panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों पेप्टाइड अपनत्व एजेंट, एंटीबॉडी के लिए एक मजबूत विकल्प की खोज के लिए एक सिद्ध तकनीक है । अर्द्ध स्वचालित छंटाई विधि इस के साथ साथ झूठी सकारात्मक की घटना को कम करने के लिए panning सुव्यवस्थित है । यहां हम सोचा प्रक्रिया और उंमीदवारों के मूल्यांकन में लागू तकनीकों और बहाव विश्लेषण को कम करने का वर्णन ।
panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों दोनों बायोटिक और अजैव लक्ष्यों की पहचान के लिए पेप्टाइड समानता एजेंट खोज के लिए एक सिद्ध तकनीक है । पेप्टाइड संबध एजेंट संवेदन और चिकित्सकीय सहित एंटीबॉडी के लिए इसी तरह के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अधिक मजबूत और अधिक चरम वातावरण में प्रदर्शन करने में सक्षम हैं । पेप्टाइड कैप्चर एजेंटों के हित के एक प्रोटीन लक्ष्य के लिए विशिष्ट संवर्धन अर्द्ध का उपयोग कर बढ़ाया है स्वचालित तरीकों जो बाध्यकारी और धो चरणों में सुधार और इसलिए झूठी सकारात्मक बांधने की घटना में कमी । एक अर्द्ध स्वचालित छंटाई विधि एक वाणिज्यिक स्वचालित चुंबकीय के साथ उपयोग के लिए इस के साथ साथ प्रयोग के लिए बताया गया है सेल छँटाई एक स्वैच्छिक जीवाणु प्रदर्शन पुस्तकालय यादृच्छिक 15-मेर पेप्टाइड्स एक्सप्रेस छँटाई. मामूली संशोधनों के साथ, इन तरीकों अन्य स्वचालित उपकरणों, अन्य छंटाई पुस्तकालयों के लिए विस्तार कर रहे हैं, और अन्य जीवों. इस काम का एक प्राथमिक लक्ष्य के लिए एक व्यापक पद्धति प्रदान करना और सोचा व्याख्या विश्लेषण में लागू की प्रक्रिया और उंमीदवारों के परिणामस्वरूप पूल ंयूनतम है । इन तकनीकों का विश्लेषण करने के लिए ऑन-सेल बाइंडिंग का उपयोग प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS), सॉर्टिंग के दौरान और विशिष्टताओं का आकलन करने के लिए और व्यक्तिगत उंमीदवारों की तुलना में, और पेप्टाइड अनुक्रम के विश्लेषण प्रवृत्तियों की पहचान करने के लिए और सहमति और संभावित हित के लक्ष्य के लिए समानता और विशिष्टता में सुधार के लिए अनुक्रम ।
panning एक सिद्ध तकनीक अपनत्व reagent खोज के लिए है, बैक्टीरियल डिस्प्ले पुस्तकालयों के साथ पेप्टाइड संबंध के लिए एक सुविधाजनक स्रोत 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. इसी प्रकार फेज प्रदर्शन के लिए 25,26 और खमीर प्रदर्शन 27,28, पेप्टाइड्स सेल सतह पर उजागर कर रहे हैं और इन बातचीत के साथ, दोनों बायोटिक और अजैव लक्ष्य के लिए बाध्य करने के लिए उपलब्ध हैं दोनों पेप्टाइड रीढ़ और एमिनो एसिड पक्ष के अद्वितीय गुणों से प्रेरित- 29जंजीरों । फेज प्रदर्शन के विपरीत, बैक्टीरिया स्वयं नकल कर रहे है और सभी आनुवंशिक बाध्य फेज और कोशिकाओं के पुनः संक्रमण के रेफरेंस के बिना प्रदर्शन के लिए आवश्यक सामग्री शामिल हैं । खमीर प्रदर्शन के विपरीत, बैक्टीरियल प्रदर्शन तेजी के कारण तेजी से है (लगभग 20 मिनट 30) ई कोलाईके दोहरीकरण समय । आने वाले पेप्टाइड संबध एजेंट बंद सेल संवेदन प्लेटफार्मों की एक किस्म में उपयोग के लिए उत्पादन किया जा सकता है 16,17,26 और जब-सेल 2 पर प्रदर्शित सामग्री के रूप में जीवित रहने के रूप में उपयोग के लिए क्षमता है , 31 , ३२. के रूप में विशिष्ट