Summary
Hier, wordt een methode beschreven voor de bereiding van 3-dimensionale (3D) sferoïde co cultuur van pancreatic kankercellen en fibroblasten, gevolgd door meting van metabolische functies met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.
Abstract
Vele soorten kanker, met inbegrip van alvleesklierkanker, hebben een dichte fibrotische stroma die een belangrijke rol in de progressie van de tumor en invasie speelt. Geactiveerde kanker geassocieerd fibroblasten zijn een essentieel onderdeel van het stroma tumor die interactief met kankercellen en bevordering van hun groei en overleving. Modellen die de interactie van kankercellen te recapituleren en fibroblasten geactiveerd zijn belangrijke hulpmiddelen voor de bestudering van de stromale biologie en voor ontwikkeling van antitumorale agenten. Hier wordt een methode beschreven voor de snelle generatie van robuuste 3-dimensionale (3D) sferoïde co cultuur van pancreatic kankercellen en geactiveerde alvleesklier fibroblasten, die kunnen worden gebruikt voor latere biologische studies. Bovendien is beschreven het gebruik van 3D spheroïden bij de uitvoering van functionele metabole tests om te sonderen cellulaire Bioenergetica trajecten met behulp van een extracellulaire flux analyzer gekoppeld aan een sferoïde microplate. Pancreatic kankercellen (Patu8902) en geactiveerde alvleesklier fibroblast cellen (PS1) waren samen gekweekt en gemagnetiseerde met behulp van een biocompatibele nanoparticle vergadering. Gemagnetiseerde cellen werden snel bioprinted met behulp van magnetische schijven in een 96 goed formaat, in groei media voor het genereren van spheroïden met een diameter variërend tussen 400-600 µm binnen 5-7 dagen van cultuur. Functionele metabole testen met behulp van Patu8902-PS1 spheroïden werden vervolgens uitgevoerd met behulp van de technologie van de extracellulaire flux sonde cellulaire energetische routes. De methode hierin is eenvoudig, kunt consistente generatie van kanker cel-fibroblast sferoïde co culturen en kan mogelijk aangepast worden aan andere celtypes kanker op optimalisatie van de huidige beschreven methodologie.
Introduction
In het laatste decennium, zijn talrijke in vitro 3D-modellen ontwikkeld om te recapituleren en onderzoeken de in vivo tumor biologie, communicatie en groei omstandigheden van kanker cellen1,2. Tweedimensionale (2D) enkelgelaagde cel cultuur systemen met uniforme blootstelling aan biochemische factoren en geneesmiddelen verbindingen niet om te repliceren de native 3D stromale tumor interacties blootgesteld op een helling van verbindingen verspreiden via de extracellulaire matrix (ECM) eiwitten3,4. Dus, in vergelijking met 2D weefselkweek modellen, 3D kanker modellen hebben naar voren gekomen om aan te tonen beter potentiële bij het simuleren van de communicatie van de tumor en diende als belangrijke instrumenten beter te begrijpen in vivo tumor kenmerken, zoals hypoxie, desmoplasia, rustperiode, drug doordringendheid, toxiciteit en therapeutische weerstand5,6. Te dien einde hebben 3D-modellen potentieel om de kloof tussen 2D celkweek en hele dierlijke modellen door het nabootsen van in vivo de functies van de tumor, terwijl relatief goedkope en geoptimaliseerd voor snelle generatie en consistentie. Deze voordelen worden uitgebuit om te versnellen translationeel onderzoek op vele gebieden waaronder Kankerbiologie, genuitdrukking en weefsel engineering7,8.
In een sterke stijging van de zich ontwikkelende 3D weefselkweek methoden, magnetische levitatie technieken zijn onlangs ontwikkeld en beschreven voor groei, analyseren en beeldvorming van spheroïden afgeleid van verschillende cel typen9,10, 11 , 12. magnetische 3D bioprinting exploiteert het gebruik van magnetische krachten om ingenieur weefsels door cellen met biocompatibel nanodeeltjes magnetiseren en af te drukken in multi goed formaten. Hierdoor kan de snelle productie van consistente, in de buurt van identieke 3D spheroïden, die kunnen worden aangewend en werkzaam voor een overvloed van downstream toepassingen voor biochemische en biofysisch onderzoek10. Hier hebben we de techniek van de magnetische bioprinting met behulp van een biocompatibel materiaal genaamd Nanoshuttle (NS) samengesteld van ijzeroxide, poly L-lysine en gouden nano deeltjes op het etiket van pancreatic kankercellen en fibroblasten aangepast. NS hecht via een elektrostatisch proces aan het plasma-membraan, is niet bekend om te binden aan een specifieke receptoren en releases uit de cel oppervlakte binnen een week. Het zeer lage magnetische krachten (30pN) vereist, genoeg om aggregaat maar niet kwaad cellen en heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen, metabolisme of verspreiding te maken zeer biocompatibel voor 3D culturen10,13,14 ,15.
