Summary
Vi beskriver en metode som vi identifisere kritiske rester kreves for binding av menneskelige eller murine monoklonale antistoffer som mål i viral hemagglutinin av influensa A virus. Protokollen kan tilpasses andre virus overflate glykoproteiner og deres tilsvarende nøytraliserende antistoffer.
Abstract
Influensavirus viser en bemerkelsesverdig evne til å tilpasse og unngå vert immunrespons. En måte er gjennom antigen endringer på overflate glykoproteiner av viruset. Generering av flukt varianter er en kraftig metode i Klargjørende hvordan virus unnslippe immun gjenkjenning og identifisere kritiske rester kreves for antistoff bindende. Her beskriver vi en protokoll på hvordan å generere influensa A virus escape varianter ved å benytte menneskelige eller murine monoklonale antistoffer (mAbs) rettet mot den viral hemagglutinin (HA). Med bruk av våre teknikk preget vi tidligere avgjørende rester kreves for binding av antistoffer målretting enten leder eller stengel av den romanen avian H7N9 HA. Protokollen kan lett tilpasses for andre virus systemer. Analyser av flukt varianter er viktig for modellering antigen drift, bestemme single nukleotid (SNPer) overdragelse motstand og virus fitness, og i utformingen av vaksiner og/eller therapeutics.
Introduction
I likhet med andre RNA-virus, influensa A virus har en feilutsatt utvalg som tillater generering av et mangfold av antigen varianter med hver runde replikering1,2,3. Influensa A-viruset har en forbausende evne til å tilpasse og unngå menneskelig immunrespons via antigen drift, noe som oppnås gjennom en opphopning av mutasjoner på overflate glykoproteiner som fører til tap av antistoff bindende. Antigen drift av viral overflate glykoproteiner, HA og neuraminidase (NA), nødvendiggjør behovet for å endre og administrere vaksinen årlig.
Teknologiske fremskritt i isolasjon og generasjon av antigen-spesifikke antistoffer har gitt mange vaksine-indusert mAbs,4,,5,,6,,7,,8. I sin tur har karakterisering av epitopes av mAbs som grovt nøytraliserer influensa A virus sterkt hjulpet utviklingen av flere universell influensa vaksine kandidater9,10,11, 12,13,14. Klargjørende antigen fotavtrykk av en mAb avslører de strukturelle determinantene av nøytralisering og tillater informert tilnærming mot vaksine design. Men er det realistisk verken kostnadseffektiv for laboratorier som karakteriserer strukturelt omfattende paneler av mAbs gjennom Røntgenkrystallografi eller cryo-elektronmikroskop tilknytte epitopes på viral antigen15, 16 , 17 , 18.
Røntgenkrystallografi eller cryo-elektronmikroskop krever dyrt utstyr, spesialiserte teknikker og potensielt en omfattende mengde tid til å generere dataene. En alternativ og raskere tilnærming er å utnytte den raske generasjonen av forskjellige viral befolkningsgrupper via feilutsatte RNA-avhengig RNA polymerase generere flukt mutanter for å fastslå epitopes mAbs19,20, 21,22,23. Escape varianter krever ikke noe spesiell utstyr eller teknikk og kan utføres med konvensjonelle laboratorium reagenser og utstyr.
Her beskriver vi en metode som tillater kartlegging av kritisk rester kreves for mAb bindende som gjenkjenner influensa HA.
Protocol
Advarsel: en rekke influensavirus i befolkningen (f.eks H1, H3) er biosikkerhet nivå 2 klasse patogener som må håndteres med forsiktighet og riktig personlig verneutstyr. Håndtering av virus må godkjennes av institusjonelle Review Board. Følgende protokollen ble godkjent av institusjonelle anmeldelsen bord på Mount Sinai.
Merk: HA-spesifikke antistoffer som hemmer viral replikasjon kan generelt kategoriseres i) de som binder på eller ved siden av reseptor binding området på toppen av globular hodet og ii) de som binder distale reseptor bindingen domenet, som inkluderer den laterale siden av globular hodet og forfølge regionen HA. Antistoffer som målretter reseptor binding området forhindre engasjement sialic acid motiver på overflaten av målcellene og kan måles ved hjelp av en hemagglutination hemming (HI) analysen. Antistoffer som HI-negativ, som stengel-spesifikke antistoffer, kan fortsatt hemmer viral replikasjon, men kan bare bli vurdert ved hjelp nøytralisering analyser.