लक्ष्यों को मांयता के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना में, पेप्टाइड्स बहुत छोटे है और अधिक लचीला है, और पेप्टाइड प्रदर्शन पुस्तकालयों आसानी से डीएनए के स्तर पर हेरफेर किया जा सकता है विशिष्ट अमीनो एसिड से बचने के लिए, जैसे cysteine ३३ . पेप्टाइड्स तेजी से चिकित्सकीय ३४,३५,३६ और अन्य अनुप्रयोगों के लिए शोषण कर रहे हैं, जहां एंटीबॉडी आमतौर पर डिस्कवरी के अपने आसानी की वजह से उपयोग किया जाएगा, प्रतिलिपि सिंथेटिक (ऑफ सेल ) उत्पादन, और चरम वातावरण में प्रदर्शन के बेहतर रखरखाव, भी उच्च तापमान या प्रशीतन के बिना लंबी अवधि के भंडारण के लिए जोखिम के बाद एक कार्यात्मक एजेंट प्रदान ३७,३८। रिएजेंट के भंडारण के लिए शीत श्रृंखला पर काबू पाने की क्षमता विशेष रुचि के रक्षा विभाग के लिए है, उदाहरण के लिए, जो चरम वातावरण में काम करना चाहिए । थर्मल स्थिरता इसलिए इस पांडुलिपि में उदाहरण के रूप में दिए गए चुने हुए लक्ष्यों को पहचानने के लिए एक वांछनीय विशेषता थी ।
हाल ही में, panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों अर्द्ध स्वचालित चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस या MCS) तरीकों 9,14,३९के उपयोग के साथ और भी अधिक सरल और विश्वसनीय हो गया है । इन तरीकों जैविक लक्ष्य के लिए विभिंन लाभों के साथ कई समान छंटाई प्लेटफार्मों का उपयोग कर, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (autoMCS या) साधन (के तालिका देखें सहित का प्रदर्शन किया गया है सामग्री) 1,14,15 और अधिक विशेष उपकरणों जो एक डिस्पोजेबल कारतूस 7,9 या चिप ३९, के साथ उपयोग के लिए एक मूल्यवान विनिर्देश में नमूना संलग्न जीवों या विषाक्त पदार्थों है कि सुरक्षा के स्तर 2 (बीएसएल-2) या उच्चतर7हैं । इन अर्द्ध स्वचालित तरीकों को अजैव सामग्री को बांध अगर सामग्री चुंबकीय है या एक चुंबकीय मनका पर लेपित होने की क्षमता है पेप्टाइड्स के लिए क्रमबद्ध करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, और विभिंन जीवों (जैसे anaerobic बैक्टीरिया के रूप में) के साथ प्रयोग के लिए अगर छंटाई और विकास की स्थिति बदल रहे हैं । बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों छंटाई के अलावा, वाणिज्यिक autoMCS साधन यहां इस्तेमाल किया भी भाग में मानव एकल श्रृंखला एंटीबॉडी टुकड़े की खोज के प्रारंभिक चरणों के लिए इस्तेमाल किया गया है खमीर की सतह पर प्रदर्शित, आगे अलगाव के बाद फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छंटाई का प्रयोग (FACS) ४०। अर्द्ध स्वचालन के लिए प्राथमिक लाभ समय और प्रयास छँटाई कम कर रहे हैं, और अधिक मजबूत और धोने चरणों के दौरान चुंबकीय मोतियों से unbounded कोशिकाओं के प्रतिलिपि उन्मूलन, कम झूठी सकारात्मक करने के लिए अग्रणी, कम आवश्यक छंटाई दौर, और कम जटिल नीचे-स्ट्रीम विश्लेषण 9,14. वाणिज्यिक autoMCS साधन के मामले में, विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम हो सकता है जो कई पूर्व लोड कार्यक्रम कर रहे हैं, जैसे नकारात्मक पूर्व छँटाई (घट), शुद्धता को प्राथमिकता, अंतिम नमूना मात्रा को कम करने, और बढ़ाने या दुर्लभ कोशिकाओं के अलगाव के लिए संवेदनशीलता को कम करने ४१.
