Summary
Мы описываем метод, по которому мы определить критические остатков для привязки человека или мышиных моноклональных антител, ориентированные вирусный гемагглютинин вирусов гриппа А. Этот протокол может быть адаптирована к поверхности гликопротеинов других вирусов и их соответствующих нейтрализующих антител.
Abstract
Вирусов гриппа обладают замечательной способностью адаптироваться и избежать иммунного ответа. Одним из способов является антигенные изменения, которые происходят на поверхности гликопротеинов вируса. Поколение побег вариантов — это мощный метод в разъяснение, как вирусы бежать иммунной обнаружения и выявления важнейших остатков, необходимых для антитела связывая. Здесь мы описываем протокол о том, как генерировать вариантов побег вируса гриппа A, используя человека или мышиных моноклональных антител (mAbs), направленных против вирусных гемагглютинина (HA). С помощью нашей техники мы ранее характеризуется критической остатков, необходимые для связывания антител, ориентация на голову или стебля Роман птичьего H7N9 га. Протокол может быть легко адаптирована для других систем вирус. Анализ вариантов побег важны для моделирования антигенный дрейф, определения единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) присвоении сопротивления и фитнес вирус и в разработке вакцин и/или терапии.
Introduction
Подобно другим РНК-вирусов, вирусов гриппа A обладают ошибкам полимеразы, который позволяет для генерации множества антигенные варианты с каждым раундом репликации1,2,3. Вирусом гриппа имеет удивительное способность адаптироваться и уклониться от человека иммунный ответ через антигенный дрейф, который достигается за счет накопления мутаций на поверхностных гликопротеинов, что приводит к потере антитела связывая. Антигенный дрейф вирусных поверхностных гликопротеинов, HA и нейраминидазы (NA), требует необходимость пересмотреть и администрировать вакцина ежегодно.
Технологические достижения в изоляции и поколения антиген специфические антитела дали большое количество вакцины индуцированной mAbs4,5,6,,78. В свою очередь характеристика epitopes mAbs, что широко нейтрализовать вирусы гриппа A значительно способствовало развитие нескольких универсальных гриппа вакцины кандидатов9,10,11, 12,,1314. Разъяснение антигенной след МАБ раскрывает Структурные детерминанты нейтрализации и позволяет для осознанного подхода к разработке вакцины. Однако это ни реалистичным, ни экономически эффективным для лабораторий для структурно характеризуют широкие панели mAbs через кристаллографии рентгеновского снимка или крио электронной микроскопии для того, чтобы карта epitopes антигена вирусного15, 16 , 17 , 18.
Кристаллографии рентгеновского снимка или крио электронная микроскопия требует дорогостоящего оборудования, специализированных методов и, возможно, обширные количество времени для создания данных. Быстрее и альтернативный подход является использование быстрого поколения различных вирусных населения через ошибкам РНК зависимой РНК-полимеразы для создания побег мутантов, чтобы определить epitopes mAbs19,20, 21,,22-23. Поколение побег вариантов не требует специального оборудования и техники и могут выполняться с обычными лабораторные реактивы и оборудование.
Здесь мы описываем метод, который позволяет для картирования критических для привязки МАБ остатков, которые признают гриппа ха.
Protocol
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: количество вирусов гриппа, циркулирующих в человеческой популяции (например, H1, H3) являются биобезопасности уровня 2 класса патогенов, которые должны быть обработаны с осторожностью и надлежащего личного защитного оборудования. Обработки вирусы должны быть одобрены институциональных Наблюдательный Совет. Следующий протокол был утвержден Советом по рассмотрению институциональных на горе Синай.
Примечание: Ха специфические антитела, которые ингибируют репликацию вируса в целом могут быть разделены на i) те, которые связывают на или рядом рецепторов привязки сайта на вершине шаровидные головы и ii), которые связывают дистальных рецепторных привязки домен, который включает в себя боковой шаровых голову и стебель региона HA. Антитела, которые целевой сайт связывания рецептора предотвратить вовлечение мотивы сиаловые кислоты на поверхности клеток-мишеней и может быть измерена с помощью hemagglutination assay ингибирование (HI). Антитела, которые являются HI-отрицательно, как стебель специфические антитела, может по-прежнему препятствовать репликации вируса, но может быть оценена только с помощью анализов нейтрализации.
1. классификации антител на основе Привет и нейтрализации деятельности
- Привет Пробирная
- в 96-луночных V-нижней плиты, добавить 25 мкл ПБС столбцов 2-12.