1. kategorisere antistoffer basert på HI og nøytralisering aktiviteter
- HI analysen
- en 96-brønns V bunn plate, legge til 25 µL av 1 x PBS kolonner 2 til 12.
- Fortynne mAb 7B2 (leder-spesifikke) og 6F12 (stengel-spesifikk) 23 en isotype kontroll til 100 µg/mL i 1 x PBS og aliquot 50 µL av utvannet antistoff forberedelsene til kolonne 1. Også inkludere en ingen mAb kontroll ved å legge til 50 µL av 1 x PBS ( figur 1A).
- Utføre 2-fold føljetong fortynninger av antistoffer ved å overføre 25 µL fra kolonne 1 kolonne 2, og så videre. Forkaste de siste 25 µL fra kolonnen 12 ( figur 1A).
Merk: Kontroller at en rad med ingen antistoff kontroll. - Fortynne virus lager (en reassortant virus uttrykke HA og NA av A/California/04/09 med de interne segmentene av A/Puerto Rico/8/34) til 8 hemagglutination enheter/25 µL utvannet virus lager. Tilsett 25 µL av utvannet virus aksjer (8 hemagglutination) hver brønn (rader A til G).
Merk: Antistoff og virus blandingen bør ha et endelig antall 50 µL med en start siste konsentrasjon av 50 µg/mL. - Incubate platen ved romtemperatur (RT) for 45 min.
- For rygg-titrering raden (H), legge til 50 µL av 1 x PBS på brønner H2 H12. Legg 100 µL av 8 hemagglutination enheter/25 µL til godt H1. Serielt fortynne todelt ved å overføre 50 µL fra H1 til H2, og så videre. Kast de siste 50 µL fra godt H12. Til slutt legger 50 µL av 0,5% kylling røde blodlegemer (RBC) alle brønner i 96-brønnen V-bunnplaten.
Merk: MAb prøvene i analysen bør ha et siste volum på 100 µL: mAb (25 µL), virus (25 µL) og RBC (50 µL). Det siste bindet ingen mAb kontrollen skal inneholde 25 µL av 1 x PBS, 25 µL av virus og 50 µL av RBC. - Incubate platen ved 4 ° C i 1 h.
- Lese visuelt platene HI aktivitet. Hvis det er en positiv avlesning for et bestemt antistoff, Fortsett med trinn 2.1 å generere escape varianter. Hvis antistoffer er HI-negativ, fortsette under gå 1.2 å vurdere om antistoffer har nøytralisere aktivitet i en celle kultur analysen.
Merk: En positiv presentasjon av en HI-aktiv mAb angis av mørk rød RBC pellets i midten av en godt ( figur 1B 7B2) som vil danne en tåre dråpe når 96-brønns V-bunnplaten holdes i en vinkel på 45 grader. En negativ avlesning vil ikke danne en mørk rød RBC pellet brønnen ( figur 1B 6F12 og ingen mAb). Kontrollen isotype vil også ikke danne mørk rød RBC pellets og bør se samme stengel-spesifikke antistoffer, 6F12 eller den ingen mAb kontrollere prøven ( figur 1B) 23.
- Microneutralization analysen
- Plate Madin Darby hjørnetann nyre (MDCK) celler ved en tetthet 2 x 10 4 celler/godt i en vev kultur behandlet 96-brønns plate og ruge på 37 ° C og 5% CO 2 17 til 19 h .
Merk: Cellene kan også være tillatt å forholde seg til bunnen av brønnen i minst 4 timer før bruk. - i en separat 96-brønns plate, utføre syv 3-fold føljetong fortynninger av den menneskelige mAb 4D 05 5, CR9114 17 eller isotype IgG-kontroll, i en start konsentrasjon av 200 µg/mL i 1 X Minimal viktig Medium (MEM) med tosyl phenylalanyl chloromethyl keton (TPCK)-behandlet trypsin (1 µg/mL) ( figur 2).
Merk: Raden A skal inneholde 75 µL utvannet antistoff (starter konsentrasjon av 200 µg/mL). Serielt fortynne (3-fold) ned platen ved å overføre 25 µL fra rad A rad b og så videre. Rader A til H bør har siste 50 µL. Det er ikke nødvendig å endre tips mellom fortynning overføringer. - Fortynne virus lager (reassortant virus uttrykke HA og NA av A/Shanghai/1 /-13 med interne segment av A/Puerto Rico/8/34) til en 100 av 50% vev kultur smittsomme dose (TCID 50) / 50 µL 1 x MEM supplert med TPCK-behandlet Trypsin (1 µg/mL) 24. Legge til 50 µL/vel av utvannet virus antistoffer forberedelsene (trinn 1.2.2). Legge til 50 µL av 1 X MEM infisert celle kontroll brønnene.