इस काम का ध्यान केंद्रित एक जीवाणु प्रदर्शन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध autoMCS साधन का उपयोग कर पुस्तकालय panning के लिए कार्यप्रणाली का प्रदर्शन है, और सोचा व्याख्या विश्लेषण और में उंमीदवारों के परिणामस्वरूप पूल को कम करने में लागू की प्रक्रिया अंय अनुप्रयोगों के लिए विस्तार की सुविधा के लिए आदेश । प्रदर्शन पुस्तकालय यहां इस्तेमाल किया (सामग्री की तालिका देखें) 12,13 में लगभग 109-1011 अद्वितीय 15-मेर पेप्टाइड्स जीवाणु बाहरी झिल्ली प्रोटीन OmpX के एक संशोधित संस्करण के माध्यम से प्रदर्शित होता है एक में सेल की सतह पर स्वैच्छिक प्रकृति, जो समाधान में मुक्त पेप्टाइड के प्रतिनिधि होने की उंमीद है अगर सिंथेटिक का उत्पादन किया । इस प्रोटीन पाड़ अतिरिक्त YPet मोना के लिए बाध्यकारी के माध्यम से अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए सी-टर्मिनस में एक सकारात्मक नियंत्रण P2X पेप्टाइड शामिल हैं । हालांकि, उपयुक्त विविधता और अंय वांछित आवेदन के लिए आवश्यक अंय विशेषताओं के साथ एक खरीदा या उपंयास पुस्तकालय इस जैव panning प्रक्रिया के साथ इसी तरह काम करना चाहिए, हालांकि कुछ मामूली परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है । इस panning प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रा 1में सचित्र है । इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल अंय स्वचालित चुंबकीय प्लेटफार्मों और अंय छंटाई रणनीतियों छंटाई के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । मैनुअल चुंबकीय एक benchtop चुंबक के साथ छंटाई सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया है, हालांकि अधिक जटिल और समय लेने बहाव के साथ वृद्धि झूठी सकारात्मक 14की वजह से आवश्यक विश्लेषण के साथ, और फिर भी एक वैकल्पिक विकल्प प्रदान करता है कोई स्वचालित चुंबकीय कक्ष सॉर्टिंग डिवाइस उपलब्ध नहीं है, तो autoMCS चरण ।
panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों संबंध रिएजेंट के अलगाव के लिए एक सफल दृष्टिकोण किया गया है, और पेप्टाइड्स जब विशिष्ट मानदंडों की आवश्यकता होती है मांयता के लिए एंटीबॉडी के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान करते हैं, ऐसे चरम वातावरण में स्थिरता के रूप में । इन पुस्तकालयों की autoMCS यहां वर्णित तरीकों का उपयोग कर सुव्यवस्थित किया गया है, और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध autoMCS मंच एक बहुत व्यापक दर्शकों के लिए इस तकनीक का विस्तार । पारंपरिक अदल MCS/FACS की तुलना में बैक्टीरियल डिस्प्ले पुस्तकालयों के लिए छंटाई तरीकों, autoMCS तरीकों कम खर्चीला है क्योंकि वे छंटाई और बाध्य कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम एक और अधिक महंगी FACS साधन में निवेश की आवश्यकता नहीं है, बजाय प्रवाह cytometer के प्रकार है कि यहां प्रयोग किया जाता है, जो केवल 14विश्लेषण करने में सक्षम है । सफल autoMCS द्वारा panning के लिए महत्वपूर्ण कदम जुदाई कार्यक्रम चयन, नकारात्मक संभावित पार reactants के खिलाफ छंटाई झूठी सकारात्मक को कम करने के लिए, FACS का उपयोग कर जब panning बंद करने के लिए निर्धारित करने के लिए पुस्तकालय संवर्धन की निगरानी शामिल हैं, और सैकड़ों अभ्यर्थियों की बोझिल स्क्रीनिंग से बचने के लिए प्रत्याशी पूल का स्मार्ट एनालिसिस कराएंगे ।