- Развести МАБ 7B2 (руководитель специфические), 6F12 (стебель специфические) 23 и изотипа управления до 100 мкг/мл в 1 x PBS и аликвота 50 мкл разбавленного антитела препаратов в столбец 1. Также включать элемент не МАБ, добавляя 50 мкл ПБС ( рис. 1A).
- Выполнить 2 раза серийных разведений антител путем передачи 25 мкл из колонки 1 в колонку 2 и так далее. Отменить последние 25 мкл из столбца 12 ( Рисунок 1A).
Примечание: Не забудьте включить строку элемента управления не антитела. - Разбавляют до 8 гемагглютинации единиц/25 мкл разбавленный вирус фондовой запасов вируса (реассортантных вирус, выражая HA и NA из A/California/04/09 с внутренним сегментами A/Puerto Рико/8/34). 25 мкл разбавленного вирус акций (8 гемагглютинации) для каждой скважины (строки A-G).
Примечание: Смесь антител и вирус должен иметь окончательный объем 50 мкл с начальной конечной концентрации 50 мкг/мл. - Инкубировать пластины при комнатной температуре 45 мин (RT)
- Для обратно титрование строки (H), 50 мкл ПБС на скважинах H2 для H12. 100 мкл 8 гемагглютинации единиц/25 мкл хорошо H1. Серийно развести два раза путем передачи 50 мкл от H1 H2 и так далее. Отменить последние 50 мкл от хорошо H12. Наконец, 50 мкл 0,5% курица эритроцитов (РБК) для всех скважин V-нижней плиты 96-луночных.
Примечание: Образцы МАБ в assay должны иметь конечный объем 100 мкл: МАБ (25 мкл), вирус (25 мкл) и РБК (50 мкл). Окончательный объем не МАБ элемента управления должен содержать 25 мкл 1 x PBS, 25 мкл вируса и 50 мкл РБК. - Инкубировать пластину на 4 ° C на 1 ч.
- Читать визуально пластины для HI деятельности. Если есть положительный индикация для конкретного антитела, перейдите к шагу 2.1 для создания вариантов побег. Если антитела HI-отрицательный, переходите ниже шаг 1.2 оценить если антитела нейтрализовать деятельность в assay культуры клетки.
Примечание: Позитивные индикация HI-активных МАБ обозначается темно красный Пелле РБК в центре хорошо ( рис. 1B 7B2), которые формируют слезоточивый падение, когда состоится 96-луночных V-днище под углом 45 °. Отрицательное значение индикации не станет темно красный Пелле РБК в скважине ( рис. 1B 6F12 и не МАБ). Isotype управления также не станет темно красный Пелле РБК и должен выглядеть идентично стебель специфические антитела, 6F12 или не МАБ контролировать образец ( Рисунок 1B) 23.
- Microneutralization assay
- пластина Мадин Darby собак почек (MDCK) клеток на плотности 2 х 10 4 клетки/хорошо в культуре ткани лечение 96-луночных пластины и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO 2 для 17-19 h .
Примечание: Клетки могут также быть позволено придерживаться нижней части скважины для минимум 4 часа перед использованием. - В отдельную тарелку 96-луночных, выполняют семь вывозимому серийных разведений человека МАБ 4D 05 5, CR9114 17 изотипа IgG управления или, в начальной концентрации 200 мкг/мл в 1 X минимальным необходимым среднего (MEM) с tosyl phenylalanyl хлорметил кетон (TPCK)-лечение трипсина (1 мкг/мл) ( Рисунок 2).
Примечание: Строка A должен содержать 75 мкл разбавленного антитела (начиная концентрации 200 мкг/мл). Серийно (3 раза) разбавляют вниз плита путем передачи 25 мкл из строки A B строки и так далее. Строки A до H должны иметь конечный объем 50 мкл. Существует не нужно менять советы между разрежения трансферы. - Разбавляют складе вирус (вирус реассортантных, выражая HA и NA A/Шанхай/1/13 с внутреннего сегмента A/Puerto Рико/8/34) до 100 50% культуры ткани инфекционным дозы (TCID 50) / 50 мкл в 1 x MEM дополнена TPCK-лечение трипсина (1 мкг/мл) 24. Добавьте 50 мкл/хорошо разреженных вируса антитела препараты (шаг 1.2.2). Добавьте 50 мкл 1 X MEM неинфицированных клеток контроля скважин.
- Инкубировать вирус антитела смеси в инкубатор 37 ° C (с 5% CO 2) за 1 ч.