In deze studie, beschrijven met behulp van pancreatic kanker als een voorbeeld en model, we de generatie en metabole kwantitatieve analyse van 3D kanker cel-fibroblast spheroïden. Vanaf cellen gekweekt in 2D vaartuigen, illustreren we de cultuur en groei omstandigheden van de alvleesklier tumor-fibroblast co cultuur spheroïden met behulp van magnetische bioprinting. Gekweekte spheroïden werden vervolgens gebruikt in functionele metabole testen met behulp van een extracellulaire flux-analyzer, een technologie aangetoond dat zij tegelijkertijd maatregel de twee grote energie produceren trajecten, glycolyse en mitochondriale ademhaling, in een verscheidenheid van levende cellen en weefsels16,17,18,19,20. Glycolyse werd gemeten als een verandering in het tarief van de extracellulaire verzuring (ECAR), terwijl de mitochondriale ademhaling of oxidatieve fosforylatie werd gemeten als zuurstof verbruik tarief (OCR). Wij stellen voor dat deze methode ontwikkeld voor de alvleesklier tumor spheroïden als backbone dienen kan voor het optimaliseren en vertalen van 3D tumor sferoïde generatie en kwantitatieve analyse aan andere cel/weefseltypes (HLA).
Protocol
1. cultuur van Pancreatic kanker 3D spheroïden met behulp van magnetische Bioprinting
- gebruiken standaard aseptische weefselkweek techniek, cultuur cellen van belang in een T75 kolf naar een confluentie van 70-80% in passende groei media.
Opmerking: Normaal gesproken 5-7 × 10-6 cellen uit een 70-80% confluente T75 kolf zijn geoogst. Twee verschillende soorten cellen werden gebruikt in deze studie - Patu8902 (alvleesklier tumorcellen) en PS1 cellen (geactiveerde alvleesklier Notti cellen 21). Beide cellijnen werden gekweekt in Roswell Park Memorial Instituut media 1640 (RPMI-1640) aangevuld met 10% (v/v) foetale boviene serum(FBS), 1 × penicilline-streptomycine (p/s). - Wassen van cellen een keer met 5 mL Dulbecco ' s met fosfaat gebufferde saline(DPBS).
- Ontkoppelen cellen van kunststof oppervlak door trypsinizing met 2 mL 0,05% trypsine-EDTA gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. Check voor mobiele-detachement onder een microscoop.
- Deactiveren trypsine door toevoeging van 8 mL groei media om vrijstaande cellen. Vermijd over trypsinebehandeling, omdat dit nadelig de gezondheid/levensvatbaarheid van cellen beïnvloeden kan.
- Pipetteer cellen op en neer voor het genereren van een enkel celsuspensie en graaf celdichtheid met behulp van een geautomatiseerde cel teller of een hemocytometer.
- In de tussentijd een flesje voor NS tot kamertemperatuur equilibreer.
- Berekent het bedrag van cellen die nodig zijn voor het zaaien van het gewenste aantal spheroïden (putten) en aliquot deel aan een nieuwe conische tube van 15 mL. Bijvoorbeeld op zaad dat wordt een hele 96 goed met 5.000 cellen/well, aliquot ten minste 5,5 × 10 5 cellen plaat.
- Verzamelen cellen door centrifugatie bij 500 x g gedurende 3 min. zorgvuldig gecombineerd of decanteren het supernatant en resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1,0 x 10 6 cellen/mL in groei media. Pipet zachtjes met behulp van een brede verveeld Pipetteer tip om te voorkomen dat scheren. Bijvoorbeeld resuspendeer 5.5 x 10 5 cellen in 550 µl van groei media.
- Magnetiseren de gewenste hoeveelheid cellen met behulp van de equilibrated NS (stap 1.6).
- Rechtstreeks toevoegen van NS aan de celsuspensie in groei media en zachtjes doorroeren. Voor efficiënte magnetische labeling van cellen, gebruikt u 10 µL NS per 100 µL cellen (bij 1 x 10 6 cellen/mL geresuspendeerde).
Opmerking: Voor een typisch experiment, label 5.5 × 10 5 Patu8902 cellen in 550 µL met 55 µL NS en 1.1 × 10 6 PS1 cellen in 1100 µL, (afzonderlijk) met 110 µL NS. - Voorzichtig omkeren buis een paar keer om de celsuspensie. Tijdelijk, het overdragen van de cel-NS mix in een enkel putje van de plaat van een 24-well. Doe dit voor elk celtype te worden gemagnetiseerde afzonderlijk. Afdekplaat en Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur met zacht schudden zodat NS binding aan het celoppervlak.
Opmerking: Cultuur en kwantitatieve analyse van spheroïden starten vanuit Patu8902 of PS1 alleen cellen, naast co cultuur spheroïden beginnen met zowel cel typen vooraf gemengd voordat afdrukken op magnetische schijven met succes tot stand gekomen met behulp van deze methode in zelfstandige experimenten. Een methode voor het genereren van co cultuur spheroïden uit Patu8902 en PS2 cellen wordt hieronder beschreven in de latere stappen.