- Ruge virus-antistoff blandinger i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) for 1 h.
Merk: Virus-antistoff blandinger bør ha et totalt volum på 100 µL: 50 µL av antistoff fortynning (trinn 1.1.2) og 50 µL av virus som inneholder 100 TCID 50 (trinn 1.2.3). - Sug opp media i brønnene og legge det hele 100 µL av virus-antistoff blandinger til tilsvarende brønner.
Merk: Aspirasjon er gjort ved hjelp av en 8-kanals aspirator kortet festet til et vakuum. Alternativt kan en 8 - eller 12-godt flerkanals mikro-pipette brukes manuelt inneholder. Alle aspirasjon under inoculum fjerning eller vasker er gjort fra den høyeste konsentrasjonen av antistoff den laveste, uten behov for å endre tips. - Vask monolayer med 200 µL av 1 x PBS. Sug opp 200 µL av 1 x PBS (som trinn 1.2.5). Gjenta vask igjen for totalt to vasker.
- Infisere monolayer MDCK celler ved å legge til hele 100 µL/brønnen virus-antistoff blandinger (fra trinn 1.2.4) på monolayer og infisere/ruge ved 37 ° C (med 5% CO 2) i 1 h.
- Under infeksjon, i en separat 96-brønns plate, forberede et annet sett av antistoff fortynninger. Legge til 150 µL av 100 µg/mL respektive antistoffer i rad A og 100 µL av 1 x MEM supplert med TPCK-behandlet trypsin (1 µg/mL) i rader B å H. utføre 3-fold fortynninger ved å overføre 50 µL fra rad A rad b , og så videre, til rad H. forkaste de siste 50 µL fra rad H. Det totale volumet for hver vel bør tilsvare 100 µL. avsatt.
Merk: Antistoffer er utvannet i 1 x MEM supplert med TPCK-behandlet trypsin (1 µg/mL). - Sug opp virus-antistoff-inoculum fra monolayer i trinn 1.2.7 og fylle med hele 100 µL/godt av den aktuelle antistoff fortynning i trinn 1.2.8.
Merk: Hvis et godt inneholdt en siste antistoff konsentrasjon 100 µg/ml under infeksjon (trinn 1.2.7), deretter fylle media bør også inneholde en endelig antistoff konsentrasjon 100 µg/ml (trinn 1.2.8). - Incubate 24 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Sug opp media fra 96-brønns platene og vaskes med 200 µL/godt av 1 x PBS tre ganger.
- Fikse cellene med 100 µL av kaldt 80% aceton 1t på -20 ° C.
Merk: 80% aceton løsningen er utvannet i dobbel destillert (dd) H 2 O (f.eks, 80 mL av 100% aceton pluss 20 mL ddH 2 0). 80% aceton løsningen kan bli kjølt på is før bruk. - Vask cellene med 200 µL/godt av 1 X PBS tre ganger.
- Blokk med 200 µL/godt 5% melk fortynnet i 1 X PBS og ruge plater på RT for 1 h.
- Legge til 100 µL biotinylated anti-influensa et nucleoprotein (NP) primære antistoff utvannet 1:2,000 i 1 x PBS/1% bovin serum albumin (BSA) og ruge plater på RT for 1 h.
Merk: For influensa B virus, et influensa B virus-spesifikke anti-NP antistoff bør brukes. - Vask platene med 1 x PBS tre ganger.
- Tilsett 100 µL streptavidin-hest reddik peroxidase (HRP) konjugat antistoff utvannet 1:3,000 i 1 x PBS/1% BSA og ruge platene på RT for 1 h.
- Vask platene med 200 µL av 1 x PBS tre ganger.
- Legger til HRP substrat reagens 100 µL/godt og ruge i mørket på RT.
Merk: Inkubasjon tiden skal være optimalisert før en syrlig stoppe bufferen (nedenfor). Generelt, 15 til 30 min er tilstrekkelig. - Slukke reaksjon med 50 µL/vel av 5 M HCl.
FORSIKTIG: 5M HCl er en svært etsende reagens som kan forårsake skade på øyne, hud og slimhinner. Tillegg av denne reagensen bør gjøres under ventilerte hette med riktig personlig verneutstyr. - Lese platene på 492 nm og trekke bakgrunn (infisert celler) brønnene.
- Beregner prosenten hemming med følgende formel:
- et antistoff har nøytralisering aktivitet (og ingen HI aktivitet), går du til trinn 2.2.