Примечание: Смеси вирус антитела должны иметь общий объем 100 мкл: 50 мкл антител разрежения (шаг 1.1.2) и 50 мкл вирус, содержащий 100 TCID 50 (шаг 1.2.3). - Аспирационная СМИ в скважинах и добавить всего 100 мкл антител вируса смесей в соответствующий Уэллс.
Примечание: Стремление осуществляется с помощью адаптера 8-канальный Аспиратор придает вакуум. Кроме того 8 - или 12-ну многоканальный микро дозатор может использоваться для вручную аспирационная. Все устремленности во время удаления посевным материалом или моет делается с самой высокой концентрацией антитела низкие, без необходимости изменения советы. - Мыть монослой с 200 мкл ПБС. Аспирационная 200 мкл ПБС (как в шаге 1.2.5). Еще раз повторите стирки для в общей сложности двух стирок.
- Заразить монослое клеток MDCK, добавив всего 100 мкл/хорошо вирус антитела смесей (от шага 1.2.4) на монослоя и заразить/температуре при 37 ° C (с 5% CO 2) за 1 ч.
- Во время инфекции, в отдельную тарелку 96-луночных, подготовить еще один набор антител разведениях. Добавить 150 мкл 100 мкг/мл соответственно антитела в строке A и 100 мкл 1 x MEM дополнен трипсином обработанных TPCK (1 мкг/мл) в строках B H. Perform вывозимому разведений передачи 50 мкл из строки A в строке B , и так далее, вплоть до строки H. отменить последние 50 мкл от строки H. Общий объем для каждого хорошо должна равняться 100 мкл. отложите.
Примечание: Антитела разводят в 1 x MEM дополнена TPCK-лечение трипсина (1 мкг/мл). - Аспирационная посевным материалом вируса антитела от монослоя на шаге 1.2.7 и пополнить с всего 100 мкл/хорошо соответствующие антитела разрежения, подготовленную на этапе 1.2.8.
Примечание: Если хорошо содержатся Окончательный антитела концентрации 100 мкг/мл в течение инфекции (шаг 1.2.7), а затем пополнение средств массовой информации должны также содержать окончательный антитела концентрации 100 мкг/мл (шаг 1.2.8). - Инкубировать в течение 24 ч в инкубаторе 37 ° C (с 5% CO 2).
- Аспирационная СМИ от 96-луночных пластин и мыть с 200 мкл/хорошо ПБС три раза.
- Исправить клетки с 100 мкл холодной ацетона 80%, за 1 ч, при -20 ° с.
Примечание: 80% раствор ацетона растворяется в двойной дистиллированной (dd) H 2 O (например, 80 мл ацетона 100% плюс 20 мл ddH 2 0). 80% ацетона раствор может быть охлажденным на льду перед использованием. - Мыть ячейки с 200 мкл/хорошо ПБС три раза.
- Блок пластин с 200 мкл/хорошо 5% молока разводят в 1 X PBS и инкубировать пластины на RT на 1 ч.
- Добавить 100 мкл биотинилированным противогриппозные Нуклеопротеиды (NP) основное антитело разбавленный стоматологов в 1 x PBS/1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и инкубировать пластины в РТ за 1 ч.
Примечание: Для вирусов гриппа B, антитела анти NP конкретным вирусом гриппа B должно использоваться. - Мыть тарелки с ПБС три раза.
- Добавить 100 мкл конъюгата антитела стрептавидина - хрен пероксидазы (ПХ) разводят 1:3,000 в 1 x PBS/1% BSA и инкубировать пластины на RT на 1 ч.
- Мыть тарелки с 200 мкл ПБС три раза.
- Добавления реагента субстрата ПХ на 100 мкл/Ну и инкубировать в темноте на RT.
Примечание: Время инкубации должна быть оптимизирована перед добавлением кислой остановки буфера (см. ниже). Вообще говоря, достаточно 15-30 мин. - Утолить реакции с 50 мкл/хорошо 5 М HCl.
Предупреждение: 5 М HCl является сильнокоррозионные реагент, который может привести к повреждению глаз, кожи и слизистых оболочек. Помимо этого реагента должно быть сделано под вентилируемого капота с надлежащего личного защитного оборудования. - Читать пластины в 492 Нм и вычесть скважин фон (неинфицированных клеток).
- Вычислить процент ингибитирование по следующей формуле:
- Если антитело имеет деятельность нейтрализации (и никакой деятельности HI), переходите к шагу 2.2.
Примечание: Антитела, которые отсутствуют в vitro нейтрализации деятельности будет отсутствие активности HI.