उदाहरण के साथ साथ वर्णित दो अलग लक्ष्य, फिलीस्तीनी अथॉरिटी और abrax के लिए चुना जीवाणु प्रदर्शन पुस्तकालय के सफल panning, हालांकि थोड़ा अलग विश्लेषण के प्रत्येक पूल के लिए पेप्टाइड दृश्यों में मतभेदों के कारण रणनीतियों के साथ प्रदर्शन चार राउंड के बाद उम्मीदवार panning. फिलीस्तीनी अथॉरिटी और अधिक सरल मामला था, अनुक्रम के साथ पेप्टाइड दृश्यों से स्पष्ट प्रवृत्तियों का प्रदर्शन विश्लेषण है कि एक बार कम से १४४ कालोनियों में दोहराया । अकेले यह pa लक्ष्य के लिए एक आम सहमति अनुक्रम निर्धारित करने के लिए पर्याप्त था, और उन कालोनियों कि आम सहमति या एक समान अनुक्रम निहित streptavidin नकारात्मक नियंत्रण के लिए बाध्यकारी बनाम फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए बाध्यकारी के अनुपात के संदर्भ में सबसे अच्छा उंमीदवार थे । हालांकि, यह हमेशा मामला नहीं होगा । abrax लक्ष्य के लिए, sequencing १०० कालोनियों पांच दोहराने अनुक्रम के लिए नेतृत्व किया, लेकिन इन दृश्यों में प्रवृत्ति कम स्पष्ट था, एक प्रवृत्ति के अलावा सुगंधित एमिनो एसिड अवशेषों और एसपारटिक एसिड या asparagine शामिल करने के लिए. दोहराया दृश्यों से भविष्यवाणी की “आम सहमति” केवल उत्पादन किया गया है और abrax के लिए संबंध के लिए परीक्षण कर सकते हैं, लेकिन जब से कोई माता पिता के दृश्यों कि सटीक आम सहमति अनुक्रम निहित है, हम अनुक्रम कालोनियों की सूची में लौटे और कहा कि अंय उंमीदवारों कि एक दूसरे के साथ आम में और अधिक प्रवृत्तियों था । वास्तव में, दो कालोनियों अकेले दोहराता से “आम सहमति” के लिए एक समान अनुक्रम निहित, (FWAWF के बजाय FWDTWF), जो tryptophan, फेनिलएलनिन, और एसपारटिक एसिड अवशेषों की एक ही प्रवृत्ति थी लेकिन अलग रिक्ति के साथ । इन पेप्टाइड्स में से एक एक दोहरा अनुक्रम था, एक नहीं था । इन दो दृश्यों, एक तिहाई एक समान संस्करण युक्त अनुक्रम के साथ, शीर्ष 5 abrax के लिए अपनत्व के मामले में परीक्षण binders के बीच में थे । शीर्ष बांधने की मशीन समग्र, कुल्हाड़ी A05, भी इसी तरह की प्रवृत्तियों प्रदर्शित । abrax के लिए परिणाम प्रदर्शित करता है कि एक दृष्टिकोण है जो अनुक्रम विश्लेषण और अपनत्व और विशिष्टता विश्लेषण के बीच कई बार वैकल्पिक कभी आवश्यक होगा, चुना लक्ष्य के आधार पर । abrax लक्ष्य के लिए परिणाम भी विशिष्ट है कि एक बहुत ही प्रोटीन (rivax 1,15) से अधिक प्राप्त किया जा सकता है के स्तर पर प्रदर्शित करता है ।
हमारे अध्ययन के लिए चयनित autoMCS कार्यक्रमों Posselds और Posseld, जो कम आवृत्ति के साथ लेबल लक्षित कोशिकाओं के सकारात्मक चयन के लिए दोनों कर रहे थे, प्रारंभिक आबादी का कम से 5%. दोनों ही मामलों में, कक्ष दो चुंबकीय स्तंभों से गुज़रते हैं । हालांकि, Posselds प्रोग्राम के मामले में, सेल एक्सपोज़र समय ४१बढ़ाने के लिए पहले स्तंभ के माध्यम से अधिक धीमे गुजरते हैं । व्यावसायिक autoMCS डिवाइस के निर्माता द्वारा दिए गए प्रोग्राम विवरणों के अतिरिक्त ( सामग्री तालिका) ४१देखें, इन प्रोग्रामों को कई संभावित प्रोग्रांस की आरंभिक तुलना के बाद चुना गया था । नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं की एक समरूप संस्कृति से बाहर झूठी सकारात्मक खींच से बचने के लिए प्रत्येक कार्यक्रम की क्षमता है, और सफलतापूर्वक एक कम से नुकीला नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं से युक्त मिश्रित संस्कृति से ब्याज की एक लक्ष्य के लिए एक ज्ञात बांधने की मशीन को अलग करने के लिए ज्ञात बांधने का प्रतिशत, की तुलना में थे । यदि महत्वपूर्ण यहां वर्णित अनुप्रयोगों से deviating, एक समान तुलना नए आवेदन के लिए कार्यक्रम के चयन में सहायक हो सकता है । हालांकि, पहले से प्रकाशित इन दो कार्यक्रमों की तुलना परिणाम (Posseld और Posselds) फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए पेप्टाइड संबंध रिएजेंट के अलगाव के लिए पता चला है कि या तो इन प्रोग्रामों के सभी चार दौर के लिए एक समान के साथ पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए नेतृत्व के लिए उपयोग WXCFTC आम सहमति के पीए और दृढ़ संकल्प के लिए अपनत्व और विशिष्टता । मुख्य अंतर है कि Posseld, अपनी तेजी से प्रवाह की दर के साथ थे, और अधिक तेजी से और लक्ष्य के लिए बाध्यकारी संबंध हल किया गया था इसलिए उच्च panning के केवल दो दौर के बाद, जबकि Posselds का उपयोग अधिक अद्वितीय दृश्यों के लिए नेतृत्व में panning के चार दौर के बाद 14. इस से सीखना, रणनीति थोड़ा बदल गया था जब abrax बाध्यकारी पेप्टाइड्स के लिए panning दोनों लाभ को शामिल करने के लिए: Posselds 1 दौर के लिए इस्तेमाल किया गया था इस महत्वपूर्ण कदम के दौरान अधिक जोखिम समय की अनुमति जहां विविधता सबसे अधिक है, लेकिन फिर कार्यक्रम राउंड 2-4 1,15के दौरान सबसे अधिक आत्मीयता बांधने के तेजी से अलगाव के लिए Posseld के लिए बंद किया गया था । यह abrax के लिए आदर्श है, खासकर के बाद से nMFI और बंधन प्रतिशत दोनों abrax के लिए उच्च दौर 4 छंटाई के रूप में या तो कार्यक्रम के साथ दौर 4 छंटाई की तुलना में अधिक थे ( चित्रा 2 और चित्रा 3 और स़डक एट अल. २०१५ 14), लेकिन एक प्रत्यक्ष तुलना एक ही लक्ष्य के साथ दूसरे बनाम एक रणनीति का उपयोग अधिक निर्णायक तुलना के लिए आवश्यक होगा । कौन सा कार्यक्रम एक विशेष अनुप्रयोग के लिए सबसे अच्छा है व्यक्तिगत लक्ष्य पर निर्भर हो सकता है, छंटाई पुस्तकालय का इस्तेमाल किया, और पेप्टाइड अभिव्यक्ति है कि यहां वर्णित शर्तों को किसी भी परिवर्तन के साथ हासिल की है स्तर ।
चर्चा नहीं यहां अजैव सामग्री के साथ panning से संभावित परिणाम हैं, लेकिन हम भी थोक एल्यूमीनियम 2के खिलाफ panning के लिए एक ही जीवाणु प्रदर्शन पुस्तकालय का इस्तेमाल किया है । इस अध्ययन autoMCS का उपयोग नहीं किया गया था, लेकिन इसी तरह के अध्ययन autoMCS का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है अगर सामग्री पर उपलब्ध है, या पर या संयुग्मित, एक चुंबकीय मनका लेपित किया जा सकता है । थोक एल्यूमीनियम अध्ययन में, व्यक्तिगत एमिनो एसिड विश्लेषण और माध्यमिक संरचना मॉडलिंग अलग पेप्टाइड्स के बंधन संबध चला रहा था क्या समझने में मददगार था, के बाद से कोई आम सहमति अनुक्रम 2निर्धारित किया गया था । यहां तक कि जैविक लक्ष्य के साथ, यह समझने की आवश्यकता हो सकती है कि कुछ लक्ष्यों के लिए बाध्यकारी समानता क्या है, यही कारण है कि “eCPX_Sequencing” मैक्रो से उत्पंन स्प्रेडशीट व्यक्तिगत अवशेष आवृत्ति विश्लेषण के साथ एक टैब भी शामिल है । एक आम सहमति की कमी के अलावा कोई दोहरा दृश्यों देखा जाता है, और अवशेषों आवृत्ति कोई पैटर्न से पता चलता है, तथापि, विश्लेषण के अन्य प्रकार की आवश्यकता हो सकती है. इसके अतिरिक्त, आगे छंटाई दौर नीचे के लिए उंमीदवारों की एक बहुत बड़ी संख्या में वांछित लक्ष्य के लिए पर्याप्त संबंध के साथ उन लोगों के चयन स्क्रीनिंग से बचने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