Merk: Antistoffer som mangler i vitro nøytralisering aktivitet vil mangle HI aktivitet.
- Plate Madin Darby hjørnetann nyre (MDCK) celler ved en tetthet 2 x 10 4 celler/godt i en vev kultur behandlet 96-brønns plate og ruge på 37 ° C og 5% CO 2 17 til 19 h .
2. Generasjon unnslippe Mutant varianter
Merk: nøytraliserende antistoffer eller mangler HI aktivitet analyseres videre med bestemte protokoller beskrevet under.
- Protokollen 1: HI-positive/nøytralisering-positiv antistoffer ( figur 3A )
- forberede et virus lager av 10 6 plakk dannes enheter/milliliter (PFU/mL) i 1 x PBS i et 400 µL volum.
- Forberede fire fortynninger av antistoffer interesse økende konsentrasjoner (f.eks 0, 0,5, 0,05 og 0.005 mg/mL) i 1 x PBS i et volum på 100 µL per fortynning.
Merk: Vill-type virus skal alltid være passaged parallelt og i fravær av antistoff. Sekvenser av disse passaged virus vil hjelpe skille mellom tilpasning til celle oppdrettsforholdene og unnslippe mutasjoner. - Blanding 100 µL av 10 6 PFU/mL av virus med 100 µL av hver antistoff fortynning eller 100 µL av 1 x PBS.
- Incubate 1 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2). Vortex kort. Injisere 200 µL av hver blanding i spesifikke-patogen gratis (SPF) embryonated chicken egg.
- Ruge eggene ved 37 ° C (uten CO 2) i 40-44 h.
- Ofre virus infisert embryonated egg av rugende ved 4 ° C i minst 6 h.
- Høste allantoic væske fra egg, som beskrevet tidligere 24 , 25.
- Utfører hemagglutination analysen, som beskrevet over 24 , 26. Hvis alle allantoic væske forberedelsene ikke har hemagglutination titers, gjenta fra trinn 2 med antistoff fortynninger mellom 0.005 mg/mL 0.00005 mg/mL.
Merk: En mette konsentrasjon av et HI-positive antistoff kan nøytralisere alle viruspartikler tilstede. Derfor kan det være nødvendig å redusere mengden av antistoff i den passaging. - Bekrefte varianter av flukt ved å utføre HI analysen 24 (trinn 1.1).
Merk: HI-aktiv antistoffer blokkere HA engasjement sialic acid motiver på målcellene. Derfor mister et virus i nærvær av sine beslektet antistoff evnen til å agglutinate RBCs (tilstedeværelsen av RBC pellet). Teoretisk sett, rømme varianter av HI-aktiv antistoffer kan fortsatt binde sialic acid motiver selv i nærvær av sine beslektet antistoff og dermed kan agglutinate RBCs (ingen RBC pellet). Hvis HI antistoff rundt er fortsatt synlig, gjenta protokollen fra trinn 2.1.2 med en høyere Start konsentrasjon av antistoffer.
- Protokollen 2: HI-negativ/nøytralisering-positiv antistoffer ( figur 3B )
Merk: for å generere escape varianter mot nøytralisere antistoffer som mangler HI aktivitet, viruset må være passaged i nærvær av økende mengder av antistoffer.- Plate MDCK celler i en 6-vel plate på en tetthet 1 x 10 6 celler/godt og ruge minimum 4 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Fortynne virus aksjen til 10 6 PFU/mL eller virus fra forrige avsnitt i 1 x MEM med TPCK-behandlet trypsin (1 µg/mL) i et 500 µL volum.
- Forberede en enkelt fortynning av antistoff (0.02 mg/mL for den opprinnelige passasjen eller høyere for alle etter passasjer) 1 x MEM med TPCK-behandlet trypsin i et 250 µL volum.
- Blanding 250 µL av utvannet virus med 250 µL av utvannet antistoff (+ antistoff) eller 250 µL 1 x MEM (ingen antistoff kontroll).
- Ruge virus-antistoff blandingen i 30 min i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Leveringstanken media med et glass Pasteur Pipetter og vask monolayer celler med 1 mL 1 X PBS.
- Legg til 500 µL av blandinger i brønnene og ruge i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) for 1 h.
- Etter 1 h, komplettere brønner med 2 mL 1 x MEM med TPCK-behandlet trypsin (1 µg/mL).
- Sjekk cellene på 48 timer etter infeksjon etter tegn cytopathic effekt (CPE) på mikroskopet eller utføre en hemagglutination analysen for å oppdage virus vekst 26.