- пластина Мадин Darby собак почек (MDCK) клеток на плотности 2 х 10 4 клетки/хорошо в культуре ткани лечение 96-луночных пластины и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO 2 для 17-19 h .
2. Поколение побег мутант вариантов
Примечание: нейтрализующих антител, которые имеют или отсутствие активности Привет далее анализируются с конкретных протоколов, описанные ниже.
- Протокол 1: HI-плюс/нейтрализации плюсу антител ( Рисунок 3A )
- подготовить запас вирус 10 6 налета, образуя единиц/миллилитр (ОРП/мл) в однократном ПБС в объем 400 мкл.
- Подготовить четыре разбавления антитела интерес к повышению концентрации (например, 0, 0,5, 0,05 и 0,005 мг/мл) в ПБС в объеме 100 мкл на разбавление.
Примечание:-Дикий вирус всегда должна быть пассированной параллельно и в отсутствие антител. Последовательности этих пассированный вирусов будет оказывать помощь в различия между адаптации клетки культуры условий и избежать мутаций. - Смесь 100 мкл 10 6 ОРП/мл вируса с 100 мкл каждого разбавления антитела или 100 мкл ПБС.
- Инкубировать 1 h в инкубаторе 37 ° C (с 5% CO 2). Вихрь кратко. Привнести 200 мкл каждого смеси в конкретных возбудитель бесплатно (SPF) эмбриональные куриные яйца.
- Инкубировать яйца при 37 ° C (без CO 2) для 40-44 ч.
- Пожертвовать вирус инфицированных эмбриональные яйца по инкубации при 4 ° С для не менее 6 ч.
- Урожая allantoic жидкость из яйца, как описано в 24 ,- 25.
- Выполнять hemagglutination assay, как описано выше 24 , 26. Если все allantoic жидкости препаратов не имеют гемагглютинации титры, повторите шаг 2 с антителом разведениях от 0,005 мг/мл до 0,00005 мг/мл.
Примечание: Насыщения концентрация антител HI-положительных может нейтрализовать все настоящее частицы вируса. Таким образом, это может быть необходимо уменьшить количество антител в пассированый. - Подтверждают побег варианты, выполнив Привет пробирного 24 (шаг 1.1).
Примечание: HI-активные антитела блока ха участие сиаловая кислота мотивы на клетки-мишени. Таким образом вирус в присутствии его родственных антитела теряет способность склееных эритроцитов (наличие Пелле РБК). Теоретически побег варианты HI-активные антитела все равно можно привязать мотивы сиаловые кислоты даже в присутствии его родственных антитела и таким образом может склееных эритроцитов (гранулы не РБК). Если Привет антитела интерес по-прежнему поддаются обнаружению, повторите протокол от шага 2.1.2 с более высокой начальной концентрации антитела.
- Протокол 2: HI-негативных/нейтрализации позитивных антител ( рисунок 3B )
Примечание: для того, чтобы генерировать варианты побег против нейтрализующих антител, которые не имеют HI деятельность, вирус должен быть пассированной присутствии все большее количество антител.- Пластины MDCK клетки в 6-ну пластины на плотности 1 х 10 6 клеток/также и Инкубируйте минимум 4 часа в инкубаторе 37 ° C (с 5% CO 2).
- Развести вирус запас до 10 6 ОРП/мл или вируса от предыдущего прохода в 1 x MEM трипсином обработанных TPCK (1 мкг/мл) в объеме 500 мкл.
- Подготовить единый разбавления антитела (0,02 мг/мл, для первоначального прохода или выше для всех после проходы) в 1 x MEM трипсином обработанных TPCK в объеме 250 мкл.
- Смесь 250 мкл разреженных вирус с 250 мкл разбавленного антитела (+ антитела) или 250 мкл 1 x MEM (без управления антитела).
- Инкубировать вирус антитела смесь для 30 мин в инкубаторе 37 ° C (с 5% CO 2).
- Аспирата средства массовой информации, с использованием стекла Пастер Пипетка и мыть монослоя клеток в 1 мл ПБС.
- Добавьте 500 мкл смеси в скважины и инкубировать в инкубатор 37 ° C (с 5% CO 2) за 1 ч.
- После 1 h, дополнение скважин с 2 мл 1 x MEM трипсином, TPCK-лечение (1 мкг/мл).
- Проверить клетки на 48 ч после инфекции признаки цитопатического эффекта (CPE) на микроскопе или выполнить hemagglutination assay для обнаружения вирусных роста 26.