- Rechtstreeks toevoegen van NS aan de celsuspensie in groei media en zachtjes doorroeren. Voor efficiënte magnetische labeling van cellen, gebruikt u 10 µL NS per 100 µL cellen (bij 1 x 10 6 cellen/mL geresuspendeerde).
- Pipetteer op en neer de gemagnetiseerde cellen voorzichtig te mengen gelijkmatig en bereiden een master mix met het nummer van de gewenste cel. Voor het zaaien van spheroïden, een totaal van 15.000 cellen (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) gebruiken en aanpassen aan een totaal volume van 150 µL per putje van een 96-wells-plaat.
Opmerking: Het eindvolume afgeleverd in elk putje moet hetzelfde ongeacht het aantal cellen gebruikt. - Plaatst u een cel repellent 96-wells-plaat bovenop de 96-Wells magnetische sferoïde drive en afzien van 150 µL van cel mix in elk putje. Observeer de cellen langzaam verzamelen naar het midden van het ruim boven de magneet. Cover en Incubeer de plaat 's nachts in een 5% CO 2 incubator set bij 37 ° C met de magnetische sferoïde drive nog steeds gehecht. Verwijder de magnetische schijf en voor verdere groei tot maximaal 7 dagen broeden.
Opmerking: Het is cruciaal voor het gebruik van cel repellent groei platen voor sferoïde afdrukken met behulp van magnetische sferoïde stations. Zorgen dat het station sferoïde met dunner kleinere magneten wordt gebruikt, niet het bedrijf station. - Toezicht op de groei van de spheroïden elke dag. Vullen met nieuwe groei media elke drie dagen door het plaatsen van de groeischijf gemonteerd op de magnetische aandrijving houden onder een hoek en het gebruik van een meerkanaals Pipetteer uit verbruikte media.
Opmerking: Patu8902 en PS1 cellen samen bij 15.000 cellen/well zijn overgeënt zal uitgroeien tot 3D spheroïden met een diameter van 400-600 µm binnen 5-7 dagen. Op dit punt spheroïden zijn klaar voor metabole karakterisering, evaluatie van de drug, en andere downstream toepassingen.
2. Metabole kwantitatieve analyse van 3D alvleesklier Tumor spheroïden voor Bioenergetica trajecten met de extracellulaire Flux-Analyzer
Opmerking: In deze sectie, de analyse van de metabole functies van de spheroïden met behulp van een extracellulaire flux Analyzer met assay microplates speciaal voor 3D spheroïden wordt beschreven.
- Wassen en overdracht van spheroïden van groei platen naar sferoïde assay microplates.
Opmerking: Spheroïden kunnen worden gebruikt voor metabole testen wanneer ze een diameter van ~ 500 µm bereiken.- De dag voorafgaand aan het uitvoeren van de bepaling, hydrateren de sonde of sensor cartridge met assay kalibrant (200 µL per putje) in de meegeleverde hulpprogramma plaat en incubeer overnachting (4-18 h) in een bevochtigde incubator (niet-CO 2) vastgesteld op 37 ° C.
- Bereiden het medium van de passende test voor de gewenste metabole assay beogen de base media (Zie de tabel van materialen) met beide 2 mM L-glutamine voor glycolyse stress test (GST) test of met pyruvaat 1 mM, 2 mM L-glutamine en 10 mM glucose voor een mitochondriale stresstest (MST) assay.
Opmerking: De extracellulaire flux analyzer meet zowel de mitochondriale ademhaling (OCR) en de glycolyse (ECAR) van levende cellen in de indeling van een 96-wells-plaat. Deze tarieven geven een overzicht van cellulaire metabole functie in monsters onderzocht. Raadpleeg de handleiding in de test-kits voor gedetailleerde instructies. - Na het toevoegen van assay specifieke supplementen (zie stap 2.1.1), warm het aangevuld assay medium in een waterbad 37 ° C en breng de pH op 7,4 ± 0,1 met 0.1N NaOH. Het medium warm te houden tot gebruik.
- Reconstrueren assay kit reagentia in de gekalibreerde assay middellange tot aanbevolen voorraad concentraties.
Opmerking: Deze worden gemaakt op 10 × de eindconcentratie gewenst in de putjes. Voorraad concentraties voor glucose, oligomycin en 2-deoxy-glucose (2-DG) zijn respectievelijk 100 mM, 100 µM en 500 mM. - Let op spheroïden in de groeischijf onder een licht Microscoop om te controleren voor sferoïde morfologie en algehele uniformiteit; in termen van de vorm en de structure van de spheroïden.
- Overbrengen van de groeischijf op een magnetische bedrijf drive en zorgvuldig gecombineerd ~ 120 µL groei media. Voorzichtig wassen spheroïden met ~ 120 µL van verwarmde en vooraf gekalibreerde assay media, gecombineerd en herhaal de wash tweemaal. Inspecteren van de spheroïden onder de Microscoop opnieuw om ervoor te zorgen dat spheroïden zijn niet weggewassen.