अगली पीढ़ी अनुक्रमण की बढ़ती उपलब्धता के साथ, एक अधिक गहन अध्ययन के लिए अपनत्व का परीक्षण करने से पहले सबसे होनहार उंमीदवारों का निर्धारण करने के लिए और जैव panning के प्रत्येक दौर के बाद संवर्धन की हद निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है । हालांकि, बाइंडिंग विश्लेषण चरण पर ले जाने वाले अनुक्रम को क्लोनिंग द्वारा पुन: बनाया जा सकता है, अगर वे दसियों या सैकड़ों कालोनियों के नियमित कॉलोनी अनुक्रमण के साथ आसानी से अलग करने के लिए उच्च पर्याप्त आवृत्ति के नहीं होते हैं । इस प्रौद्योगिकी अग्रिमों के रूप में, कम खर्चीला और अधिक दिनचर्या बनने, और विशेष रूप से कॉलोनी अलगाव के लिए एक विकल्प के साथ, यह संभावना सबसे अच्छा तरीका है panning डेटा का विश्लेषण होगा । यह तरीका व्यक्तिगत दृश्यों के elucidation के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और पूरे पुस्तकालय, विकसित । इसके अतिरिक्त, छंटाई पुस्तकालय में बैक्टीरिया समय के साथ रूपांतरित हो सकता है, जो तेजी से वृद्धि दर या बैक्टीरिया के साथ कोशिकाओं की ओर छंटाई पूर्वाग्रह सकता है कि जीनोमिक को भी प्रदर्शन पाड़ और पेप्टाइड अभिव्यक्ति के बिना एक सामग्री बांध सक्षम प्रोटीन, के लिए आवृत्ति. कि कारण के लिए, एक बार होनहार उंमीदवारों उभरने, यह प्लाज्मिड डीएनए को अलग करने लायक है, नए सिरे से ई. कोलाई बदलने, और FACS के माध्यम से पुष्टि पेप्टाइड बाध्यकारी । यदि किसी कक्ष-मुक्त स्वरूप में पेप्टाइड का उपयोग करने की योजना बना रहा है, तो मुक्त पेप्टाइड के लिए संबध भी मूल्यांकन किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, एसईबी लक्ष्य के लिए बैक्टीरियल डिस्प्ले के माध्यम से की खोज पेप्टाइड संबंध reएजेंट-सेल का उत्पादन किया गया और एंजाइम से जुड़े immunosorbant परख (एलिसा) के रूप में और अधिक परंपरागत तरीकों से विश्लेषण, और पर सेल (FACS के माध्यम से) और ऑफ सेल (एलिसा के माध्यम से) संबंध दोनों तरीकों 7द्वारा निर्धारित Kdका उपयोग कर तुलना की गई ।
हालांकि बायोटिन की ताकत-streptavidin बातचीत यह प्रोटीन लक्ष्य और बाध्य पेप्टाइड्स पर कब्जा करने के लिए एक आदर्श रणनीति बनाता है, इस प्रक्रिया को अन्य कब्जा रणनीतियों के लिए संशोधित किया जा सकता है । इस तरह के epoxy और carboxylic एसिड मोतियों के रूप में चुंबकीय मोतियों को प्रोटीन के प्रत्यक्ष युग्मन, सफल रहा है और एक बाध्यकारी कदम को हटा । हालांकि, अनुलग्नक रणनीति के आधार पर प्रत्यक्ष अनुलग्नक संभावित बाइंडिंग साइटों को किसी विशिष्ट या गैर-विशिष्ट तरीके से बाधा पहुंचा सकता है । streptavidin मोतियों का उपयोग करने के लिए एक अतिरिक्त लाभ यह है कि कम स्थिर प्रोटीन लक्ष्य हौसले से 30 मिनट में biotinylated किया जा सकता है या जमे हुए संग्रहीत, अगर जरूरत है, जबकि मोती खुद को पार के लिए प्रोटीन के साथ अब गर्मी की आवश्यकता को जोड़ने और कर रहे है आम तौर पर 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित । सुझाया biotinylated प्रोटीन की एकाग्रता शुरू यहां लक्ष्य, ६०० एनएम, कई लक्ष्यों के लिए सफल रहा है, लेकिन