- Если есть брутто CPE в культурах, дополнена антитела, урожай супернатант в нескольких крио трубы, этикетка с номером проход и магазина на -80 ° C.
- Сохранить 100 мкл супернатант заразить свежие монослое MDCKs с 2 мл 1 x MEM дополнена TPCK-трипсина и антитела. Не забудьте включить элемент не антитела для каждого прохода.
Примечание: Увеличение концентрации антитела в два раза (или на усмотрение исследователь) в следующем отрывке (каждые два дня). - Увеличивают концентрацию антител в каждом последовательных проход до тех пор, пока вирус рост по-прежнему жизнеспособной, даже с конечной концентрации 0,6 мг/мл антител. Заморозить несколько флаконов супернатант каждого прохода и хранить на -80 ° C.
Примечание: Элемент не антитела решающую роль в проверке роста вируса от одного прохода в другой. Если есть брутто CPE в элементе не антитела, но не CPE в + антитела группы, это означает, что концентрация антитела была слишком высока и не бежать варианты были созданы. Если есть брутто CPE в элементе не антитела, но только умеренные CPE в + антитела группы, это указывает на наличие потенциальных вариантов побег. В следующем отрывке, увеличить объем проход к 200 мкл супернатант и поддерживать концентрацию антител для увеличения вероятности генерации вариантов бежать.
3. Изоляции побег варианты через доску очистки
- пластины MDCK клетки в 6-ну пластины на плотности 1 х 10 6 клеток/Ну и Инкубируйте минимум 4 часа в инкубаторе 37 ° C (с 5% CO 2).
- Разбавьте антитела в 1 x MEM трипсином обработанных TPCK, начиная с 300 мкг/мл в объеме 250 мкл и перемешать с 250 мкл соответствующего побег мутант вируса. Пассированной в отсутствие антител вируса следует также доска очищенного.
- Аспирационная СМИ из клетки, мыть с ПБС три раза и весь 500 мкл антител вируса смеси (шаг 3.2).
- Инкубировать пластин для 1 h в инкубаторе 37 ° C (с 5% CO 2), убедившись, что рок и обратно каждые 10 мин для предотвращения высыхания монослоя.
- Аспирационная смеси вирус антитела и пополнить скважин с СМИ агар оверлея, содержащие соответствующее количество антител (300 мкг/мл; шаг 3.2).
- Инкубировать пластину для 40-44 h в инкубаторе 37 ° C (с 5% CO 2).
- Круг видимый таблички с маркером сине черного цвета для облегчения комплектации налета.
- Выбрать четыре таблички для каждого бежать мутантов вируса антитела комбинации, а также одичал типа вирусов, которые были пассированной в MDCK клетки или яйца в отсутствие антител.
- Ресуспензируйте бляшки в 100 мкл ПБС.
- Придать всего 100 мкл налета очищенный побег мутант вируса в 10 - дневных SPF эмбриональные куриные яйца.
- Инкубировать яйца для 40-44 h в инкубаторе 37 ° C (без 5% CO 2).
- Выполнять hemagglutination assay подтвердить наличие вируса (шаг 1.1).
4. Добыча вирусной РНК и анализ га последовательности вариации
- экстракт вирусной РНК из 200 мкл побег мутант вируса allantoic жидкости с моно фазовые раствором фенола и гуанидина Изотиоцианаты.
Предупреждение: Фенол это летучие жидкости реагент, который может вызвать кашель, одышка и умеренно раздражает кожу путем контакта с. - Усилить HA сегмента от вирусной РНК с использованием обратной транскриптазы и Джин специфические праймеры для гриппа A HA сегмента 27.
Примечание: Универсальный Праймеры для вирусов гриппа B, описанные в таблице 2 усилить обоих HA (~ 1,800 bp) и NA (~ 1,500 bp) 28. - Решить ПЦР-продукта в гель агарозы 1% и вырезать правильно размера группы (~ 1,800 bp).
- Гель экстракт продукта PCR, с помощью процедуры очистки на основе кремния мембраны и отправить cDNA для секвенирования.
- Определения остатка аминокислоты, необходимые для антитела связывая, дифференцируя мутации на предполагаемый побег вариантов и пассированной одичал тип вируса благодаря адаптации культуры клеток или иммунологические выбор.
- Клонирования PCR продукт, содержащий одичал тип или бежать вариант HA в вектор выражения pCAGGs (Ноти и NheI).
- Связывание антитела к бежать вариант HA может оцениваться с одним из двух вариантов (или оба), описанных ниже.