- Hvis det er grov CPE i kulturer supplert med antistoff, høste nedbryting i flere cryo-rør, etiketten med passasje nummer og butikk på-80 ° C.
- Lagre 100 µL nedbryting å infisere en fersk monolayer av MDCKs med 2 mL 1 x av MEM supplert med TPCK-trypsin og antistoff. Husk å inkludere en ingen antistoff kontroll for hver passering.
Merk: Øke konsentrasjonen av antistoffer av todelt (eller av forskeren) i neste gangen (hver to dager). - Øker konsentrasjonen av antistoffer i hver påfølgende passasje til virus vekst er fortsatt levedyktig selv med en siste konsentrasjon av 0.6 mg/mL antistoff. Fryse flere ampullene i nedbryting av hver passasje og lagre på-80 ° C.
Merk: Ingen antistoff kontrollen er avgjørende å kontrollere veksten av virus fra en passasje til en annen. Hvis det er grov CPE i ingen antistoff kontrollen, men ingen CPE i den + antistoff-gruppen angir at konsentrasjonen av antistoffer var for høy og ingen rømme varianter ble generert. Hvis det er brutto CPE i ingen antistoff kontrollen, men moderate CPE i den + antistoff-gruppen angir tilstedeværelsen av potensielle escape varianter. I neste gangen, øke passasje volumet 200 µL av nedbryting og opprettholde konsentrasjonen av antistoff å øke sannsynligheten for å generere escape varianter.
3. Isolering av unnslippe varianter gjennom plakk rensing
- Plate MDCK celler i en 6-vel plate på en tetthet 1 x 10 6 celler/godt og ruge minimum 4 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Fortynne antistoffer i 1 x MEM med TPCK-behandlet trypsin starter på 300 µg/mL i et volum på 250 µL og bland med 250 µL av tilsvarende escape mutant virus. Virus passaged i fravær av antistoff skal plakk renset.
- Sug opp media fra cellene, vask med 1 x PBS tre ganger og legg det hele 500 µL av virus-antistoff blandingen (trinn 3.2).
- Ruge platene 1t i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) sørge for å rocke og tilbake hvert 10 min å hindre tørking av monolayer.
- Sug opp virus-antistoff blandinger og fylle brønnene med overlegg agar mediet som inneholder tilsvarende mengder antistoff (300 µg/mL, trinn 3.2).
- Ruge platen i 40-44 h i en 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Sirkel synlig plaketter med en blå eller svart farget markør til rette plakk plukking.
- Utvalgte fire plaketter for hver unnslippe mutant virus-antistoff kombinasjon, samt vill-type virus som ble passaged i MDCK celler eller egg i fravær av antistoff.
- Resuspend plakk i 100 µL av 1 x PBS.
- Injisere det hele 100 µL av plakk renset escape mutant virus i 10 - dagers gammel SPF embryonated chicken egg.
- Ruge eggene 40-44 h i en 37 ° C inkubator (uten 5% CO 2).
- Utfører en hemagglutination analysen for å bekrefte tilstedeværelse av virus (trinn 1.1).
4. Utvinning av Viral RNA og analyse av HA sekvens variasjon
- ekstrakt av viral RNA 200 µL escape mutant virus allantoic væske med en mono-phasic løsning av fenol og guanidine isothiocyanate.
FORSIKTIG: Fenol er en flyktig væske reagens som kan forårsake hoste, kortpustethet og moderat irritere huden av kontakt. - Forsterke HA segmentet fra viral RNA med bruk av en revers transkriptase og gen-spesifikke primere for influensa A HA segment 27.
Merk: De universelle primerne for influensavirus B som er beskrevet i tabell 2 forsterke begge HA (~ 1800 bp) og NA (~ 1500 bp) 28. - Løse RT PCR produktet i en 1% agarose gel og kutte ut riktig størrelse bandet (~ 1800 bp).
- Gel ekstrakt PCR produktet bruker en silica-membran basert rensing prosedyren og sende cDNA ut for sekvensering.
- Identifisere aminosyre rester kreves for antistoff bindende ved å skille mutasjoner på antatte escape varianter og passaged vill-type virus på grunn av celle kultur tilpasning eller immunologiske utvalg.
- Klon PCR produktet inneholder vill-type eller flykte variant HA i en pCAGGs uttrykk vektor (NotI og NheI).
- Binding av antistoffer mot flykte variant HA kan vurderes med ett av to alternativer (eller begge) beskrevet under.
