Summary
여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.
Abstract
췌 장의 암 등 많은 암 종류, 조밀한 거리 기질 종양 진행에 침공 한 중요 한 역할을 했습니다. 활성화 된 암 관련 된 섬유 아 세포 종양 기질 암 세포와 상호 작용 하 고 그들의 성장 및 생존 지원의 핵심 구성 요소입니다. 암 세포의 상호 작용을 정리 하 고 섬유 아 세포를 활성화 하는 모델은 stromal 생물학을 공부 하 고 antitumor 에이전트의 개발을 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 췌장암 세포와 활성화 된 췌 장 fibroblasts 이후의 생물학 연구를 위해 사용할 수 있는 강력한 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 급속 한 세대에 대 한 메서드를 설명 합니다. 또한, 설명 이다 세포 생체 경로 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 프로브를 기능 대사 분석 수행에 3D spheroids의 사용와 결합 회전 타원 체 미 판. 췌 장의 암 세포 (Patu8902)와 활성화 된 췌 장 섬유 세포 (PS1) 공동 경작 했다 생체 나노 어셈블리를 사용 하 여 자기. 자성된 셀 bioprinted spheroids 문화의 5-7 일 이내 400-600 µ m 사이 직경을 가진 생성 하 성장 매체에서 96 잘 형식에서 마그네틱 드라이브를 사용 하 여 빠르게 했다. Patu8902-PS1 spheroids를 사용 하 여 기능 대사 분석 실험 다음 세포 에너지 경로 조사 하는 세포 외 유출 기술을 사용 하 여 실행 되었다. 방법은 여기 간단, 암 세포 섬유 회전 타원 체 공동 문화의 일관 된 세대 수 이며 잠재적으로 다른 암 세포 유형 현재 기술된 방법론의 최적화에 따라 적용할 수 있습니다.
Introduction
지난 10 년간에서 수많은 생체 외에서 3D 모델 정리 하는 비보에 종양 생물학, microenvironment 및 성장 조건 암 세포1,2의 조사 개발 되었습니다. 2 차원 (2D) 단층 세포 생화학 요소와 조사 가능한 화합물에 균일 한 노출 시스템 실패는 extracellular 통해 확산 하는 화합물의 그라데이션 노출 네이티브 3D stromal 종양 상호 복제 하 문화 매트릭스 단백질 (ECM)3,4. 따라서, 2D 조직 문화 모델에 비해 3D 암 모델 잠재적인 종양 microenvironment 시뮬레이션에 더 나은 표시를 등장 하 고 중요 한 도구를 역임 vivo에서 종양 특성, hypoxia, 등 이해 desmoplasia, 휴면, 마약 penetrance, 독성 및 치료 저항5,6. 이 위해 3D 모델 빠른 생성 및 일관성에 대 한 상대적으로 저렴 하 고 최적화 하면서 종양 기능 vivo에서 을 흉내 낸에 의해 2 차원 세포 배양 및 전체 동물 모델 사이의 격차를 해소 하는 가능성이 있다. 이러한 장점은 암 생물학, morphogenesis와 조직7,8공학 등 많은 분야에서 번역 상 연구를 가속 화 하기 위해 악용 되 고 있습니다.
서 진화 하는 3 차원 조직 배양 방법을의 지, 자기 부상 기술을 최근 개발 되었고 성장에 대 한 설명, 다양 한 세포 유형9,10, 에서 파생 된 시 금 및 spheroids의 이미징 11 , 12. 자기 3D bioprinting 이용 생체 나노 입자를 세포 자화 및 멀티 잘 포맷에서 그들을 인쇄 하 여 조직 하 자기 세력의 사용. 일관성, 무력화 하 고 생화학 및 생물 조사10다운스트림 응용 프로그램의 과다에 대 한 고용 수 있는 동일한 3D spheroids 근처의 급속 한 생산 수 있습니다. 여기 우리는 산화 철, 폴 리 L-리 신 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포를 금 나노 입자의 구성 이라고 Nanoshuttle (NS) 생체 재료를 사용 하 여 자석 bioprinting 기술을 적응 했습니다. 원형질 막에 정전 NS 부착은 어떤 특정 한 수용 체, 바인딩할 알려져 있지 하 고 셀에서 출시 1 주일 이내 표면. 그것은 매우 낮은 자기 세력 (30pN) 필요, 충분히 집계 하지만 하지 해 세포와 세포 생존 능력, 신진 대사 또는 3D 문화10,13,14 매우 생체 수 있도록 확산에 영향을 미치지 않습니다. ,15.