5. Антитела обязательных анализов из бежать варианты
- иммунофлюоресценции
- тарелка 293T клетки на плотности 2 х 10 4 клетки/также в 96-луночных пластине и инкубировать в инкубаторе 37 ° C (с 5% CO 2) за 24 ч.
- Transfect клетки с 0.10 мкг/хорошо pCAGGS плазмид, кодирование побег мутант HA, вирус пассированной HA и HA одичал типа (unpassaged) с использованием реагента transfection.
- Инкубировать 96-луночных пластины для 48 ч в инкубаторе 37 ° C (с 5% CO 2).
- Исправление с 100 мкл параформальдегида 0,5% за 15 мин на RT.
Предупреждение: Параформальдегида это летучие жидкости реагент, который может вызвать кашель, одышка и умеренно раздражает кожу путем контакта. Он был назначен как потенциальный канцероген человека. Добавление реагента, должно быть сделано в вентилируемые химических Худ. - Мыть с PBS 1 x три раза. Блок с 5% молока в однократном ПБС за 1 час на RT.
- Мыть с ПБС три раза. Проинкубируйте с 5 мкг/мл антитела интерес для 1 h на RT.
- Инкубировать с 100 мкл вторичного антитела (против человека или против мыши Alexa 488) при разбавлении стоматологов в 1 x PBS/1% BSA 1 h в темноте на RT.
- Мыть с ПБС три раза. Наблюдать на флуоресцентный микроскоп для положительных или отрицательных окрашивания ячейки.
- Флуоресценции активированный ячейку Сортировка (FACS)
- тарелка 293T клеток на плотности 2 x 10 5 клеток/также в пластине 6-Ну и инкубировать при 37 ° C (с 5% CO 2) за 24 ч.
- Transfect клетки с 0,50 мкг/хорошо с pCAGGS плазмид кодирования побег мутант HA, вирус только пассированной ха и Ха одичал тип с использованием реагента transfection.
- Инкубировать 6-ну пластины для 48 ч при 37 ° C (с 5% CO 2).
- После 48 ч, аспирационная питательных сред и мыть с ПБС два раза нежно (убедившись, что монослое спокойно).
- Урожая transfected 293T клеток с 500 мкл буфера СУИМ (1 x PBS/2% плода телячьей сыворотки).
Примечание: СУИМ буфера должен быть предварительно охлажденным при 4 ° c перед использованием. - Центрифуга клетки заготавливаемым 293T на 300 g x 5 мин на 4 ° C.
- Аспирационная буфере СУИМ и Ресуспензируйте с 200 мкл буфера СУИМ, содержащий mAbs интереса (конечной концентрации 1-5 мкг/мл). Инкубируйте на RT на 20 мин
- Центрифуга клетки на 300 x g за 5 мин при 4 ° C. мыть два раза с 500 мкл буфера СУИМ. Аспирационная тщательно с стеклянной пипетки Пастера относительно не беспокоить гранулы.
- Ресуспензируйте с 200 мкл буфера СУИМ, содержащий вторичное антитело проспряганное Alexa 488 (окончательное разведение 1:1, 000). Инкубировать в темноте при температуре 4 ° C на 20 мин
- Центрифуга клетки на 300 g за 5 мин при 4 ° C. мыть два раза с 500 мкл буфера СУИМ и тщательно аспирационная мыть буфера.
- Ресуспензируйте в 500 мкл буфера СУИМ и оценить привязки mAbs и/или поликлональных transfected сера клетки с ха, СУИМ.
Примечание: Не забудьте включить элемент не МАБ/поликлональных сыворотки, а также пример untransfected в эксперименте.
Representative Results
Ранее мы использовали вариации этого метода для создания побег варианты для человека и мышиных mAbs, вызванных вирус вакцины против сезонного гриппа, H7N9 вакцинации или последовательных HA ДНК/рекомбинантных белков вакцинации4,5 ,6,7. Как описано выше, антитела впервые были охарактеризованы с помощью Привет и microneutralization анализов с целью информировать нас о которых конкретного протокола продолжать с следующий4,5. Антитела 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 и 07-4D 05 были обнаружены Привет и нейтрализации деятельности против птичьего вируса H7N9 (A/Шанхай/1/2013) (Таблица 1), и таким образом использовался протокол 1 (шаг 2.1). Для mAbs с нейтрализации отсутствие активности Привет, например 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 и S6-B01 (Таблица 1) протокол 2 (шаг 2.2) был использован для создания вариантов побег. Побег мутант сопоставления показали, что многие из антител признать критические остатков в различных местах на вирусный HA4,5 (рис. 4). В то время как большинство HI-положительных антител у бежать мутант остатков вблизи сообщалось ранее антигенных участков H7 га, HI-отрицательных антитела сгенерирована побег мутантов с точечные мутации на стебле регион4,5 .
