم دورة الوقت من إكسبriment. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكشف عن إنتاج البكتيريا في لاب المستردة من البراز بواسطة بروتوكول من ثلاثة طبقات (كما هو موضح في الإجراء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة بين تكوين العلاجات البكتيريا. تم إنشاء مؤامرة بوا على أساس المسافات المحسوبة في مصفوفة ونيفراك غير مرجحة. نقاط زمنية مختلفة من نفس العينة (
الشكل 4: التغيرات في الوفرة النسبية للمجموعات البكتيرية المستهدفة من البكتريا والبكتريوسين على مستوى الجنس خلال فترات العلاج وما بعد المعالجة. يتغيرونs في الوفرة النسبية للأجناس في المعالجات، التي تم الحصول عليها فيما يتعلق بالوقت 0، مقارنة بتلك الموجودة في المجموعة الضابطة (كون). ولتوضيح الشكل التوضيحي، لا تظهر سوى أربع سلالات: غارفيسين و ساكاسين منتج وسلالات غير منتج (انظر أسطورة في الشكل لربط اللون والعلاج). سيبسيشبيشسب. يتم تمثيل درجة الأهمية على النحو التالي: P <0.1 مع نقطة (.)؛ P <0.05 مع نجمة واحدة (*)؛ P <0.01 مع اثنين من النجوم (**). مقتبس من أومو وآخرون. ، 2016 12 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: شبكة الترابط للوفرة النسبية من أوتو في اليوم 14 ومستويات المصل. كانت الارتباطات كاللكولاتد باستخدام ارتباط بيرسون في كونيت. يتم عرض فقط تلك الهامة (P <0.05) على الشبكة. يتم تحديد المعلمات التي يتم تحديدها في مصل الدم - الكوليسترول الكلي ( تشول ) والبروتين الدهني عالي الكثافة ( هدل ) والبروتين الدهني منخفض الكثافة ( لدل ) والدهون الثلاثية ( تريج) بلون واحد (رمادي)، في حين تمثل أوتوس التي تنتمي إلى عائلات مختلفة (انظر الأسطورة)، ويتم عرض الارتباطات الإيجابية مع الحواف الخضراء، والارتباطات السلبية مع الحواف الحمراء.تمثل أوتوس على العقد مع أرقام أوتو أو الجنس الذي ينتمون إليه. مقتبس من أومو وآخرون ، 2016 12 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تلقيح في مياه الشرب | بكتيريا حمض اللاكتيك التهم في البراز | سلالات المؤشر | | |
| كفو / مل (log10) | كفو / g (يعني log10) | |||
| مراقبة | ---- | 10 الفئران | ND | |
| اكتوباكيللوس ساكي B1500 (ساكا +) | 1.6 | 9 الفئران | 8.53 ± 0.18 | المعوية فيسيوم P21 (لمغ 2783) |
| اكتوباكيللوس ساكي B1501 (ساكا -) | 2.0 | 9 الفئران | 8.22 ± 0.05 | |
| بيديوكوس أسيديلاكتيسي B1502 (بيد +) | 26 | 9 الفئران | 8.73 ± 0.12 | المعوية فيسيوم P21 (لمغ 2783) |
| Pediocccus أسيديلاكتيسي B1503 (بيد -) | 25 | 9 الفئران | 8.75 ± 0.09 | |
| التكور المعوي B1504 (L50 وزن +) | 6 | 9 الفئران | 8.83 ± 0.14 | بيديوكوكوس دامنوسوز (لمغ 3397) |
| المعوية فيسيوم B1505 (L50 الشفاء -) | 10 | 9 الفئران | 8.72 ± 0.14 | |
| اكتوباكيللوس بلانتاروم B1507 (بلانتا +) | 26 | 9 الفئران | 9.14 ± 0.14 | الملبنة النيابة. 965 (لمغ 2003) |
| اكتوباكيللوس بلانتاروم B1508 (بلانتا -) | 23 | 9 الفئران | 8.60 ± 0.18 | |
| لاكتوكوكوس غارفياي B1515 (غارمل +) | 17 | 9 الفئران | 8.41 ± 0.08 | لاكتوكوس لاكتيس IL1403 (LMG2705) |
| لاكتوكوكوس غارفياي B1516 (غارمل -) | 17 | 9 الفئران | 8.05 ± 0.18 | |
| المكورات المعوية فيسيوم P21 (لمغ 2783) ل ساكا و بيدبا-1، بيديوكوكوس دامنوسوز (لمغ 3397) للالموروزات، الملبنة النيابة. 965 (لمغ 2003) ل بلانتاريسينس ، و لاكتوكوس لاكتيس IL1403 (LMG2705) ل غارمل. | ||||
