Summary
Apresentamos uma imunoprecipitação da cromatina nativa modificada sequenciamento (ChIP-seq) metodologia para a geração de conjuntos de dados sequência apropriadas para um quadro analítico de nucleossoma densidade ChIP-seq integrando acessibilidade nuclease micrococcal (MNase) com medidas de modificação de histona.
Abstract
Apresentamos uma imunoprecipitação da cromatina nativa modificada sequenciamento (ChIP-seq) protocolo experimental compatível com uma mistura gaussiano distribuição baseada análise metodologia (densidade nucleossoma ChIP-seq; ndChIP-seq) que permite a geração de medições combinadas de acessibilidade nuclease micrococcal (MNase), com modificações do histone todo o genoma. Posição do nucleossoma e densidade local e a modificação pós-traducional de suas subunidades de histona, agir em conjunto para regular a transcrição local Estados. Medições combinatórias de acessibilidade nucleossoma com modificações do histone gerada pelo ndChIP-seq permite o interrogatório simultâneo desses recursos. A metodologia de ndChIP-seq é aplicável a um número pequeno de células primárias inacessíveis para cross-linking protocolos baseados em ChIP-seq. Tomados em conjunto, ndChIP-seq permite a medição da modificação do histone em combinação com densidade nucleossoma locais para obter novos insights compartilhados mecanismos que regulam a transcrição do RNA dentro das populações raras célula primária.
Introduction
O genoma eucariótico é empacotado em cromatina através de repetir estruturas nucleossoma que consistem em duas cópias de quatro proteínas histonas (por exemplo, H2A, H2B, H3 e H4) circunscritas por 146 pares de bases de DNA1,2. Complexos de remodelação de cromatina controlam nucleossoma posição dentro dos limites de promotor do gene e participarem na regulação da expressão gênica, alterando a acessibilidade do DNA para fatores de transcrição e o RNA polimerase máquinas3, 4.
Aminoácidas terminais caudas das histonas dentro nucleossoma são submetidas a várias modificações covalentes, incluindo acetilação, metilação, fosforilação, ubiquitylation, sumoylation, formilação e hidroxilação dos aminoácidos específicos5 , 6 , 7 , 8. posições e graus destas modificações ditam um estado de cromatina que influenciam a cromatina estrutura e controle de acesso dos complexos moleculares que permitem a ativação da transcrição7. Dado que ambos modificação de densidade e histona nucleossoma desempenham um papel no controle local da transcrição do gene, desenvolvemos uma abordagem de ChIP nativa que permite a medição simultânea de densidade nucleossoma e histona modificação9, 10.
ChIP-seq nativo aproveita a nuclease micrococci de endonuclease (MNase) para digerir a cromatina intacta em seu estado nativo dentro do núcleo11,12, uma propriedade que tem sido aproveitada para mapear nucleossoma posicionamento13 , 14 , 15. densidade nucleossoma ChIP-seq (ndChIP-seq) aproveita-se da propriedade de acesso preferencial de MNase para abrir regiões da cromatina para gerar medições que combinam MNase acessibilidade com histona modificação10. ndChIP-seq é adequado para a caracterização das modificações do histone em culturas de células, tecidos e raras células primárias. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que permite a geração de conjuntos de dados sequência apropriadas para um quadro analítico descrito anteriormente trabalho10 que integra o fragmento tamanho post imunoprecipitação, determinada pelo emparelhado-ler os limites, a fim ao mesmo tempo investiga MNase acessibilidade com medições de modificação de histona. Anteriormente, a aplicação do presente protocolo para 10.000 sangue de cordão umbilical humano primário derivado CD34+ células e células estaminais embrionárias humanas revelou únicas relações entre modificações de estrutura e histonas cromatina dentro destes tipos10 de célula . Dada a sua capacidade de medir simultaneamente acessibilidade nucleossoma e modificação de histona, ndChIP-seq é capaz de revelar características de epigenomic em uma população de células em um nível único nucleossoma e resolvendo assinaturas heterogêneas em sua elementos constitutivos. Um exemplo da exploração das populações celulares heterogêneas por ndChIP-seq é investigação de promotores bivalentes, onde tanto H3K4me3, uma marca ativa e H3K27me3, uma marca de repressiva, são presentes10.