| Антитела | Привет активность | NEUT деятельность |
| 07-5D 03 | + | + |
| 07-5F01 | + | + |
| 07-5G 01 | + | + |
| 07-4B03 | + | + |
| 07-4E02 | + | + |
| 07-4D 05 | + | + |
| 41-5E04 | - | + |
| 045-051310-2B06 | - | + |
| 042-100809-2F04 | - | + |
| S6-B01 | - | + |
Таблица 1: Таблица антитела Привет и нейтрализации деятельности. Десять mAbs H7-конкретных, изолированных от лиц, вакциной экспериментальной H7N9 демонстрируют разные в vitro противовирусное деятельности5.
| Форвард грунт (5' к 3') | Обратный грунт (5' к 3') | Thermocylcer условия | ||||||||
| IAV | TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG | ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT | 42 ° c 60 мин, 94 ° c на 2 мин/5 циклов 94 ° c для 20 s, 50 ºC для 30 s и 68 ºC за 3 мин 30 сек, затем 40 циклов 94 ° c для 20 s, 58 ° c за 30 s и 68 ºC за 3 мин 30 сек время окончательное расширение на 68 ° c 10 мин | |||||||
| IBV | GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC | CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC | 45 ºC для 60 мин, 55 ° c за 30 мин., 94 ° c на 2 мин/5 циклов 94 ° c для 20 s, 40 ºC для 30 s и 68 ºC за 3 мин 30 сек, затем 40 циклов 94 ° c для 20 s , 58 ° c за 30 сек и 68 ºC за 3 мин 30 сек время окончательное расширение на 68 ° c 10 мин | |||||||
Таблица 2: универсальный гриппа вирус грунты. Грунтовка пары для амплификации HA сегментов гриппа A27 и28 B вирусов и их соответствующих Термоциклер условий.
Рисунок 1: Привет пробирного. (A) A схема для установки-вверх пробирного HI для проверки деятельности двух мыши H1-конкретных mAbs 7B2 (руководитель специфические) и 6F12 (стебель специфические) с использованием 96-луночных V-днище и (B) пример результатов Привет пробирного23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: проба Microneutralization. Схема для создания microneutralization анализа для проверки деятельности два человека mAbs 05 4 d5 и CR911417. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: поколение побег мутантов. Предложил методологию будет зависеть Привет и microneutralization активности, проявляемой антитела. Поколения побег мутантов против (A) нейтрализующих антител HI-положительных может потребовать одного прохода в яйцах, в то время как нейтрализующих антител HI-отрицательных (B) может включать несколько проходов с увеличением количества антител в Культура клеток тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: пример epitope составляя карту Роман птичьего H7N9 га с побега мутант варианты. Вакцины индуцированной антитела изолированы от лиц, прививки с кандидатом H7N9 гриппа, вакцины были использованы для создания побег мутант варианты. Каждый остатков указывается в красный представляет расположение важнейших аминокислот, необходимых для эффективной привязки МАБ. Данные были адаптированы с Dunand-Генри et al., 2015-4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Хотя большинство из остатков, выявленных через побег мутанты были точные, один из основных оговорок этого подхода является, что точечные мутации побег вариантов не может обязательно карта в молекулярных след антител определяется структурный анализ. Это из-за мутации в некоторых остатков способность привести к конформационные изменения дистальной в расположение остатков мутировал, аналогично аллостерический эффект. Другое ограничение состоит в том, что эта методология могут осуществляться только для нейтрализации антител; антитела, которые отсутствуют в vitro селективного давления не приведет к бежать мутантов. Однако это ограничение можно преодолеть с помощью группы побег вариантов, созданных ранее характеризуется нейтрализующих антител. Загар et al. бежать вариант нейтрализации МАБ H7N9 вирус используется для сопоставления epitope не нейтрализуя антитело7.