यह वृद्धि हुई आत्मीयता के साथ पेप्टाइड कैप्चर एजेंट को अलग करने के लिए संभव हो सकता है अगर यह एकाग्रता कम है । इसके अतिरिक्त, इस विधि के लिए बढ़ाया जा सकता है और अंय जीवाणु प्रदर्शन पुस्तकालयों और अंय जीवों के लिए संशोधित । उदाहरण के लिए, इन चरणों anaerobes के साथ उपयोग के लिए ऑक्सीजन के अभाव में किया जा सकता है, या extremophiles के साथ उपयोग के लिए अंय वातावरणों में विशिष्ट गुणों के साथ पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए । ब्याज की एक विशेष लक्ष्य के लिए निर्धारित पेप्टाइड्स और/आम तौर पर एक जीवित सामग्री के रूप में सेल पर इस्तेमाल किया जा सकता है, या सिंथेटिक ऑफ सेल का उत्पादन किया । कृत्रिम रूप से उत्पादित पेप्टाइड्स आगे भी उच्च आत्मीयता और अधिक मजबूत प्रोटीन Catalyzed कैप्चर (पीसीसी) सेंसर में उपयोग के लिए एजेंटों के विकास के लिए परिपक्व हो सकता है, या अन्य अनुप्रयोगों के लिए जहां एंटीबॉडी आम तौर पर बाध्यकारी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा या मान्यता ३८,५५. आणविक मॉडलिंग भी अपने लक्ष्य के साथ पेप्टाइड की बाध्यकारी स्थान निर्धारित करने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में हाल ही में abrax बाध्यकारी पेप्टाइड्स और आम सहमति के लिए किया गया था चित्रा 5C में सूचीबद्ध 1. कुल मिलाकर, पेप्टाइड संबंध के लिए गैर-panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों एक तेजी से, सीधी, और शक्तिशाली पहचान और प्रोटीन लक्ष्य का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए विकल्प है, और इस अर्द्ध स्वचालित panning दृष्टिकोण दूरगामी अनुप्रयोगों के साथ विश्वसनीय परिणाम का उत्पादन किया है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को अमेरिकी सेना अनुसंधान प्रयोगशाला (ARL) Postdoctoral फैलोशिप कार्यक्रम, ARL के साथ एक अनुबंध के माध्यम से ओक रिज संबद्ध विश्वविद्यालयों द्वारा प्रशासित, डॉ जस्टिन पी Jahnke की नियुक्ति के माध्यम से का समर्थन स्वीकार करना चाहूंगा । शेष धन ARL पर संवेदकों एवं इलेक्ट्रॉनक उपकरणों संचालनालय द्वारा प्रदान किया गया. लेखकों को भी UCSB पर बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालय और YPet मोना रिएजेंट क्लोनिंग के लिए जानकारी साझा करने के लिए Daugherty लैब धंयवाद करना चाहूंगा, डॉ Bryn एडंस YPet में ARL मोना रिएजेंट क्लोनिंग में समर्थन के लिए, डॉ यहोशू Kogot पर अपने प्रारंभिक काम के लिए और बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों के जैव panning में प्रशिक्षण, Edgewood रासायनिक और जैविक केंद्र के Alena शांत व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल plasmids बांटने के लिए और abrax और rivax प्रोटीन, फिलीस्तीनी अथॉरिटी बाध्यकारी पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए तकनीकी सहायता के लिए ब्रांडी डोर्सी, किन गुओ abrax बाध्यकारी पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए प्रारंभिक प्रयोगों की तकनीकी सहायता के लिए, और डॉ जेसिका Terrell उपयोगी इस पांडुलिपि के बारे में चर्चा के लिए ।
autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | Automated cell separator for use with magnetic beads |
Luria Broth, Miller (LB) | Fisher Scientific | BP1426-500 | Growth medium |