Protocol
Nota: A entrada mínima para este protocolo é de 10.000 células por reação única imuno-precipitação (IP). Imprima a planilha fornecida experimental e utilizar como uma diretriz para planejar o experimento. Incubação à temperatura ambiente é assumidas como ~ 22 ° c. Todas as receitas do amortecedor são fornecidas na tabela 1. Todos os buffers devem ser armazenados a 4 ° C e mantidos no gelo durante o procedimento, salvo indicação em contrário.
1. preparação da pilha
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Células cultivadas
- Lavar as células com 1 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS) e determinar com precisão a concentração de células usando um hemocytometer. Se houver mais de 1 milhão de células, aumento do volume de PBS.
- Com base na contagem de células, alíquota equivalente de 70.000-100.000 células em um tubo estéril de 1,5 mL e spin-down a 500 x g, durante 6 min a 4 ° C. Utilizando uma pipeta, remova lentamente e descartar o sobrenadante (sem perturbar o centrifugado) e resuspenda o pellet em lise gelada + 1 x inibidor da protease cocktail (PIC) a uma concentração de 1.000 células / µ l. Misture bem pipetando acima e abaixo de 20-30 vezes. É fundamental que aglomerados de células são rompidos. Não tente criar bolhas.
- Vá direto ao dia 1 (seção 2) do protocolo ndChIP-seq ou flash congelar o centrifugado em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C.
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Células classificadas
- Colete 70.000-100.000 classificada16 células em um tubo de 1,5 mL com 350 µ l de solução salina tamponada (HBSS), de Hank ou PBS + 2% de soro fetal bovino (FBS).
- Spin para baixo cada célula alíquota a 500 x g, durante 6 min a 4 ° C. Utilizando uma pipeta, remover o sobrenadante (sem perturbar o centrifugado) lentamente e Resuspenda em lise gelada + 1 x PIC para uma concentração final de 1.000 células / µ l. Misture bem em tampão de Lise pipetando para cima e para baixo 20 - 30 vezes. Certifique-se de que os grupos de células são rompidos. Não tente criar bolhas.
- Vá direto ao dia 1 (seção 2) do protocolo ndChIP-seq, ou flash congelar o centrifugado em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C.
2. dia 1: ndChIP-seq
- Preparação do complexo anticorpo-grânulo
- Prepare um banho de água de 37 ° C e um balde de gelo. Trabalhando no gelo, preparar o tampão de x IP 1/1 x PIC e anticorpo (Ab) tampão de diluição 1x e mantê-los no gelo. Recupere A de proteína (ou G) grânulos magnéticos (veja a discussão de critérios de seleção) do armazenamento de 4 ° C e mistura muito bem suave pulso-num Vortex. Mantê-lo no gelo.
Nota: Num pulso-Vortex significa num Vortex é interrompido toda vez que um vórtice completo é formado no tubo. - Transferência 24 grânulos de magnético µ l de proteína A (ou G) por reação de IP em um novo tubo de 2 mL. Registrar o volume dos grânulos e mantenha o tubo no gelo. Exemplo, por 7 IPs, uso µ l 24 x 7 = 168 µ l.
- Colocar o tubo sobre o íman em forma de tubo e esperar a solução tornar-se clara indicando separação do grânulo. Sem perturbar os grânulos, cuidadosamente, remover o sobrenadante com uma pipeta e descarte. Pegue o tubo fora o íman em forma de tubo e colocá-lo no gelo.
- Adicione um volume igual (ou seja, volume inicial de grânulos) do buffer IP gelada + 1 x PIC misturar. Misture pipetando para cima e para baixo. Fazer não o vórtice.
- Coloque o IP reserva + 1 x PIC + grânulos de volta para o íman em forma de tubo e esperar que a solução se tornar clara separação de grânulo indicando. Sem perturbar os grânulos, cuidadosamente, remover o sobrenadante com uma pipeta e descarte. Repita buffer a frio IP + 1 X lavagem PIC duas vezes mais para um total de 3 lavagens.