이 연구에서는 생성 및 3D 암 세포 섬유 아 세포 spheroids의 대사 분석 결과 설명 예제 및 모델, 췌장암을 사용 하 여. 2D 선박에 경작 하는 세포에서 시작, 우리 자석 bioprinting를 사용 하 여 췌 장 종양-섬유 공동 문화 spheroids의 문화 및 성장 조건을 보여 줍니다. 교양된 spheroids는 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기능 대사 분석 실험에 사용 했다, 두 개의 주요 에너지 생산 경로, 분해 및 다양 한 라이브에서 미토 콘 드리 아 호흡 동시에 측정 하는 기술 시연 세포와 조직16,17,18,,1920. 분해 측정 했다 extracellular 산성화 속도 (ECAR) 변경으로 미토 콘 드리 아 호흡 또는 산화 인 산화 측정 되었다 하는 동안 산소 소비 속도 (OCR)으로. 우리는 췌 장 종양 spheroids에 대 한 개발이 방법 최적화 및 3D 종양 회전 타원 체 세대와 다른 세포/조직 유형 분석 결과 번역 백본으로 사용할 수 있습니다 제안 합니다.
Protocol
1. 췌장암의 문화 3D Spheroids 자석 Bioprinting를 사용 하 여
- 사용 표준 무 균 조직 배양 기술, 적절 한 성장 매체에 70-80%의 confluency T75 플라스 크에 대 한 관심의 문화 셀.
참고: 일반적으로 5-7 × 10 6 세포는 70-80% confluent T75 플라스 크에서 했다 수확. 두 개의 서로 다른 세포 유형이이 연구-Patu8902에서에서 사용 되었다 (췌 장 종양 세포)와 PS1 셀 (활성화 된 췌 장 방사상 세포 21). 두 셀 라인 로스웰 파크 기념 연구소 미디어 1640 (RPMI-1640) 10% (v/v) 태아 소 serum(FBS), 1 × 페니실린-스 (p/s)와 보완에 교양 있었다. - 한 번 Dulbecco의 5 mL로 세포 세척 ' s 인산 염 버퍼 saline(DPBS).
- 플라스틱에서 분리 세포 표면 0.05%의 2 mL와 trypsinizing에 의해 트립 신-EDTA 37에서 5-10 분에 대 한 현미경으로 세포 분리에 대 한 ° C. 확인.
- 비활성화 trypsin 8 mL 성장 매체의 추가 의해 세포를 분리. 이 부정적인 건강/세포의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다 trypsinization, 피하기.
- 피펫으로 세포 아래로 단일 셀 펜션과 카운트를 생성 하는 자동화 된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 밀도 셀.
- 한편, 주위 온도에 NS의 유리병 equilibrate.
- 원하는 수 spheroids (우물)와 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 약 수를 뿌리기에 필요한 셀의 양을 계산 합니다. 예를 들어 전체 96 잘 접시 5000 셀/음, 약 수 적어도 5.5 × 10 5 셀 씨.
- 수집 셀 신중 하 게 3 분에 대 한 500 x g에서 centrifuging 발음 또는 가만히 따르다는 상쾌한 고 성장 매체에서 10 6 셀/mL x 1.0의 농도에서 세포를 resuspend. 부드럽게 넓은 지 루 피펫으로 팁을 사용 하 여 기울이기 피하기 위해 플라스틱. 예를 들어 성장 매체의 550 µ l resuspend 5.5 x 10 5 셀.
- Equilibrated NS (1.6 단계)를 사용 하 여 셀의 원하는 금액을 끌다.
- 직접
- 성장 매체에 세포 현 탁 액에 NS를 추가 하 고 부드럽게 선동. 라벨에 대 한 효율적인 자기 세포의, (1 x 10 6 셀/mL에서 resuspended) 100 µ L 셀 당 10 µ L NS 사용.
참고: 일반 실험에 대 한 레이블 5.5 × 10 5 Patu8902 세포 550 µ L 55 µ L NS와 1.1 × 10에에서 6 PS1 셀 1100 µ L, (별도) 110 µ L NS와. - 부드럽게 반전 튜브 몇 번 세포 현 탁 액을 위해. 일시적으로, 24-잘 접시의 단일 잘으로 셀-NS 믹스를 전송 합니다. 각 셀 형식을 자성에 대해 별도로 이렇게 합니다. 커버 플레이트 및 셀 표면에 NS 바인딩 수 있도록 부드러운 떨고와 2 시간에 대 한 실 온에서 세포를 품 어.
참고: 문화 및 공동 문화 spheroids 둘 다 시작 뿐만 아니라 Patu8902 또는 PS1 혼자 셀에서 시작 하는 spheroids의 분석 결과 셀 인쇄 마그네틱 드라이브에 성공적으로 독립에이 메서드를 사용 하 여 달성 하기 전에 혼합 유형 실험입니다. Patu8902 및 p s 2 세포에서 공동 문화 spheroids를 생성 하는 방법 후속 단계에 아래 설명.
- 성장 매체에 세포 현 탁 액에 NS를 추가 하 고 부드럽게 선동. 라벨에 대 한 효율적인 자기 세포의, (1 x 10 6 셀/mL에서 resuspended) 100 µ L 셀 당 10 µ L NS 사용.
- 피펫으로 자성된 셀 아래로 부드럽게 균일 하 게 혼합 하 고 원하는 셀 번호를 포함 하는 마스터 믹스를 준비 하. Spheroids 시드 (5000 Patu8902 + 10000 PS1) 15, 000 셀의 총을 사용 하 고 96 잘 접시의 당 150 µ L의 총 볼륨 조정.