- Bereiden de sferoïde assay microplate door 180 µL warme assay media toe te voegen aan elk putje.
- Een micropipet P20 ingesteld op 10 µL en een brede verveeld tip om het te passen. Als brede verveeld tips niet beschikbaar zijn, afgesneden van de tips van regelmatige Pipetteer tips met een schone schaar of scalpel uit te breiden van de boring.
Opmerking: Dit moet verminderen schuintrekken en behoud van de algehele morfologie van de spheroïden terwijl worden overgebracht om te assay platen. - Gebruiken een warm (37 ° C) oppervlak te verrichten van de overdracht van spheroïden. Gebruik een X-ray film kijker oppervlak opgewarmd met een wit-licht lamp contrast verbeteren en de visualisatie van spheroïden tijdens het overdrachtsproces wordt steun.
- Zorgvuldig een sferoïde één vooraf gewassen uit de cel repellent groeischijf met behulp van een micropipet P20 is voorzien van een breed aspirate droeg uiteinde en zachtjes overdracht sferoïde rechtstreeks in het midden van elk putje van een sferoïde assay plaat voor de uitvoering van de metabole assay. Toestaan dat elke sferoïde te zachtjes vallen in de centrale micro-kamer van elk putje door pure ernst voor het vullen van de plaat assay.
Opmerking: Het duurt meestal 5-8 s voor elke sferoïde te vallen in het midden van het goed door de zwaartekracht. Trek niet uit de pipet totdat de spheroïden zijn neergestreken in de micro-kamer. Doen niet storting spheroïden in de 4 hoek putjes van de plaat assay (A1, A12, H1, H12) sinds deze zal worden gebruikt als achtergrond putten. - Volgen de morfologie en de positie van elke sferoïde om ervoor te zorgen dat elke sferoïde in het midden van elk putje. Indien nodig, verplaatsen naar het midden van goed door zuigen uit sferoïde met behulp van een breed droeg Pipetteer tip en latere afzetting door de zwaartekracht.
- Zodra alle spheroïden zijn overgedragen, plaats de assay-plaat in een incubator bevochtigde lucht 37 ° C (niet-CO 2) gedurende één uur voorafgaand aan de gehaltebepaling.
- Laden sensor cartridge met verbindingen en het uitvoeren van de bepaling
- voorbereiden 10 × geconcentreerd assay specifieke reagentia in de assay specifieke media beschreven in stap 2.1.2. Bijvoorbeeld, om uit te voeren GST, reconstrueren glucose, oligomycin en 2-DG in aanbevolen hoeveelheden waarnaar wordt verwezen in het handboek assay. GST zowel MST tests werden uitgevoerd met behulp van Patu8902-PS1 spheroïden.
- Goed oriënteren van de sensor-cartridge met rijen gelabeld A-H aan de linker kant en een hulplijn laden op de top van de sensor cartridge plaatsen. Zorgen voor een juiste laden van de gewenste poort door kunt u de laden gids zodat de brief die overeenkomt met de poort die moet worden geladen op de hogere linkerhoek.
- Reagentia rechtstreeks in injectie poorten met behulp van een meerkanaalspipet, afzien. Houd laden gidsen in positie met behulp van vingertoppen gedurende de hele procedure.
Opmerking: Elk reagens zullen worden ingespoten in een aanbevolen haven bedoeld in de bepaling handleiding. Voorkomen dat er luchtbellen maar doen niet enig deel van de cassette verwijderen van luchtbellen onttrekt. - Verwijderen laden gids en standpunt op ooghoogte met de cartridge te visueel inspecteren injectie poorten voor zelfs laden.
- Maken het ontwerp/instrument-protocol van experimentele bepaling met behulp van het instrument controller Wave software (voortaan, analysesoftware) zoals beschreven in punt 2.3.
- Assay uitvoering en het gebruik van de analysesoftware
- maken een sjabloon assay voor het experiment
- Open de analysesoftware en klik op " sjablonen " of kies uit een bestaande bepaling sjabloon. Tweevoudig tikken voort " lege sjabloon ".
- Definiëren experimentele groepen en voorwaarden.
- Definiëren injectie strategieën voor poorten A, B en C. laat poort D leeg.
Opmerking: Voor GST assay, alleen deze poorten worden geladen met Glucose, Oligomycin en 2-DG. In het geval van MST assay, oligomycin, FCCP en rotenon zal worden geladen. - Definiëren pre behandelingen als spheroïden werden behandeld met een of meer verbindingen van de test en de controlegroep. De assay media bron, supplementen, en andere informatie definiëren.
- Één of meer celtype (b.v. Patu8902, PS1) zien de dichtheid en passage gegevens definiëren.
- Definiëren injectie strategieën voor poorten A, B en C. laat poort D leeg.
- Klik op " genereren groepen ".
- Klik op " plaat kaart " tab en groepen toewijzen aan de plaat van de assay overeenkomt met de proefopzet.
- Selecteer de vier hoek putten als achtergrond putten. Zorg ervoor dat er geen spheroïden in deze putjes.