- Após a lavagem final, resuspenda as contas em um volume igual (ou seja, volume inicial de grânulos) do buffer IP gelada + 1 x PIC misturar. Misture pipetando para cima e para baixo. Fazer não o vórtice. Mantenha o tubo no gelo.
- No gelo, despeje 10 mL de tampão IP + PIC em um reservatório em forma de V de 25 mL. Usando uma pipeta multicanal, adicionar 130 µ l de tampão IP gelada + 1 x mistura PIC em poços individuais de um poço-96 V-fundo limpo placa. Encha um poço por IP. Rotular a placa como "complexo de Ab-pérola".
- Adicionar 12 esferas magnéticas de µ l da A de proteína lavada (ou G) em cada bem contendo tampão IP + PIC e misturar pipetando para cima e para baixo. Manter as restantes contas lavadas no gelo.
- Obter validados os anticorpos de seu armazenamento frio e degelo no gelo, se necessário. Trabalhando no gelo, dilua os anticorpos com tampão de diluição 1x Ab para as concentrações mostradas na tabela 2.
- A cada poço da placa complexo Ab-grânulo, adicione 1 µ l do anticorpo adequado, diluído (tabela 1). Registro do poço para a chave de anticorpo. Usando a pipeta multicanal, misture cada linha pipetando subir e descer 20 vezes. Trocar dicas entre linhas. A Ab-grânulo complexa a placa do selo muito bem com uma tampa da placa de alumínio e incubar a 4 ° C em uma plataforma giratória pelo menos 2 h.
Nota: Esta incubação possa prosseguir até estar pronto para começar a etapa 2.4.
- Prepare um banho de água de 37 ° C e um balde de gelo. Trabalhando no gelo, preparar o tampão de x IP 1/1 x PIC e anticorpo (Ab) tampão de diluição 1x e mantê-los no gelo. Recupere A de proteína (ou G) grânulos magnéticos (veja a discussão de critérios de seleção) do armazenamento de 4 ° C e mistura muito bem suave pulso-num Vortex. Mantê-lo no gelo.
- Digestão de Lise e cromatina celular
- Trabalhando no gelo, preparar o tampão de Lise 1x + 1 x PIC e 1 mL de MNase eu diluição buffer (tabela 3) e mantê-los no gelo.
- Recupere as pelotas de cela de seu armazenamento-80 ° C (ou de gelo, se preparados na hora). Descongele cada pellet de células em um banho de água de 37 ° C para um 10 s, então a transferência para o gelo.
- Para cada centrifugado imediatamente adicione gelada 1 x lise + 1 x PIC para uma concentração final de 10.000 células/20 µ l e misture 10 vezes pipetando cima e para baixo, sem criar bolhas. Por exemplo, para 70.000 células o volume final é 140 µ l.
- Trabalhando no gelo, alíquota 20 µ l/poço dos lysates resultantes em uma placa de 96 poços. Cubra o prato com um selo plástico e incubar no gelo por 20 min. rótulo a placa "MNase digestão" e gravar os poços para uma chave do modelo. Para assegurar um sincronismo exato da reação de digestão da cromatina, não proceda à digestão com mais de 2 linhas de amostras de cada vez.
- Pouco antes da lise de 20 min é completa, diluir o MNase eu enzima com MNase eu diluição do buffer, para uma concentração final de 20 U / µ l e mantê-lo no gelo.
- Trabalhando no gelo, preparar a MNase eu digestão mestre mistura de acordo com a tabela 4 e alíquota 20 µ l da mistura por cada linha de amostras mais volume morto de 5 µ l em uma linha de uma placa de 96 poços reservatório e mantê-lo no gelo. Para duas linhas, o volume deve ser: (20 µ l x 2) + 5 µ l = 45 µ l.
- Depois os lysates terminar incubando, retire a placa de digestão MNase de gelo. Usando uma pipeta multicanal, adicionar 20 µ l de MNase eu digestão mestre mistura em cada linha de amostras e misture 10 vezes pipetando para cima e para baixo. Trocar dicas entre linhas. Incube a temperatura ambiente por exatamente 5 min.