참고: 각 음에 적절 하 게 최종 볼륨 사용 하는 셀의 수에 관계 없이 동일 이어야 합니다. - 96 잘 자기 회전 타원 체 드라이브 꼭대기 셀 구 충 제 96 잘 접시 놓고 각 우물에 셀 혼합의 150 µ L를 분배 합니다. 세포 관찰 천천히 자석 위에 우물의 센터에 수집 합니다. 커버 하 고 37 ° C에 아직도 연결 된 자석 회전 타원 체 드라이브 설정 5% CO 2 인큐베이터에서 하룻밤 접시를 품 어. 마그네틱 드라이브를 제거 하 고 추가 성장 최대 7 일 동안 품 어.
참고: 회전 타원 체 인쇄 자석 회전 타원 체 드라이브를 사용 하 여 셀 구 충 제 성장 격판덮개를 사용 하 여 중요 한 이다. 얇은 작은 자석 회전 타원 체 드라이브 사용 되도록 하지 지주 드라이브. - 성장의 spheroids 매일 모니터링합니다. 자기 각도에서 드라이브를 들고와 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 보낸된 미디어 끌어낼 것에 성장 격판덮개를 배치 하 여 3 일 마다 신선한 성장 미디어와 보충.
참고: Patu8902와 PS1 셀 공동에 15, 000 셀/잘 시드 5-7 일 이내 400-600 µ m의 직경을 가진 3D spheroids로 성장할 것입니다. Spheroids 신진 대사 특성, 약 평가 및 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비가 시점에서.
2. 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 생체 경로 대 한 3D 췌 장 종양 Spheroids의 대사 분석 결과
참고:이 섹션에서는, extracellular 플럭스를 사용 하 여 spheroids의 신진 대사 기능 분석 3D spheroids을 위해 설계 된 분석 결과 microplates로 분석기 설명.
- 세척 및 이전 spheroids의 성장 격판덮개에서 회전 타원 체 시험의 microplates.
참고: Spheroids ~ 500 µ m의 직경을 도달할 때 대사 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다.- 수행 분석 결과, 전날 제공된 유틸리티 접시에 분석 결과 calibrant (200 µ L/잘)와 프로브 또는 센서 카트리지를 수 화와 품 어 37에서 설정 습도 인큐베이터 (비 CO 2)에서 하룻밤 (4 월 18 일 h) ° c.
- 준비 적절 한 분석 결과 중간 원하는 대사 분석 결과 대 한 기본 미디어 (재료의 표 참조)을 보완 하 여 중 2 m m L-글루타민 분해 스트레스 테스트 (GST)에 대 한 분석 결과 또는 1 mM pyruvate, 2 m L-글루타민 m와 10mm 대 한 포도 당을 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 (MST) 분석 결과.
참고: 세포 외 유출 분석기 미토 콘 드리 아 호흡 (OCR) 및 96 잘 접시 형태로 라이브 셀의 분해 (ECAR)를 측정합니다. 이러한 요금 조사 샘플에 세포 신진 대사 기능에 대 한 개요를 제공합니다. 자세한 내용은 분석 결과 키트 설명서를 참조 하십시오. - 추가 시험의 특정 보충제 (2.1.1 단계 참조), 후 37 ° C 물 욕조에 보충된 분석 결과 매체 따뜻하고 pH 7.4 ± 0.1 0.1N 조정 NaOH. 매체 사용까지 따뜻하게.
- Reconstitute 시험 권장 재고 농도 보정된 분석 결과 중간 시 약 키트.
참고:이 만들어집니다 10 ×에서 우물에 원하는 최종 농도. 포도 당, oligomycin 2 의하여 포도 당 (2-DG) 재고 농도 100 mM, 100 µ M, 500 m m, 각각. - 성장 플레이트는 조명 아래에서 관찰 spheroids 현미경; 모양 및 structur 회전 타원 체 형태 및 전반적인 균일성에 대 한 확인spheroids의 e.
- 성장 플레이트 마그네틱 지주 드라이브에 전송 하 고 신중 하 게 ~ 120 µ L 성장 매체를 발음. 부드럽게 따뜻하게 하 고 사전 보정 분석 결과 미디어의 ~ 120 µ L 함께 spheroids를 세척 하 고 발음 하 고, 두 번 세척을 반복. Spheroids spheroids는 멀리 세척 되지 보장 하기 위해 다시 현미경 검사.
- 각 잘을 180 µ L 따뜻한 분석 결과 미디어를 추가 하 여 회전 타원 체 분석 결과 미 판 준비.
- 10 µ L를 P20 micropipette를 설정 하 고 그것을 넓은 지 루 팁에 맞는. 넓은 지 루 팁, 사용할 수 없는 경우 차단 일반 피 펫 팁의 팁 깨끗 한가 위 또는 구멍을 넓혀 메스.