Тем не менее выяснения epitopes антитела через поколение побег вариантов обеспечивает жизнеспособную альтернативу Кристаллография и крио электронная микроскопия, оба из которых требует обширных инвестиций оборудования. Другие альтернативы, чтобы определить минимальный привязки региона mAbs с помощью аланина сканирование или пептид сканирование/усечение мутантов. Аланин, сканирование мутагенеза может потребовать значительное количество работ в генерации большое количество вариантов во время отбора29, в то время как пептид сканирование ограничивается линейной epitopes30. Метод, описанный в настоящем Протоколе не требует специального оборудования или техники, и в самом деле, делает использование существующих в vitro нейтрализации анализы изменения для создания вариантов побег антител интерес.
Протокол для создания побег вариантов, которые требуют несколько проходов (например, стебель специфические антитела) сильно зависит от начальной концентрации антител в проход 0. Лучше ошибаться в сторону осторожности и начать журнал в половину меньше половины максимальной тормозной концентрации антитела журнал и разрешить надежные вирус роста. Исследователь может предположить, что высокий титр вируса культуры при наличии иммунологической низкого давления будет иметь большой генетической вариации в вирусной популяции. Побег варианты могут быть выбраны для, постепенно увеличивая концентрация антител в следующие отрывки. В случае, если вирус роста уменьшается, количество вирусных супернатант может быть увеличена в следующий проход при сохранении такое же количество концентрации антител в предыдущем проходе.
Цель большинства универсальных противогриппозных вакцин является выявить надежный антител ответ на стебле регион HA. Анализ вариантов побег на стебле специфические антитела имеют важное значение в определении взаимоотношений между фитнес вирус гриппа и иммунологические давления. Интересно, что побег мутантов вирусов результате стебель конкретных mAbs были все ослабленных в естественных условиях в мышиных LD50 исследования4. Эти исследования дают веские основания для платформ, основанных на стебле вакцинации. Кроме того этот протокол может использоваться для идентификации побег мутантов, чтобы другие анти-вирусные соединений, например ингибиторов малые молекулы. Наконец эта методология не ограничивается гриппа вирус поверхностных гликопротеинов, но также может быть более широко применяется для определения epitopes других вирусных гликопротеинов.
Disclosures
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Этот проект частично финансируется с федеральных средств от национального института аллергии и инфекционных болезней, национальные институты здравоохранения, Департамент здравоохранения и социальных служб, под CEIRS договора HHSN272201400008C (Ф.К); НИЗ U19AI109946-01 (Ф.К.); и P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid | Corning, Inc. | 353072 | Assay plate use for the microneutralization assay |
| Falcon 96-well clear V-bottom plate | Corning, Inc. | 353263 | Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay |
| 1X Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095080 | Infection medium |
| Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2 |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) | EMD Millipore | MAB8258B | An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) | EMD Millipore | MAB8260B-5 | An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses |
| Streptavidin-HRP antibody | EMD Millipore | 18-152 | This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody |
| HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP |
| 96-well V-bottom plate | Nunc | 249662 | Assay plate used for the hemagglutination assay |
| Chicken red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate |
| TRIzol | Ambion | 15596026 | Extraction of RNA |
| Superscript III | Invitrogen | 12574018 | Reverse transcriptase |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Isolation of amplified PCR product |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Transfection reagent |
| Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | Fluorescent secondary antibody for human antibodies |
| Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Fluorescent secondary antibody for murine antibodies |
| 6-well polystyrene microplate | Corning, Inc. | 353934 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Nalgene long term storage Cryo-tubes | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | Freezing of viral culture supernatant |
| reassortant A/California/04/09 (H1) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| Bovine serum albumin solution (35%) | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| Qiagen gel extration kit | Qiagen | 28704 | Silica-membrane-based purification of DNA fragments |
References
- Shaw, M. L., Palese, P. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).
- Nelson, M. I., Holmes, E. C.
- Lauring, A. S., Andino, R. Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses. PLoS Pathog. 6 (7), e1001005 (2010).
- Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains. J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).
- Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., Lee, P. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Tan, G. S., Leon, P. E., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Pathog. 12 (4), e1005578 (2016).
- Smith, K., Garman, L., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Steel, J., Lowen, A. C., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Wang, T. T., Tan, G. S., et al. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).
- Impagliazzo, A., Milder, F., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).
- Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses. Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).
- Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate. mBio. 7 (2), e00257 (2016).
- Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).
- Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies. Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).
- Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin. Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).
- Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants. J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).
- Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Geneva: World Health Organization. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J Vis Exp. (97), e52421 (2015).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA. J Vis Exp. (42), e2057 (2010).
- Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).
- Zhou, B., Lin, X., et al. Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics. J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).
- Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. Exploring and designing protein function with restricted diversity. Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).
- Chen, C. -W., Chang, C. -Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J Vis Exp. (121), e55417 (2017).