- Depois de 5 min, para parar a reação, use uma pipeta multicanal para adicionar 6 µ l de ácido etilenodiaminotetracético de 250 µM (EDTA) para cada linha de amostras e misture para cima e para baixo... algumas vezes. Trocar dicas entre linhas. Após adição de EDTA, mude a configuração da pipeta para 20 µ l e misture 10 vezes pipetando para cima e para baixo para garantir uma parada completa da reação de digestão. Trocar dicas entre linhas.
- Usando uma pipeta multicanal, a cada linha das amostras MNase digerido, adicione 6 µ l de 10x Lise e mistura bem pipetando acima e para baixo 10 vezes. Cubra com um selo plástico e incubar no gelo por 15 min.
- Pre-esclarecimento e separação de entrada
- Após a incubação de 15 min, trabalhando no gelo, piscina, todos os poços para a mesma célula da pelota/modelo em uma estéril, pré-refrigerados no gelo, tubo de 1,5 mL (pre-rotulado com o modelo de identificação) e misture completamente, mas lentamente, usando uma pipeta para evitar a formação de espuma detergente.
- Para cada célula da pelota/modelo, transferi 8 µ l da cromatina digerida em um novo estéril, tubo de 0,5 mL (pre-rotulado com o modelo de identificação) e loja a 4 ° C durante a noite. Isto servirá como o controle de entrada.
- Distribua o volume restante da cromatina digerido em 48 alíquotas µ l, em uma nova placa de 96 poços. Célula da pelota/modelo 1 entra em poços A01-A06, célula da pelota/modelo 2 entra em poços A07-A12, etc. Grave os poços para uma chave do modelo. Rotule a placa "Pre-esclarecimento".
- Usando uma pipeta multicanal, adicione 120 µ l de tampão de IP 1x + 1 x PIC e 12 µ l de grânulos magnéticos lavados de proteína A (ou G) em cada poço da placa de Pre-esclarecimento da etapa 2.3.3. Misture cada linha pipetando acima e para baixo 10 vezes. Trocar dicas entre linhas. A placa do selo muito bem com uma tampa da placa de alumínio e incubar em uma plataforma giratória em 4 ° C por um período mínimo de 2 h.
- Reação de imunoprecipitação
- Antes de iniciar esta etapa certifique-se que a Ab-grânulo complexo (etapa 2.1.10) e a Pre-esclarecimento chapa (etapa 2.3.4) tem incubados pelo menos 2 h. rápido girar ambas as placas por centrifugação de 10 s a 200 x g.
- Coloque a placa de complexo de Ab-grânulo (da etapa 2.1.10) sobre um íman em forma de placa e esperar 15 s para a solução tornar-se clara. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante com uma pipeta sem perturbar os grânulos. Remover a placa de ímã a placa e mantê-lo no gelo.
- Coloque a placa de reação de Pre-esclarecimento (da etapa 2.3.4) sobre um íman em forma de placa e esperar 15 s para os grânulos separar e para a solução tornar-se clara. Sem perturbar os grânulos, transferi cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta para os poços correspondentes de Ab-esfera complexa placa mantida em gelo e misture suavemente 15 vezes por pipetagem para cima e para baixo. Selo, a placa de alumínio com tampa da placa e incubar durante a noite (12-18 h) a 4 ° C em uma plataforma giratória. Novo rótulo da placa "Reação de IP".
3. dia 2: ndCHIP-seq
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Lavagens e eluição
- Definir o misturador de aquecimento a 65 ° C. No gelo, prepare um tampão de lavagem de baixo teor de sal e o tampão de lavagem de elevado-sal. Rápido girar a placa de reação de IP da etapa 2.4.3 para 10 s a 200 x g.
- Coloque a placa de reação de IP sobre um íman em forma de placa e esperar 15 s para a solução tornar-se clara. Usando uma pipeta multicanal, sem perturbar os grânulos, cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. Pegue a placa de ímã a placa e colocá-lo no gelo.
- Para cada linha de amostras da placa de reação de IP, adicione 150 µ l de sal gelada lavar buffer e misture lentamente 10 vezes para cima e para baixo completamente Resuspenda os grânulos.
- Coloque a placa de reação de IP sobre o íman em forma de placa, esperar os grânulos separar e usando uma pipeta multicanal, sem perturbar os grânulos remover e descartar o sobrenadante. Coloque a placa de volta no gelo e repita as etapas 3.1.3 e 3.1.4 para um total de 2 lavagens.