참고:이 한다 전단 줄이고 플레이트 분석 결과를 전송 하는 동안에 spheroids의 전반적인 형태를 보존. - 는 따뜻한 (37 ℃) 표면을 사용 하 여 spheroids의 전송 수행. 화이트 라이트 램프로 따뜻하게 x 선 필름 뷰어 표면 대비 향상 하 고 원조 전송 과정에서 spheroids의 시각화를 사용 하 여.
- 신중 하 게 aspirate P20 micropipette를 사용 하 여 셀 구 충 제 성장 플레이트에서 단일 미리 씻어 회전 타원 체 넓은 장착 구멍 팁과 부드럽게 전송 회전 타원 체는 대사 수행에 대 한 회전 타원 체 분석 결과 플레이트의 각 우물의 센터에 직접 분석 결과입니다. 부드럽게 분석 결과 접시를 채우기 위해 순수한 중력에 의해 각의 중앙 마이크로 챔버로가에 각 회전 타원 체 허용.
참고: 그것은 일반적으로 각 회전 타원 체 중력 우물의 중심으로가을 대 한 5-8 s를 걸립니다. spheroids 마이크로-챔버에 정착 할 때까지 피펫으로 밖으로 당겨 하지 마십시오. 배경 웰 스도 사용 될이 이후 분석 결과 플레이트 (A1, A12, H1, H12)의 4 코너 우물에서 예금 spheroids 하지 않습니다. - 형태와 각 회전 타원 체의 각 센터에는 되도록 각 회전 타원 체의 위치를 모니터링 합니다. 회전 타원 체의 넓은 사용 하 여 밖으로 발음에 의해 잘의 중심에 위치 변경 보어 중력에 의해 피펫으로 후속 증 착 및 필요한 경우.
- 모든 spheroids 전송 되었습니다, 일단 1 시간 이전 시험에 대 한 분석 결과 접시는 37 ° C 습도 공기 인큐베이터 (비 CO 2)에 배치.
- 화합물 및 수행 분석 결과 센서 카트리지 로드
- 준비 10 × 집중 분석 결과 특정 시 약 단계 2.1.2에서에서 설명한 분석 결과 특정 미디어에. 예를 들어 GST 수행, 포도 당, oligomycin, 및 2-DG 권장된 볼륨에 다시 구성할 언급 분석 결과 설명서에. GST 및 MST 분석 Patu8902 PS1 spheroids를 사용 하 여 실시 했다.
- 제대로 센서 카트리지 행 왼쪽에 A H 표시 방향을 지정 하 고 센서 카트리지 위에 로드 가이드를 배치 합니다. 원하는 포트의 정확한 로드 로드 가이드는 해당 포트를 로드 하는 문자는 왼쪽 상단 모서리에 동쪽으로 향하게 하 여 보장.
- 주입 포트에 직접 약을 분배 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여. 절차에 걸쳐 손끝을 사용 하 여 위치에서 로드 가이드를 잡아.
참고: 각 시 약 분석 결과 설명서에서 권장된 포트에 주입 될 것입니다. 공기 거품을 만들지 않도록 하지만 어떤 부분의 기포를 제거 하는 카트리지를 누릅니다 하지 않습니다. - 로드 가이드 및 카트리지 눈높이 위치 시각적으로 로드 주입 포트 검사 제거.
- 실험 분석 결과 디자인/악기 프로토콜 섹션 2.3에에서 설명 된 대로 악기 컨트롤러 웨이브 소프트웨어 (금 후, 분석 소프트웨어)를 사용 하 여 만듭니다.
- 시험 설계 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 실행
- 실험에 대 한 분석 결과 템플릿 만들기
- 분석 소프트웨어를 열고 클릭 " 서식 파일 "는 기존 분석 결과에서 선택 하거나 템플릿입니다. 더블 클릭 " 빈 서식 파일 ".
- 정의 실험적인 그룹 및 조건입니다.
- 포트 A, B 및 C. 떠나 정의 주입 전략 포트 D 빈.
참고: GST 분석 결과 대 한 이러한 포트에만 로드 됩니다 포도 당, Oligomycin와 2-DG. MST 분석 결과, 경우 oligomycin FCCP,로 테 논 로드 됩니다. - 정의 사전 치료 경우 spheroids 컨트롤 그룹과 하나 이상의 테스트 화합물으로 치료 했다. 분석 결과 미디어 소스, 보충, 및 기타 정보를 포함 하도록 정의.
- 하나 이상의 셀 유형 (예: Patu8902, PS1) 밀도 및 통로 번호 정보를 보고 정의.
- 포트 A, B 및 C. 떠나 정의 주입 전략 포트 D 빈.
- 클릭 " 그룹 생성 ".
- 클릭 " 플레이트 지도 " 탭 및 그룹을 해당 실험 디자인 하 시험 접시 할당.
- 배경 우물으로 4 개의 코너 웰 스를 선택합니다. 이 우물에서 아무 spheroids는 확인 하십시오.
- 실험에 대 한 분석 결과 템플릿 만들기
- 분석기에서 분석 결과 실행
- 악기 프로토콜 탭에서 클릭 선택 하 여 기본 프로토콜 명령을 유지 " 보정 ", " 평형 "와 " 기준 측정 주기 ".