5. Antistoff binder analyser av unnslippe varianter
- Immunofluorescence
- Plate 293T cellene på en tetthet 2 x 10 4 celler/godt i en 96-brønns plate og ruge i 37 ° C inkubator (med 5% CO 2) for 24 timer.
- Transfect cellene med 0.10 µg/godt av pCAGGS plasmider koding escape mutant HA, virus passaged HA og vill-type HA (unpassaged) med bruk av en transfection reagens.
- Ruge 96-brønns platene 48 h i 37 ° C inkubator (med 5% CO 2).
- Fastsette 100 µL av 0,5% paraformaldehyde i 15 min på rett
FORSIKTIG: Paraformaldehyde er en flyktig væske reagens som kan forårsake hoste, kortpustethet og moderat irritere huden ved kontakt. Det har blitt utpekt som et mulig menneskelig karsinogen. Tillegg av reagensen bør gjøres i ventilerte kjemiske hette. - Vask med PBS 1 x tre ganger. Blokk med 5% melk i 1 x PBS 1t på RT.
- Vask med 1 x PBS tre ganger. Inkuber med 5 µg/mL antistoff rundt 1t på RT.
- Incubate med 100 µL sekundære antistoff (anti- eller anti-mus Alexa 488) på en fortynning av 1:2,000 i 1 x PBS/1% BSA 1t på RT i mørket.
- Vask med 1 x PBS tre ganger. Observere cellene i fluorescerende mikroskop for positive eller negative farging.
- Fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)
- Plate 293T cellene på en tetthet 2 x 10 5 celler/godt i en 6-vel plate og ruge ved 37 ° C (med 5% CO 2) i 24 h.
- Transfect cellene med 0,50 µg/godt med pCAGGS plasmider koding escape mutant HA, virus passaged bare HA og vill-type HA med bruk av en transfection reagens.
- Ruge 6-vel platene for 48 h på 37 ° C (med 5% CO 2).
- Etter 48 timer, Sug opp vekst media og vaskes med 1 x PBS to ganger forsiktig (pass på at monolayer er uforstyrret).
- Høste transfekterte 293T cellene med 500 µL av FACS buffer (1 x PBS/2% fosterets kalv serum).
Merk: FACS bufferen skal pre kjølt på 4 ºC før bruk. - Sentrifuge høstet 293T cellene på 300 x g i 5 min på 4 ° C.
- Sug opp FACS bufferen, og resuspend med 200 µL FACS bufferen som inneholder mAbs av interesse (siste konsentrasjon av 1-5 µg/mL). Ruge på RT i 20 min.
- Sentrifuge cellene på 300 x g i 5 min på 4 ° C. vask to ganger med 500 µL FACS bufferen. Sug opp nøye med et glass Pasteur pipette som ikke forstyrre pellet.
- Resuspend med 200 µL FACS bufferen som inneholder sekundære antistoff konjugert til Alexa 488 (siste fortynning av 1:1, 000). Inkuber i mørket ved 4 ° C i 20 min.
- Sentrifuge cellene på 300 g i 5 min på 4 ° C. vask to ganger med 500 µL FACS bufferen og nøye Sug opp vaskebuffer.
- Resuspend i 500 µL FACS bufferen og vurdere binding av mAbs og/eller polyklonale Sera celler transfekterte med HA av FACS.
Merk: Husk å inkludere en ingen mAb/polyklonale sera kontroll samt en untransfected utvalg i eksperimentet.
Representative Results
Vi har brukt varianter av denne metoden for å generere escape varianter å menneskelige og murine mAbs indusert av sesongens influensa virus vaksine, H7N9 vaksinasjon eller sekvensiell DNA/rekombinant HA protein vaksinasjon4,5 ,6,7. Som beskrevet ovenfor, ble antistoffer først preget med HI og microneutralization analyser for å informere oss om hvilken protokoll fortsette neste4,5. Antistoffer 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 og 07-4D 05 ble funnet for å ha HI og nøytralisering aktiviteter mot fugleinfluensa H7N9 viruset (A/Shanghai/1/2013) (tabell 1), og dermed protokollen 1 (trinn 2.1) ble benyttet. For mAbs med nøytralisere at mangel HI aktivitet, for eksempel 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 og S6-B01 (tabell 1), ble protokollen 2 (trinn 2.2) brukt til å generere escape varianter. Escape mutant kartlegging viste at mange av antistoffer gjenkjenner kritiske rester på forskjellige steder på viral HA4,5 (Figur 4). Mens flertallet av HI-positive antistoffer har unnslippe mutant rester i nærheten av tidligere rapporterte antigen steder av H7 HA, generert HI-negativ antistoffer flukt mutanter punkt mutasjoner i stilken regionen4,5 .