- No gelo, para cada linha de amostras da placa de reação de IP, adicione 150 µ l de sal alto lavar buffer e misture lentamente 10 vezes pipetando para cima e para baixo completamente Resuspenda os grânulos.
- Coloque a placa de reação de IP sobre o íman em forma de placa, esperar os grânulos separar e usando uma pipeta multicanal, sem perturbar os grânulos remover e descartar o sobrenadante. Coloque a placa de reação de IP no gelo e pre-frio uma nova placa de 96 poços ao lado.
- Para cada linha de amostras da placa de reação de IP, adicione 150 µ l de sal alto lavar buffer e misture lentamente 10 vezes pipetando para cima e para baixo completamente Resuspenda os grânulos. Após ressuspensão, transferi cada linha das amostras para a linha correspondente da placa de novo, pre-refrigerada, 96 poços. Rotule a placa "Reação de IP". Descarte a placa velha.
- Coloque a placa de reação de IP nova sobre o ímã de placa e esperar que os grânulos separar. Usando uma pipeta multicanal, sem perturbar os grânulos, cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. Manter a placa na temperatura de quarto.
- Para cada linha de amostras da placa de reação de IP, adicionar 30 µ l de tampão de eluição do ChIP (EB) e misture lentamente 10 vezes pipetando para cima e para baixo. Certifique-se de evitar a formação de bolhas.
- Selar a placa bem com uma tampa PCR e incubá-los em um misturador de aquecimento a 65 ° C por 1,5 h com uma velocidade de mistura de 1.350 rpm.
- Após a incubação de 1,5 h, spin para baixo a placa de reação de IP a 200 x g por 1 min a 4 ° C. Altere a configuração do mixer de aquecimento para 50 ° C.
- Após a rodada, coloque a placa de reação de IP sobre um íman em forma de placa e esperar que a solução para limpar. Usando uma pipeta multicanal, sem perturbar os grânulos, transferi com cuidado 30 µ l do sobrenadante para uma nova placa de 96 poços. Use dicas frescas para cada linha. Rotular a placa "Reação de IP" e mantê-lo em temperatura ambiente.
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Digestão de proteínas
- Recuperar 30% PEG/1 M NaCl solução de17 (tabela de composição de tampão) magnética do grânulo do frigorífico a 4 ° C e mantê-lo em temperatura ambiente pelo menos 30 min. crítica: garantir que a solução do grânulo totalmente atinja a temperatura ambiente antes de prosseguir.
- Recupere amostras de controlo de entrada de armazenamento de 4 ° C (etapa 2.3.2) e volta rápida. Medir o volume usando uma pipeta e adicionar água ultrapura para cada controle de entrada para um volume final de 30 µ l. transferir as amostras de controle de entrada para os pré-selecionados entrados poços (poços vazios) da placa de reação (etapa 3.1.12) de IP. O poço para o exemplo de chave de registro.
- No gelo, prepare a proteína digestão Master Mix, conforme mostrado na tabela 5 e alíquota igual volume em uma linha de uma placa de 96 poços reservatório.
- Usando uma pipeta multicanal, a cada linha de amostras da placa de reação de IP, adicionar 40 µ l do Master de digestão de proteínas Mix e misture lentamente 10 vezes acima e para baixo. Selar a placa bem com uma tampa PCR, spin para baixo a 200 x g por 1 min e incubar em um misturador de aquecimento a 50 ° C por 30 min, defina a 650 rpm. Enquanto a placa está incubando, preparar fresco 70% de etanol (EtOH) e mantê-lo em temperatura ambiente.
- Após a incubação 30 min é completa, girar a placa de reação de IP a 200 x g por 1 min, 4 ° C. Manter a placa na temperatura de quarto.
Nota: O volume total deve ser agora ~ 70 µ l/poço.
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Grânulo de limpar usando solução de esferas magnéticas de PEG/1 M NaCl 30%
- Alíquota a temperatura 30% de PEG/1 M NaCl magnética do grânulo solução em uma linha de uma placa de 96 poços limpo reservatório (75 µ l por amostra x n º de linhas).