- 클릭 " 주사 " 화합물 각 포트에 대 한 정의. 편집 측정 주기 6 사이클에는 기본에서 spheroids에 대 한 3 주기. 기본 3 분 믹스, 0 분 대기, 3 분 측정 시간을 유지.
참고: 기본 믹스-대기-측정 시간은 3 분, 0 분, 3 분, 각각. 3 기저 속도 측정 일반적으로 첫 번째 시험 화합물의 주사 전에 간다. 이러한 측정을 보정 하 고 실험적인 디자인에 의하여 재조정 수. - 프로토콜 및 그룹 요약 검토.
- 분석 결과 디자인 서식 파일 저장.
- 주입 포트 분석 결과 기판으로 로드 되 면 사전 분석 결과 보정을 진행 합니다. 세포 외 유출 분석기 유틸리티 플레이트 카트리지 전송.
참고:이 일반적으로 15-20 분 이내 완료 및 OCR 및 ECAR 측정 센서 보정. - 카트리지의 교정, 후 3D spheroids를 포함 하는 미리 데워 분석 결과 플레이트 유틸리티 접시를 대체 하 고 분석 결과 시작할. 측정 완료 후 스프레드시트 또는 그래프와 통계 소프트웨어 데이터를 분석 하는 데이터를 내보낼.
Representative Results
마그네틱 bioprinting 및 3D spheroids의 세포 외 유출 분석에 대 한 일반적인 워크플로
그림 1 이 프로토콜에서 설명 하는 전체 프로세스에 대 한 개요를 보여 줍니다. 췌 장의 암 세포 (Patu8902)와 활성화 방사상 세포 (PS1) 70-80%의 confluency에 적절 한 성장 매체를 포함 하는 조직 배양 플라스 크에서 경작 했다. 셀 2D 문화 용기에서 분리 했다 세척, 셀 밀도 결정 했다 그리고 마지막으로 1 × 106 셀/mL에 성장 매체에 resuspended 세포. NS, 금, 철 산화물, 그리고 폴 리-L-리 신으로 구성 된 나노 입자 어셈블리 끌다 셀에 사용 되었다. 개별적으로 자성된 Patu8902와 PS1 셀 혼합 그리고 자석 회전 타원 체 드라이브에 장착 된 96 잘 셀 구 충 제 성장 판에 인쇄 된 했다. 우리는 시드 단일 잘 (5000 Patu8902 셀 단일 회전 타원 체를 생성 하는 10000 PS1 세포와 혼합)를 위한 세포의 총 수를 15000을 최적화 했습니다. 어느 시간 동안 이러한 spheroids의 성장 했다 모니터링 하 고 기록 5-7 일에 대 한 적절 한 조직 배양 조건에서 부 화 후 3 차원 spheroids 획득 했다. 씻은 후 분석 결과 미디어와 함께, spheroids 분해 및 미토 콘 드리 아 호흡의 동시 측정을 위한 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 신진 대사 분석을 수행 하는 회전 타원 체 microplate에 물리적으로 옮겨 졌다.
문화 및 췌 장 종양-섬유 아 세포 spheroids의 성장
기능 및 강력한 spheroids를 하려면 상피 암 세포 Patu8902를 라인을 PS1 보충 소 태아 혈 청 RPMI 1640에 교양 있었다 방사상 세포를 활성화 합니다. Pat8902와 PS1 셀 NS와 자기 했다 다음 함께 혼합 1: 2의 비율에 성장 격판덮개에 잘 당 15, 000 셀의 총 씨 만큼. 마그네틱 드라이브에 셀 인쇄의 24 시간 이내 셀 focalized 우물의 센터에 각 잘 아래 각 자석 핀 위에 정확 하 게. Patu8902-PS1 spheroids의 성장 일 2, 4, 7 및 9 셀을 뿌리기 후에 영상 모니터링 했다. 그림 2 는 다양 한 시간 점에서 위의 대표 spheroids의 평균 직경의 정량화를 보여준다. Spheroids의 직경 7 일에 596 µ m 2 게시물 인쇄 당일 414 µ m에서 증가 합니다. 9, 7 일에 성장 사이의 큰 차이 고 따라서 모든 더 실험 제한 되었다 회전 타원 체 성장의 7 일. 우리는 spheroids 취득 외부 가장자리의 주위에 특히 선명 형태학 및 NS 점차적으로 더 균등 하 게 확산 되는 회전 타원 체의 볼륨에 걸쳐 문화에 더 많은 일을 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 그들의 축과 단축의 길이에 따라 10 spheroids의 구형 추정. 평균 구형 0.92 ± 0.04 Patu8902 혼자 (종양), PS1 (실질) 혼자와 0.94 ± 0.02 공동 문화 spheroids에 대 한 0.95 ± 0.04 이다.