| Antistoff | Hei aktivitet | NEUT aktivitet |
| 07-5D 03 | + | + |
| 07-5F01 | + | + |
| 07-5G 01 | + | + |
| 07-4B03 | + | + |
| 07-4E02 | + | + |
| 07-4D 05 | + | + |
| 41-5E04 | - | + |
| 045-051310-2B06 | - | + |
| 042-100809-2F04 | - | + |
| S6-B01 | - | + |
Tabell 1: Tabell av antistoff HI og nøytralisering. Ti H7-spesifikke mAbs isolert fra enkeltpersoner vaksinert med en eksperimentell H7N9 vaksine forevise annet i vitro antiviral aktiviteter5.
| Videresende Primer (5' til 3) | Omvendt Primer (5' til 3) | Thermocylcer forhold | ||||||||
| IAV | TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG | ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT | 42 ºC for 60 min, 94 ºC for 2 min/5 sykluser av 94 ºC for 20 s, 50 ºC for 30 s og 68 ºC for 3 min 30 s, etterfulgt av 40 sykluser av 94 ºC for 20 s, 58 ºC for 30 s , og 68 ºC for 3 min 30 s med en endelig utvidelse tid på 68 ºC for 10 min | |||||||
| IBV | GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC | CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC | 45 ° c for 60 min, 55 ºC for 30 min, 94 ºC for 2 min/5 sykluser av 94 ºC for 20 s, 40 ºC for 30 s og 68 ºC for 3 min 30 s, etterfulgt av 40 sykluser av 94 ºC for 20 s , 58 ºC for 30 s og 68 ºC for 3 min 30 s med en endelig utvidelse tid på 68 ºC for 10 min | |||||||
Tabell 2: Universal influensa virus primere. Primer-par for forsterkningen på HA segmentene av influensa A27 og B28 virus og deres respektive thermocycler forhold.
Figur 1: HI analysen. (A) A skjematisk for innstillingen en HI analysen teste to mus H1-spesifikke mAbs 7B2 (leder-spesifikke) og 6F12 (stengel-spesifikk) bruker en 96-brønns V-bunnplaten og (B) et eksempel på resultatene av en HI analysen23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Microneutralization analysen. En skjematisk for å sette opp en microneutralization analysen teste to menneskelige mAbs 4 d 055 og CR911417. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: generasjon av flukt mutanter. Metodikken foreslått vil være avhengig av HI og microneutralization aktiviteten utstilt av antistoffer. Generering av flukt mutanter mot (A) kan nøytraliserende HI-positive antistoffer kreve et enkelt avsnitt i egg, mens (B) nøytraliserende HI-negativ antistoffer kan innebære flere passasjer med økende antistoff beløpene i celle vev kultur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: et eksempel på en epitope kart over den romanen avian H7N9 HA generert med rømme mutant varianter. Vaksine-indusert antistoffer isolert fra enkeltpersoner vaksinert med kandidat H7N9 influensa, en vaksine ble brukt til å generere escape mutant varianter. Hver rester angitt i rød representerer plasseringen av kritiske aminosyrer som kreves for effektiv binding av en mAb. Data var tilpasset fra Dunand-Henry et al., 20154. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Selv om fleste rester kjennemerke via flukt mutanter vært korrekt, er en av de store begrensningene av denne tilnærmingen at punkt mutasjoner escape varianter ikke kan nødvendigvis kart i molekylær fotavtrykk av antistoffer som strukturelle analyser. Dette er muligheten for en mutasjon på en bestemt rester å føre til en conformational endring distale til plasseringen av muterte rester, slik som en allosteric effekt. En annen begrensning er at denne metoden kan bare brukes for å nøytralisere antistoffer; antistoffer som mangler i vitro seleksjonspress vil ikke føre til flukt mutanter. Men kan denne begrensningen overvinnes med bruk av et panel av flukt varianter generert av tidligere preget nøytraliserende antistoffer. Tan et al. brukes en flykte variant av en nøytraliserende mAb for H7N9 viruset til å tilordne av en ikke-nøytralisere antistoff7.