- maken een sjabloon assay voor het experiment
- Uitvoeren van de bepaling over de analyzer
- Klik op de tab Instrument Protocol handhaaft u de standaardinstelling protocol opdrachten door het controleren van " kalibreren ", " uitgebalanceerd " en " Baseline meting cyclus ".
- Klik " injecties " en definieer samengestelde voor elke poort. Bewerken meting cycli aan 6 cycli vanuit naar de wanprestatie 3 cycli voor spheroïden. Houd de standaard 3 min mix, 0 min wachten en 3 min maatregel tijden.
Opmerking: Standaard mix-wachten-maatregel tijden zijn 3 min, 0 min, 3 min, respectievelijk. Drie basale tarief doorgaans metingen vóór injectie van eerste assay samengestelde. Deze metingen kunnen worden gekalibreerd en aangepast volgens de proefopzet. - Protocol en groep samenvatting.
- Opslaan assay ontwerpsjabloon.
- Gaan pre assay kalibratie nadat injectie poorten zijn geladen met assay substraten. De cartridge met het hulpprogramma plaat overbrengen in de extracellulaire flux analyzer.
Opmerking: Dit meestal wordt voltooid binnen 15-20 min en de sensoren te voeren OCR en ECAR metingen kalibreert. - Na kalibratie van de cartridge wordt de plaat hulpprogramma vervangen door de voorverwarmde assay plaat met 3D spheroïden en initiëren van de bepaling. Als de metingen zijn uitgevoerd, de gegevens te exporteren naar werkblad of grafieken en statistische software om de gegevens te analyseren.
Representative Results
De algemene workflow voor magnetische bioprinting en extracellulaire flux analyse van 3D spheroïden
Figuur 1 toont een overzicht van de gehele procedure die wordt beschreven in dit protocol. Pancreatic kankercellen (Patu8902) en geactiveerde Notti cellen (PS1) werden gekweekt in weefselkweek kolven met passende groei media naar een confluentie van 70-80%. Cellen werden losgemaakt van het vaartuig 2D cultuur en gewassen, celdichtheid werd bepaald en cellen ten slotte geresuspendeerde in groei media bij 1 × 106 cellen/mL. NS, een assemblage van de nanoparticle bestaande uit goud, ijzeroxide en poly-L-lysine werd gebruikt om de cellen te magnetiseren. Individueel gemagnetiseerde Patu8902 en PS1 cellen werden dan gemengd en afgedrukt op cel repellent groei van 96-wells-platen gemonteerd op een magnetische sferoïde station. We hebben de 15.000 om het totale aantal cellen voor het zaaien van een enkele goed (5.000 Patu8902 cellen gemengd met 10.000 PS1 cellen voor het genereren van een enkel sferoïde) geoptimaliseerd. Na incubatie gedurende 5-7 dagen omstandigheden passende weefselkweek, werden 3-dimensionale spheroïden verkregen, gedurende welke tijd de groei van deze spheroïden werd gecontroleerd en geregistreerd. Na het wassen met assay media, werden de spheroïden fysiek overgezet naar een sferoïde microplate uit metabole testen met behulp van een extracellulaire flux analyzer voor gelijktijdige meting van de glycolyse en mitochondriale ademhaling te voeren.
Cultuur en de groei van de alvleesklier tumor-fibroblast spheroïden
Voor het verkrijgen van functionele en robuuste spheroïden, de epitheliale kankercel lijn Patu8902 en geactiveerd Notti cellen PS1 werden gekweekt in RPMI-1640 aangevuld met foetale runderserum. Pat8902 en PS1 cellen gemagnetiseerde met NS werden vervolgens met elkaar vermengd in een verhouding van 1:2, zodat het zaad van een totaal van 15.000 cellen per putje in een groeischijf. Binnen 24 uur af te drukken op de cellen op de magnetische schijven, focalized cellen naar het midden van de put precies op de bovenkant van elke magnetische pin onder elk putje. Groei van Patu8902-PS1 spheroïden werd gecontroleerd door imaging op dagen 2, 4, 7 en 9 na het zaaien van de cellen. Figuur 2 toont de kwantificering van de gemiddelde diameter van representatieve spheroïden op verschillende tijdstippen hierboven. De diameter van de spheroïden verhoogt van 414 µm op dag 2 596 µm op dag 7 na afdrukken. Was er geen significant verschil tussen groei op dagen 7 en 9, en dus alle extra experimenten werd beperkt tot 7 dagen na sferoïde groei. We merkten dat de spheroïden een scherpere morfologie vooral rond de buitenranden verwerven en de NS wordt geleidelijk meer gelijkmatig verspreid in het volume van de sferoïde met meer dagen in cultuur. Wij ook de bolvorm van 10 spheroïden op basis van de lengte van hun primaire en secundaire assen geschat. De gemiddelde bolvorm is 0,92 ± 0,04 voor Patu8902 alleen (tumor), 0.95 ± 0,04 voor PS1 (stromale) alleen en 0.94 ± 0,02 voor co cultuur spheroïden.