를 사용 하 여 췌 장 3D spheroids의 기능 변화 분석 결과 세포 외 유출 분석기
spheroids의 기능을 테스트 하려면 우리 고용 대사 및 생체 분석 조사 spheroids에 에너지 경로. 우리 spheroids 위에서 설명한 교양에 분해 스트레스 테스트 실시. 이 위해, spheroids 공동 문화는 두 종류의 세포에서 인 뿐만 아니라 Patu8902 또는 PS1 세포에서 생성 된 분석 결과를 받게 했다. 흥미롭게도, 모든 세 가지 유형의 spheroids, 개별 또는 혼합 세포에서 발생 하는 여부 GST 분석 결과에 대 한 생물학 기능 응답 전시. Saturating 포도 당 농도, 주입 시 spheroids 유형 테스트 쇼 증가 glycolytic 통로에 ECAR (그림 3)에 있는 증가 의해 입증. Oligomycin를 사용 하 여 미토 콘 드리 아의 ATP 생산은 저해 하는 경우 에너지 생산 분해를 그리고 증가 ECAR에 볼 최대한 glycolytic 용량 셀을 밀어. 2-DG, 경쟁적으로 포도 당 hexokinase glycolytic 활동으로 인해 ECAR 이전 증가 했다는 ECAR 감소 귀착되는 포도 당 아날로그를 사용 하 여 분해 억제 우리는 PS1 혼자 spheroids (평균 직경 250 µ m)으로 인해 그들의 작은 크기와 낮은 glycolytic 용량 Patu8902 암에 비해 상대적으로 낮은 신호 했다 비록이 연구에서 테스트 spheroids이이 패션에 응답 발견 셀 (평균 직경 600 µ m)입니다. 일반적으로, 더 높은 ECAR 신호 파생 된 종양 세포에서 spheroids에서 상대적으로 작은 PS1 구와 그에 비해 파생 spheroids, 가능 하 게 분해22로 암 세포의 고유의 대사 성향에 표시 될 수 있습니다. 23. 비록 우리가 발견 하는 각 형식, PS1 혼자 spheroids 작은, 되 고 중 회전 타원 체 크기 변화 다음 공동 문화 spheroids, 모든 세 가지 유형의 spheroids 셀의 동일한 수를 뿌리기에서 파생 되었다 Patu8902 혼자 spheroids 되는 가장 큰.
3D spheroids에서 미토 콘 드리 아 기능을 테스트 하려면 우리 MST 분석 결과 공동 문화 spheroids 대상이. MST 셀 (그림 4A 와 4B)의 OCR를 직접 측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능의 주요 매개 변수를 측정 합니다. 화합물 (oligomycin, FCCP, 그리고로 테 논 및 antimycin A의 혼합)와 직렬 주입 키 미토 콘 드리 아 등의 매개 변수, ATP 생산, 최대한 호흡, 비-미토 콘 드리 아 호흡을 측정 하기 위해 사용 되었다. 이러한 매개 변수 및 기초 호흡 속도 더 양성자 누출 및 예비 호흡기 용량 (그림 4C)을 계산 하기 위해 사용 되었다. 응답 oligomycin으로 OCR에 감소, ATP synthase (복잡 한 V)의 억제제 셀룰러 ATP 생산과 관련 된 미토 콘 드리 아 호흡에 연관 시킵니다. Spheroids는 oligomycin 최대한 침투 및 효율적인 응답 시간을 허용 하는 긴 기간에 대 한와 함께 알을 품을 했다. FCCP uncoupler와 함께 두 번째 주입 극대 산소 소비와 OCR 증가 자극. FCCP 자극 OCR 예비 호흡기 용량, 증가 에너지 수요에 대응 하는 세포의 능력의 측정을 계산 하는 데 사용 되었습니다. 3 주입; 로 테 논, 혼합 한 (복잡 한 나 억제제), 및 antimycin A (복잡 한 III 억제제) 차단 OCR (그림 4B 의 날카로운 감소도 미토 콘 드리 아 호흡옹 >).
전반적으로, 우리의 관측 위에서 설명한 대로 그들의 신진 대사 발자국/활동 모두 glycolytic 및 미토 콘 드리 아 잠재력 측면에서 측정으로 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 경작된 spheroids의 기능을 확인 합니다.