الجدول 1: السلالات الملقحة والتعدادات في عينات البراز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم استخدام الإجراء الموصوف هنا لتحديد ما إذا كانت التغيرات في الجراثيم مرتبطة بالصحة أو العمر. أجزاء مختلفة من البروتوكول هي مهمة، ولكن من بينها، أخذ العينات البراز، واختيار جزء الحمض النووي ليتم تسلسلها وتحليلها، وأداء استخراج الحمض النووي والتحليل بيوانفورماتيك يمكن بالتأكيد أن تكون النقاط الأكثر أهمية. أخذ العينات أمر بالغ الأهمية لأنه، لأسباب أخلاقية، لا ينبغي التأكيد على الفئران ولأنه من المعروف أن تغيير نسبة البكتيريا في القناة الهضمية. يجب معالجة العينات في أقرب وقت ممكن أو يجب تجميدها حتى الاستخدام، حيث أن بعض البكتيريا حساسة جدا للجفاف و / أو للأكسجين. اختيار جزء الحمض النووي لتكون متسلسلة من الجينات 16S الرنا الريباسي تضخيم هو نقطة حاسمة. في هذا العمل، تم اختيار المناطق المتغيرة V3 - V4 25 . يجب عدم التقليل من أهمية طريقة استخراج الحمض النووي، والخلايا البكتيرية الموجودة في العينات ليست كل مكافئحساسيا للبروتوكولات تحلل مختلفة، والتحيزات في تقدير السكان البكتيرية يمكن أن تنتج عن تحلل غير مكتملة. ولذلك، فإن إدخال خطوة الخفاف حبة مطلوب. ويمكن بناء سلالات إيزوجينية عن طريق ضربة قاضية وراثية أو عن طريق كروماتيون البلازميد، على الرغم من أنه في حالة السلالات، صهر لتحويل البكتيريا المشفرة كروموسوم قد تمثل مشكلة. ويمكن تكييف هذا الإجراء باستخدام تقنيات مختلفة زراعة محددة، مثل أساليب اللاهوائية 26 .
يمكن تعديل الإجراء في معظم الخطوات، اعتمادا على نوع من التغييرات عامل لدراستها. يمكن تقصير إجراء التلقيح، ولكن التغييرات في المعلمات المصل قد تحتاج إلى بعض الوقت لتطوير. ويمكن أن يكون هناك تقييد محتمل لهذه الطريقة هو دراسة السلالات البكتيرية (المغذيات أو المركبات) التي لا تستطيع البقاء على قيد الحياة لعدة ساعات في الماء أو قد تتجمع (أو تتعجل للمركبات). وبالتالي، وهذا هو عامل يجب أن آل لذلك النظر فيها.
حتى الآن، تم تحديد نشاط البكتيريا عموما في المختبر 27 ، 28 ، 29 أو في الثقافات المختلطة 30 . وقد سمح هذا الأسلوب لرصد في الجسم الحي لأنشطة خمسة باكتيريوسينز من المجهرية كامل القناة الهضمية من الفئران المختبرية القياسية. ويمكن تحديد الاختلافات الصغيرة في السكان، فضلا عن تأثيرها على المجموعات البكتيرية الأخرى أو العوامل الفسيولوجية، مثل المعلمات المصل 12 . الجراثيم لديها طيف نشاط ضيق نسبيا، مما يعوق نمو البكتيريا ذات الصلة تصنيفيا. ومع ذلك، فإن تلك المستخدمة في هذا الاختبار هي من بين الأكثر فعالية، وبعضها نشط ضد المكورات العنقودية الذهبية ، الليستيريا مونوسيتوجينس 31 ، وحتى بعض سلالات الإشريكية القولونية ، كما هو الحال في ساكاسين Aأس = "كريف"> 32. عندما تم تلقيحها في الفئران، لم ينتج لاب المنتجة للجراثيم تغييرات ملحوظة في تكوين الميكروبات الحيوية العالمية، ولكن إلى عدد أقل من الأصناف البكتيرية. ومع ذلك، كشف تحليل شبكة الارتباط العالمي للاهتمام الإيكولوجية للاهتمام والعداء بين البكتيريا المختلفة. ويمكن تكييف هذه الطريقة لتحليل تأثير المكونات الغذائية أو العقاقير أو المركبات الأخرى، على الرغم من أن النتيجة المتوقعة قد تكون مقصودة عمدا للحفاظ على الظروف الصحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا مبادرة إيا نيلز للعلوم والاستدامة التنسيقية للباحثين (المرجع 017-أبيل-سم-2013). سب و غب-M. بدعم من منحة AGL2015-70487-P من وزارة الاقتصاد والتنافسية الإسبانية. تم دعم أوكو و دبد من قبل برنامج المنح الدراسية الاستراتيجية للبحوث علوم الأغذية من جامعة النرويجية للعلوم الحياة (نمبو) (مشروع 1205051025). ونود أيضا أن نشكر إنماكولادا نوغيرا لمساعدتها مع رعاية الحيوان وأخذ العينات ويسوع ديهيسا لمساعدته مع ضمان توافر المواد المختبرية في منشأة الحيوان. ونحن نقدر أيضا الأستاذ لارس - غوستاف سنيبن على نصيحته بشأن الإحصاءات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait? Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