Chloramphenicol | Fisher BioReagents | BP904-100 | Antibiotic |
Agar | Fisher Scientific | BP2641-500 | Thickening/geling agent |
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library | Cytomx Therapeutics | N/A; http://cytomx.com/contact/ | On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB. |
L-arabinose | Sigma | A3256-500G | Sugar, for induction of protein expression |
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) | Amresco | 0780-10L | Buffer |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh | Thermo Scientific | PI21327 | Adds biotin molecule to primary amines |
Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | PI28005 | Ensures biotin molecule is covalently bound to protein |
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads | Invitrogen | 65601 | Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | Protein, used as blocking agent for non-specific binding |
D-glucose | Sigma | G8270-1KG | Sugar, for growth and impeding inducible protein expression |
Ypet Mona | UCSB and ARL | N/A | Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13. |
Dylight 488 NHS Ester | Thermo Scientific | 46403 | For conjugating protein target to fluorophore |
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) | Thermo Scientific | S866 | Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin |
BD FACSFlow | Becton, Dickinson, and Company | 342003 | Buffer for running FACS instrument |
autoMACS Columns | Miltenyi Biotech | 130-021-101 | For MACS Separation |
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotech | 130-091-221 | For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide. |
autoMACS Pro Washing Solution | Miltenyi Biotech | 130-092-987 | For autoMACS instrument maintenance |
70% Ethanol | VWR | E505-4L | Decontamination of autoMACS |
Glycerol | Sigma | G6279-1L | For bacterial freezer stocks |
Chill 15 rack | Miltenyi Biotec | 130-092-952 | For MACS Separation |
BD FACSCanto II | Becton, Dickinson, and Company | 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview | For assessment of peptide binding to target |
BD FACSDiva Software | Becton, Dickinson, and Company | 659523 | For assessment of peptide binding to target |
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator | Thermo Scientific | A13346 | Bench top cell separator for use with magnetic beads |
Colony Sequencing | Genewiz | N/A; https://www.genewiz.com/ | DNA and Colony Sequencing Services |
Excel | Microsoft | 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 | For use with sequence analysis macro |
Anthrax Protective Antigen (PA) | List Biological Laboratories, Inc. | 171 | Target protein used as example for representative results. |
Abrax | ECBC and ARL | N/A | Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15. |
Rivax | ECBC and ARL | N/A | Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15. |