그림 1 . 문화와 췌장암 세포/섬유 spheroids의 분석 결과 대 한 방법론의 도식 대표. Patu8902 및 PS1cells 교양, trypsinized, 세척 되었고 계산. 시드의 각 회전 타원 체, Patu8902 (5, 000 셀/잘)와 PS1 섬유 아 세포 (10, 000 셀/잘) NS를 사용 하 고 하루에 1 셀 구 충 제 성장 플레이트에 인쇄 된 자력을 띠게 했다. 시드, 후 성장 플레이트 (96 잘 포맷 성장 플레이트의 각 우물에서 하나의 자석)와 자기 회전 타원 체 드라이브에 탑재 되었고 3D spheroids를 2-7 일에 대 한 문화 수 있습니다. 결과 spheroids 세척 되었고 세포 외 유출 악기에 대사 분석을 수행 하는 회전 타원 체 분석 결과 microplates로 전송. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 췌 장 종양-섬유 아 세포 spheroids의 성장. (Patu8902-PS1 공동 문화 문화 날에 해당 회전 타원 체의 대표 이미지 A)를 상단에 표시 되 고 회전 타원 체 (µ m)의 직경에 크기 아래 계량. 회전 타원 체 크기와 볼륨에 걸쳐 NS 입자 (검은 점)의 보급에 있는 진보적인 증가 2 그리고 7 일 사이 분명 하다. Spheroids는 회전 타원 체 직경에 상당한 증가 초래 하지 않았다이 후, 추가 2 일 문화에 유지 했다. (종양 세포 (Patu8902), 기질 세포 (PS1)와 공동 배양된 세포 (Patu8902 + PS1)에서 파생 된 spheroids의 B) 대표적인 사진은 표시 됩니다. (C) 구형 데이터는 각 그룹에서 10 개인 spheroids에서 묘사 된다. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 분해 스트레스 테스트 (GST) 췌 장 spheroids. (다양 한 분석 결과 매개 변수 묘사는 전형적인 glycolytic 함수 분석 결과의 A) 도식 표현입니다. (B) GST 테스트의 예 췌 장 spheroids 설명 된 방법론을 사용 하 여 양식에서 수행. 포도 당 주입 분해 ECAR, 미토 콘 드리 아 호흡을 차단 하는 oligomycin의 추가에 더 증가 함께 증가로 볼 최대 경사로. ECAR 분해를 차단 하 여 2-dg, 포도 당의 경쟁력 있는 아날로그 응답에 빠진다. 모든 spheroids는 GST 분석 결과에 대 한 기능 응답을 전시 설명 되어 있습니다. (GST 분석 결과의 세 가지 주요 매개 변수를 묘사 하는 제조업체의 보고서 생성기를 사용 하 여 GST 분석 결과의 C)는 출력. 오차 막대를 나타냅니다 표준 오차 (SEM)의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 (MST)와 Patu8902 PS1 spheroids. (다양 한 분석 결과 매개 변수는 전형적인 미토 콘 드 리아 기능 분석 결과의 A) 회로도 표현을 묘사 된다. (B) 췌 장 종양-섬유 spheroids에 MST의 예가 표시 됩니다. (C) 공동 문화 3D spheroids MST 분석 결과에 대 한 기능 응답을 전시 한다. 예상 했던 대로, OCR 하락으로 측정 하는 미토 콘 드 리아 기능 spheroids oligomycin, ATP synthase 억제제와 함께 도전 하는 때 주의 되었다. 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여의 저해 시 즉시 축소 최대한 OCR 결과 FCCP 전자 흐름을 램프를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 복잡 한 억제제의-칵테일. 오차 막대를 나타냅니다 표준 오차 (SEM)의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
췌장암, 3층 을 사용 하 여 주요 원인이 암 관련 사망자24, 예제와 모델, 신속 하 고 일관 된 방법으로 개발 되었다 성장 하 고 췌장암 세포의 공동 문화를 사용 하 여 3D spheroids 분석 결과 미국에서와 췌 장 섬유 아 세포 활성화. 마그네틱 bioprinting를 사용 하 여, 직경에 있는 400-600 µ m에서 크기에서 배열 하는 spheroids 획득 했다. 이러한 대사 분석 교양된 3D spheroids의 기능을 성공적으로 테스트를 받게 했다. 이 방법은 간단 하 고 일관 된 이며 다른 세포 유형에 쉽게 적응 시킬 수 있다.
동안이 방법을 가속화 되며 3D spheroids를 사용 하 여 수행 하는 분석 실험의 변환 값에 추가, 회전 타원 체 조작의 멀티플렉싱 및 처리 기술을 개발 하 여 향상 될 수 있습니다. 이 전체 시간, 비용 및 분석 결과 수행 하는 데 필요한 노동 감소 추가 해야 합니다. 또한, 정상화 OCR 신호6다른 사람에 의해 보고 하 회전 타원 체 볼륨을 사용할 수 있습니다. 회전 타원 체 볼륨 셀의 평균 볼륨 정규화 셀 당 OCR을 결정 하기 위해 사용 될 수 있지만 계산 셀 당 절대 OCR을 도전 수 있습니다 spheroids의 성장 같지 않을 것 이다, 이후. 현재,이 방법론은 환경 시험에 성장 격판덮개에서 다중 회전 타원 체 처리 및 전송에 효율적인 도구의 부족에 의해 제한 됩니다.
설명 하는 방법은 수정 하 고 자석 bioprinting 기술에서 적응 이며 더 교양된 spheroids 다운스트림 대사 분석 결과 적용 하 여 기능적 관련성을 표시 확인. 메서드는 대부분 종양 조직, 암 세포 및 다른 조사 가능한 분석 실험을 위해 채택 될 수 있다, 암 관련 된 섬유 아 세포에 있는 두 개의 주요 셀 형식을 포함 하는 강력 하 고, 가능한 고 기능 spheroids을 생성 하는 중요 한 도구를 제공 합니다. 같은 약물 스크린. 상대적 용이성 및 NS 방법론의 효율성 같은 교수형 드롭 방법2,26 회전 타원 체 세대의25의 다른 방법을 통해 주요 개선 이다.