Functionele metabole kwantitatieve analyse van de alvleesklier 3D spheroïden met behulp van de extracellulaire flux analyzer
We gebruikt om te testen van de functionaliteit van de spheroïden, metabole en analyse van de Bioenergetica sonde van de trajecten van de energie in spheroïden. Voerden we een glycolyse stress test op spheroïden gekweekt zoals hierboven beschreven. Te dien einde werden spheroïden gegenereerd op basis van Patu8902 of PS1 cellen naast die welke voortvloeien uit een co cultuur van de twee celtypes onderworpen aan de test. Interessant is dat tentoongesteld alle drie soorten spheroïden, of die afkomstig zijn uit verschillende of gemengde cellen, een biologisch functionele reactie op de GST-bepaling. Bij het injecteren van een saturating concentratie van glucose, eerst de typen spheroïden getest Toon verhogingen in het glycolytic traject zoals blijkt door een toename van de ECAR (Figuur 3). Mitochondriale ATP productie werd geremd met behulp van oligomycin, energieproductie verschuift naar glycolyse als cellen aan maximale glycolytic capaciteit, gezien als een verdere toename van de ECAR geduwd. Remming van de glycolyse met behulp van 2-DG, een analoge glucose die concurrerend glucose hexokinase bindt, resulteerden in een daling in ECAR, waarin wordt bevestigd dat de voorafgaande stijging ECAR vanwege een glycolytic activiteit was. We hebben gemerkt dat de spheroïden getest in deze studie gereageerd op deze manier, hoewel de PS1 alleen spheroïden (gemiddelde diameter 250 µm) had een relatief lagere signaal, mogelijk als gevolg van hun kleiner grootte en lagere glycolytic capaciteit in vergelijking met de Patu8902-kanker cellen (gemiddelde diameter 600 µm). In het algemeen, een hogere ECAR signaal van tumor cel afgeleid spheroïden vergeleken met die van relatief kleinere PS1 fibroblast afgeleid van spheroïden, eventueel kan worden toegeschreven aan de kankercellen inherent metabole neiging tot glycolyse22, 23. Alle drie soorten spheroïden zijn afgeleid van het zaaien van hetzelfde aantal cellen, hoewel we merkten sferoïde grootte variatie onder elk type, met alleen spheroïden PS1 wordt de kleinste, gevolgd door co cultuur spheroïden, en Patu8902 alleen spheroïden wordt de grootste.
Om te testen mitochondriale functie in 3D spheroïden, onderworpen wij mede cultuur spheroïden aan een MST-test. De MST meet sleutelparameters van mitochondriale functie door te meten direct OCR van cellen (Figuur 4A en 4B). Een seriële injectie met verbindingen (oligomycin, FCCP en een mix van rotenon en antimycin A) werd gebruikt voor het meten van mitochondriale sleutelparameters zoals ATP productie, maximale ademhaling, en niet-mitochondriale ademhaling. Deze parameters en basale ademhaling tarieven werden verder gebruikt voor het berekenen van de proton lek en respiratoire reservecapaciteit (figuur 4C). Een afname van de OCR in reactie op oligomycin, een inhibitor van de omwenteling van ATP-synthase (complexe V) correleert met de mitochondriale ademhaling cellulaire ATP productie is gekoppeld. Spheroïden werden geïncubeerd met oligomycin voor een langere duur dat maximale penetratie en efficiënte reactietijd. Een tweede injectie met de uncoupler FCCP stimuleert maximale zuurstofverbruik en een overeenkomstige stijging van de OCR. De OCR FCCP-gestimuleerd werd gebruikt voor het berekenen van de respiratoire reservecapaciteit, een maat voor de capaciteit van de cel inspelen op toenemende energievraag. De derde injectie; een mix van rotenon, (een Complex ik remmer), en antimycin A (een complexe III-remmer) blokkeert mitochondriale ademhaling, gezien als een scherpe afname van de OCR (Figuur 4BOng >).
Over het geheel genomen bevestigen onze observaties de functionaliteit van gekweekte spheroïden met behulp van een extracellulaire flux-analyzer als een maatregel van hun metabole voetafdruk/activiteit zowel in termen van het glycolytic en mitochondriale potentieel, zoals hierboven beschreven.