Likevel gir Klargjørende epitopes av antistoffer gjennom generasjon escape varianter et levedyktig alternativ til krystallografi og cryo-electron mikroskopi, begge krever en omfattende investeringer utstyr. Andre alternativer er å avgjøre området minimal bindende mAbs bruker alanin skanning eller peptid skanning/trunkering mutanter. Alanin skanning mutagenese krever betydelig arbeid i å generere et stort antall varianter under screening29, mens peptid skanning er begrenset til lineær epitopes30. Metoden beskrevet i denne protokollen krever ingen spesielt utstyr eller teknikk og faktisk gjør bruk av eksisterende i vitro nøytralisering analyser endret for å generere escape varianter av antistoffer rundt.
Protokollen for genererer escape varianter som krever flere passasjer (f.eks, stengel-spesifikke antistoffer) er svært avhengig av Start konsentrasjonen av antistoff passasje 0. Det er bedre å feile på siden av forsiktighet og begynner på en logg til halv en logg som er lavere enn halve maksimal hemmende konsentrasjonen av et antistoff og tillate robust virus vekst. Forskeren kan spekulere at en høy titer virus kultur i nærvær av immunologiske lavtrykk vil ha en stor genetisk variasjon i viral befolkningen. Escape varianter kan velges for ved å gradvis øke antistoff konsentrasjonen i følgende avsnitt. Som virus veksten avtar, kan mengden av viral nedbryting økes i neste gangen samtidig opprettholde samme mengde antistoff konsentrasjon i forrige passering.
Målet med et flertall av universell influensa vaksiner er å lokke fram en robust antistoffet svaret mot stilken regionen HA. Analyser av flukt varianter å forfølge-spesifikke antistoffer er viktig i å definere forholdet mellom influensa virus fitness og immunologiske press. Interessant, var rømme mutant virus fra stengel-spesifikke mAbs alle dempes i vivo i murine LD50 studier4. Disse studiene gir en sterk sak for stengel-baserte vaksinasjon plattformer. I tillegg kan denne protokollen brukes til å identifisere flukt mutanter til andre anti-virus forbindelser, for eksempel lite molekyl inhibitors. Til slutt, denne metoden er ikke begrenset til influensa virus overflate glykoproteiner, men kan også brukes på mer for å fastslå epitopes av andre virus glykoproteiner.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette prosjektet har blitt finansiert delvis med føderale midler fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under CEIRS kontrakt HHSN272201400008C (FK); NIH U19AI109946-01 (FK); og P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid | Corning, Inc. | 353072 | Assay plate use for the microneutralization assay |
| Falcon 96-well clear V-bottom plate | Corning, Inc. | 353263 | Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay |
| 1X Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095080 | Infection medium |
| Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2 |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) | EMD Millipore | MAB8258B | An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) | EMD Millipore | MAB8260B-5 | An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses |
| Streptavidin-HRP antibody | EMD Millipore | 18-152 | This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody |
| HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP |
| 96-well V-bottom plate | Nunc | 249662 | Assay plate used for the hemagglutination assay |
| Chicken red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate |
| TRIzol | Ambion | 15596026 | Extraction of RNA |
| Superscript III | Invitrogen | 12574018 | Reverse transcriptase |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Isolation of amplified PCR product |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Transfection reagent |
| Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | Fluorescent secondary antibody for human antibodies |
| Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Fluorescent secondary antibody for murine antibodies |
| 6-well polystyrene microplate | Corning, Inc. | 353934 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Nalgene long term storage Cryo-tubes | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | Freezing of viral culture supernatant |
| reassortant A/California/04/09 (H1) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| Bovine serum albumin solution (35%) | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| Qiagen gel extration kit | Qiagen | 28704 | Silica-membrane-based purification of DNA fragments |
References
- Shaw, M. L., Palese, P. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).
- Nelson, M. I., Holmes, E. C.
- Lauring, A. S., Andino, R. Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses. PLoS Pathog. 6 (7), e1001005 (2010).
- Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains. J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).
- Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., Lee, P. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Tan, G. S., Leon, P. E., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Pathog. 12 (4), e1005578 (2016).
- Smith, K., Garman, L., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Steel, J., Lowen, A. C., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Wang, T. T., Tan, G. S., et al. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).
- Impagliazzo, A., Milder, F., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).
- Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses. Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).
- Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate. mBio. 7 (2), e00257 (2016).
- Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).
- Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies. Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).
- Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin. Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).
- Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants. J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).
- Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Geneva: World Health Organization. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J Vis Exp. (97), e52421 (2015).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA. J Vis Exp. (42), e2057 (2010).
- Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).
- Zhou, B., Lin, X., et al. Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics. J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).
- Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. Exploring and designing protein function with restricted diversity. Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).
- Chen, C. -W., Chang, C. -Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J Vis Exp. (121), e55417 (2017).