이와 같이 생성 하는 강력한 spheroids는 생체 외에서 종양 모델 stromal 세포, 종종 많은 3D 문화 연구에서 포함 된 제공 합니다. 이와 같이 생성 된 3D 회전 타원 체 모델의 응용 프로그램에 대 한 가능성은 광대 한. 예를 들어 같은 모델 세포 세포 상호 작용, 생체 변화를 조사 하 고 유전적 민감성과 다양 한 치료 regimens의 테스트를 사용할 수 있습니다. Vivo에서 종양 microenvironment 정리 3D spheroids 마약 검사 연구와 현재 및 새로운 치료제의 행동의 메커니즘을 조사 하 고 그에 대 한 매우 적절 하 고 유용한 도구 역할을 합니다. 에너지 경로 spheroids 돌연변이 세포 문화 그 유전자 및 암, 관련 3D 모델에서 pathobiology에 관련 된 통로의 역할에 새로운 빛을 발산 도움이 될 수를 사용 하 여 프로 빙 대사 분석이이 연구에서 설명 하는 spheroids 같은.
이 방법의 성공적인 응용 프로그램 제일 이유 로그 단계에서 성장 하는 세포를 수확 해야 하며 자기는 자기 인쇄에 필요한 세포의 건강에 의존 합니다. 그것은 자석 회전 타원 체 드라이브를 사용 하 여 인쇄 자성 전지와 하지 지주 드라이브, 회전 타원 체 세척 및 미디어 보충 설명된 방법의 단계 중에 활용 해야 하는 중요. 변화 분석 실험의 성공적인 판독에 대 한 다른 가장 중요 한 측면은 시험 접시에 성장 격판덮개에서 전송 과정은 spheroids의 형태를 유지 하는 것입니다.
전반적으로,이 프로토콜 암, stromal 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 spheroids의 후속 대사 분석 결과 다음을 포함 하는 3D spheroids의 생성을 위해 설립 되었습니다. 이 방법의 주요 특징은은 빠르고, 쉽게 적응 하 고 일관 된, 관련 그리고 vivo에서 종양 microenvironment 모방, 비교적 저렴을 항 암 종양 생물학을 공부 하 고 개발 하기 위한 새로운 도구로 제공할 수 있다 요원입니다.
Disclosures
저자 조지 W. 로저스와 앤드류 닐슨 직원/주주 Agilent 기술 시 약 및이 문서에서 사용 되는 악기를 생산 하는. 다른 모든 저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 문화 조건 최적화 및 회전 타원 체 성장 모니터링에 사무엘 Zirbel에 게 감사 하 고 싶습니다. 우리는 해 마 XFe96 분석기, 분석 시 약 및 기술 통찰력을 제공 하기 위한 Agilent 기술에 감사입니다. 우리 또한 감사 박사 Hemant Kocher 바트 암 연구소 영국에서 제공 하는 PS1 셀. 이 작품 지원 부분에서 Seena Magowitz 재단에 의해 췌 장 암 연구와 서 최대 암-암 연구 영국 루스 재단 췌 장 암 드림 팀 연구 부여 (부여 번호: SU2C-AACR-DT-20-16). 암 최대 스탠드 엔터테인먼트 산업 재단의 프로그램입니다. 연구 보조금은 암 연구, SU2C의 과학적인 파트너를 위한 미국 협회에 의해 관리 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Sigma | 25300-054 | |
| 96 well cell repellant plate | USA Scientific/ Griener Bio-One | 655970 | spheroid growth plate |
| Cellometry Cell counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| D-Glucose | Sigma | D9434 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103020-100 | |
| L-Glutamine | Sigma | 59202C | |
| Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| n3D Magnetic Spheroid drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
| n3D Magnetic Spheroid holding drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
| n3D NanoShuttle-PL | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4 °C |
| Patu8902 cells | Laboratory Stock | pancreatic ductal adenocarcinoma cells | |
| PS1 cells | Laboratory Stock | activated pancreatic stellate cells | |
| RPMI1640 | Gibco | 11875-093 | growth media for cells, spheroids |
| SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer | Agilent Technologies | extracellular flux analyzer | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| XF Base media | Agilent Technologies | 102365-100 | base media for metabolic assays on XFe96 |
References
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5 (3), 239-248 (2011).
- Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
- Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22 (2), 151-152 (2004).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, New York, N.Y. November 1708-1712 (2001).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532 (7598), 255-258 (2016).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5 (4), 291-296 (2010).
- Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8 (10), 1940-1949 (2013).
- Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987 (2015).
- Tseng, H., et al. Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. , Promega Corporation. Updated (Figure 1) 1-9 (2015).
- Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19 (9), 665-675 (2013).
- Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
- Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
- Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
- Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300 (2013).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918 (2016).
- Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175 (2), 636-648 (2009).
- Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66 (18), 8927-8930 (2006).
- Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13 (3), 170-188 (2013).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