Figuur 1 . Schematische weergave van de methodologie voor de cultuur en de kwantitatieve analyse van pancreatic kanker cellen/fibroblast spheroïden. Patu8902 en PS1cells werden gekweekt, trypsinized, gewassen en geteld. Voor het zaaien van elke sferoïde, Patu8902 (5.000 cellen per putje) en PS1 fibroblasten (10.000 cellen per putje) waren gemagnetiseerde met behulp van NS en op dag 1 op een cel repellent groeischijf afgedrukt. Na het zaaien, was de groeischijf gemonteerd op een magnetische sferoïde station (met een magneet onder elk putje van de groeischijf 96 goed formaat) en toegestaan om cultuur voor 2-7 dagen te verkrijgen van 3D spheroïden. De resulterende spheroïden werden gewassen en overgebracht naar de sferoïde assay microplates te verrichten van de metabole testen op het extracellulaire flux-instrument. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Groei van de alvleesklier tumor-fibroblast spheroïden. (A) een representatief beeld van Patu8902-PS1 co cultuur sferoïde overeenkomt met de dag in cultuur wordt weergegeven aan de bovenkant en de grootte in diameter van de sferoïde (µm) hieronder wordt gekwantificeerd. Geleidelijk op te trekken in sferoïde omvang en verspreiding van NS deeltjes (donkere stippen) gedurende de omvang blijkt tussen 2 en 7 dagen. Spheroïden werden gehouden in cultuur voor een extra 2 dagen na deze, die niet resulteren in een aanzienlijke toename van de sferoïde diameter. (B) representatieve foto's van spheroïden die zijn afgeleid van de tumorcellen (Patu8902), stroma cellen (PS1) en mede gekweekte cellen (Patu8902 + PS1) wordt weergegeven. (C) bolvorm gegevens is afgebeeld van 10 individuele spheroïden uit elke groep. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Glycolyse Stress Test (GST) met alvleesklier spheroïden. (A) Schematische weergave van een typische glycolytic functie test met verschillende assay parameters afgebeeld. (B) een voorbeeld van een GST-test uitgevoerd op de alvleesklier spheroïden gekweekt met behulp van de methode beschreven. Glucose injectie hellingen omhoog glycolyse gezien als een toename van de ECAR, met verdere verhoging op toevoeging van oligomycin voor dicht vandoor mitochondriale ademhaling. ECAR valt in reactie op 2-DG, een concurrerende analoog van glucose, door het blokkeren van de glycolyse. Alle spheroïden worden vermeld om een functionele reactie op de GST assay tentoon te stellen. (C) een output van de GST-bepaling met behulp van de fabrikant rapportgenerator beeltenis van de drie belangrijke parameters van de GST-bepaling. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout van gemiddelde (SEM). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. -Mitochondriale Stress Test (MST) met Patu8902-PS1 spheroïden. (A) Schematische weergave van een typische mitochondriale functie test met verschillende assay parameters wordt afgebeeld. (B) een voorbeeld van een MST op de alvleesklier tumor-fibroblast spheroïden wordt weergegeven. (C) mede cultuur 3D spheroïden vertonen een functionele reactie op de MST assay. Zoals verwacht, viel mitochondriale functie gemeten als een daling van OCR wanneer spheroïden werden uitgedaagd met oligomycin, een ATP-synthase-remmer. Met behulp van FCCP naar oprit elektron stroom resulteerde in maximale OCR, die onmiddellijk op de inhibitie van het mitochondriaal ademhaling gebruik samengevouwen een - cocktail van mitochondriaal complex remmers. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout van gemiddelde (SEM). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Met behulp van pancreatic kanker, de 3rd leidt oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten24, als een voorbeeld en model, een snelle en consistente methode is ontwikkeld om te groeien en assay 3D spheroïden met behulp van de co cultuur van pancreatic kankercellen en alvleesklier fibroblasten geactiveerd. Met behulp van magnetische bioprinting, werden spheroïden, variërend in grootte van 400-600 µm in diameter verkregen. Deze werden onderworpen aan metabole testen om de functionaliteit van de gekweekte 3D spheroïden met succes te testen. Deze methode is eenvoudig, consistente en kan gemakkelijk aangepast worden aan andere celtypes.
Terwijl deze methodologie zal versnellen en aan de translationeel waarde van de tests uitgevoerd met 3D spheroïden toevoegen, kan het worden verbeterd door de ontwikkeling van technieken waarmee multiplexing van sferoïde manipulatie en behandeling. Dit moet verder verminderen de totale tijd, kosten en arbeid vereist voor het uitvoeren van de test. Bovendien mogen sferoïde volumes te normaliseren OCR signalen zoals gerapporteerd door anderen6worden gebruikt. Sferoïde volume genormaliseerd door de gemiddelde omvang van een cel kan worden gebruikt om te bepalen van OCR per cel, maar aangezien groei van spheroïden niet identiek zijn zal, berekenen van een absolute OCR per cel kan lastig zijn. Momenteel wordt deze methodologie beperkt door het ontbreken van een doeltreffend instrument multiplex sferoïde behandeling en overdracht van groei platen te assay milieu.
De beschreven methode is gewijzigd en aangepast aan het magnetische bioprinting technology en verder gevalideerd om aan te tonen van de functionele relevantie door de gekweekte spheroïden toe te passen op een stroomafwaartse metabole test. De methode is een belangrijk instrument voor het genereren van robuuste, levensvatbare en functionele spheroïden, waarin de twee grote celtypes gevonden in de meeste weefsels van de tumor, kankercellen en kanker geassocieerd fibroblasten, die kunnen worden ingezet voor andere geneesmiddelen testen, zoals drug schermen. Het relatieve gemak en efficiëntie van de NS-methodologie is een belangrijke verbetering via andere methoden25, zoals de opknoping drop methode2,26 van sferoïde generatie.
Robuuste spheroïden gegenereerd als zodanig bieden een in vitro tumor model dat stromale cellen, die vaak in vele 3D Cultuurwetenschappen ontbreken bevat. De mogelijkheden voor de toepassing van 3D sferoïde modellen gegenereerd als zodanig zijn enorm. Dergelijke modellen kunnen bijvoorbeeld worden ingezet te onderzoeken van cel-cel interacties, Bioenergetica verschuivingen en genetische gevoeligheid en afhankelijkheid van de verschillende therapeutische regimes te testen. 3D spheroïden die de tumor in vivo communicatie recapituleren dienen als zeer relevant en nuttig hulpmiddel voor drug screening studies en die onderzoek naar de mechanismen van de actie van huidige en nieuwe therapeutics. Metabole testen indringende energie trajecten met behulp van spheroïden culturen met mutantcellen kunnen helpen werpen nieuw licht in de rol van deze genen en verwante trajecten in de pathobiology in een relevante 3D-model van kanker, als de spheroïden beschreven in deze studie.
De succesvolle toepassing van deze methode is vooral afhankelijk van de gezondheid van de cellen die nodig zijn voor magnetische afdrukken, dat is de reden waarom cel groeien in logaritmische fase moet worden geoogst en gemagnetiseerde. Het is cruciaal voor de magnetische sferoïde-schijf gebruiken om af te drukken gemagnetiseerde cellen en niet het bedrijf rijden, die alleen tijdens de sferoïde wassen en media aanvullen van de stappen van de beschreven methode moet worden gebruikt. Het andere belangrijkste aspect voor succesvolle uitlezing van metabole testen is het handhaven van de morfologie van de spheroïden tijdens het overdrachtproces van de groeischijf tot de assay-plaat.
Globaal, is dit protocol opgezet voor generatie van 3D spheroïden die zowel kanker en stromale cellen, na de daaropvolgende metabole kwantitatieve analyse van de spheroïden met de extracellulaire flux analyzer bevatten. De belangrijkste kenmerken van deze methode zijn dat het is snel, eenvoudig aan te passen en consistente, relevante en de tumor in vivo communicatie bootst, relatief goedkoop is en als een nieuw hulpmiddel dienen kan voor de studie van biologie van de tumor en het ontwikkelen van antikanker agenten.
Disclosures
De auteurs George W. Rogers en Andrew Neilson zijn werknemers/aandeelhouders van Agilent Technologies dat produceert reagentia en instrumenten die worden gebruikt in dit artikel. Alle andere auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Samuel Zirbel voor hulp bij het optimaliseren van de kweekomstandigheden en monitoring sferoïde groei. We zijn dankbaar Agilent technologies voor het verstrekken van de SeaHorse XFe96 analyzer, assay reagentia en technische inzichten. Wij danken ook Dr. Hemant Kocher bij Barts Cancer Institute in Nederland voor het verstrekken van de PS1-cellen. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Seena Magowitz Foundation voor alvleesklier kankeronderzoek en een staan tot kanker-kanker onderzoek UK-Lustgarten Stichting Pancreatic kanker Dream Team onderzoeksbeurs (Grant nummer: SU2C-AACR-DT-20-16). Staan tot kanker is een programma van de Entertainment industrie Stichting. Onderzoekssubsidies worden beheerd door de American Association for Cancer Research, de wetenschappelijke partner van SU2C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Sigma | 25300-054 | |
| 96 well cell repellant plate | USA Scientific/ Griener Bio-One | 655970 | spheroid growth plate |
| Cellometry Cell counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| D-Glucose | Sigma | D9434 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103020-100 | |
| L-Glutamine | Sigma | 59202C | |
| Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| n3D Magnetic Spheroid drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
| n3D Magnetic Spheroid holding drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
| n3D NanoShuttle-PL | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4 °C |
| Patu8902 cells | Laboratory Stock | pancreatic ductal adenocarcinoma cells | |
| PS1 cells | Laboratory Stock | activated pancreatic stellate cells | |
| RPMI1640 | Gibco | 11875-093 | growth media for cells, spheroids |
| SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer | Agilent Technologies | extracellular flux analyzer | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| XF Base media | Agilent Technologies | 102365-100 | base media for metabolic assays on XFe96 |
References
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5 (3), 239-248 (2011).
- Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
- Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22 (2), 151-152 (2004).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, New York, N.Y. November 1708-1712 (2001).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532 (7598), 255-258 (2016).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5 (4), 291-296 (2010).
- Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8 (10), 1940-1949 (2013).
- Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987 (2015).
- Tseng, H., et al. Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. , Promega Corporation. Updated (Figure 1) 1-9 (2015).
- Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19 (9), 665-675 (2013).
- Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
- Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
- Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
- Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300 (2013).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918 (2016).
- Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175 (2), 636-648 (2009).
- Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66 (18), 8927-8930 (2006).
- Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13 (3), 170-188 (2013).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