- Trabalhando em temperatura ambiente, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 70 µ l (proporção de 1:1) da solução magnética do grânulo PEG/1 M NaCl 30% para cada linha de amostras da placa de reação de IP e misture 10 vezes pipetando para cima e para baixo. Trocar dicas entre linhas. Incube a placa durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Colocar a placa sobre o ímã de placa e incubar durante 5 min permitir que os grânulos separar.
- Utilizando uma pipeta, sem perturbar os grânulos, cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. Manter as contas.
- Enquanto a placa de reação de IP é ainda sobre o ímã de placa, usando uma pipeta multicanal, a cada linha de amostras, adicionar 150 µ l de temperatura 70% EtOH e incube por 30 s. Após 30 s, com uma pipeta multicanal, remover e descartar o sobrenadante. Repita essa etapa mais uma vez, para um total de 2 lavagens.
- Após a segunda lavagem de EtOH, incube a placa 'seca' sobre o ímã da placa por 3 min. Inspecione visualmente a placa para certificar-se de que todos o EtOH é evaporado. Se não, incubar a placa por 1 min. ressecamento dos resultados de grânulos em um rendimento mais baixo.
- Pegue a placa de ímã a placa e com uma pipeta multicanal, adicione 35 µ l EB (Tabela de materiais). Misture bem pipetando acima e para baixo 10 vezes. Trocar dicas entre linhas. Incube a temperatura ambiente por 3 min eluir.
- Após a incubação, colocar a placa de reação de IP sobre o íman em forma de placa e incubar por 2 min. Devem separar as contas e a solução se tornará clara.
- Usando uma pipeta multicanal, sem perturbar os grânulos, transferi com cuidado o sobrenadante para os poços correspondentes de uma nova placa de 96 poços.
- A placa com uma tampa da placa de alumínio do selo, etiqueta "IPed + entrada de DNA" e armazenar a 4 ° C durante a noite, ou a-20 ° C para longo prazo (> 48 h) armazenamento.
4. dia 3: Construção de biblioteca
- Fosforilação e reparação final
- A entrada para a reação final reparação/fosforilação é o IPed + entrada placa da etapa 3.3.10. Após o descongelamento, girar a placa para baixo a 200 x g por 1 min a 4 ° C e mantê-lo no gelo.
- Recupere-se do congelador-20 ° C todos os reagentes (exceto enzimas) necessário para a reação final reparação/fosforilação (tabela 6) e descongelação-los à temperatura ambiente, em seguida, transferir imediatamente para o gelo.
- Trabalhando no gelo, siga a tabela 6 para configurar o mestre de reparação/fosforilação final Mix em um tubo estéril, de microcentrifuga de 1,5 mL. Após a adição de todos os componentes não-enzimática, misture bem por pulso-utilização do Vortex e coloque o tubo de volta no gelo.
- Recupere as enzimas relevantes de seu armazenamento frio e transporte para o banco em um rack de cool tubo refrigerados. Misture cada enzima por agredir o tubo, girar rápido e coloque-o no refrigerados suporte legal. Quando Pipetar a enzima, Aspire lentamente para garantir uma transferência de volume exato. Após a adição, lave a ponta no mix mestre pipetando para cima e para baixo.
- Uma vez que as enzimas são adicionadas, suavemente, pulso-vórtice o mestre misturar 5 vezes para assegurar uma distribuição uniforme de todos os componentes, em seguida, volta rápida e imediatamente coloque o tubo de volta no gelo.
- No gelo, alíquota um volume adequado da mistura final reparação/fosforilação mestre em uma linha de uma nova placa de 96 poços reservatório; volume a ser aliquotadas: (15 µ l x n º de linhas) + 5 µ l volume morto. Um cálculo de exemplo para duas linhas: (15 µ l x 2) + 5 µ l = 35 µ l/poço.
- Usando uma pipeta multicanal, adicionar 15 µ l da mistura final reparação/fosforilação mestre para cada linha de amostras e misture 10 vezes pipetando para cima e para baixo. Trocar dicas entre linhas. A placa com uma tampa plástica do selo, spin para baixo a 200 x g por 1 min a 4 ° C e incubar a temperatura ambiente por 30 min.
- Grânulo limpar após reparação final e fosforilação
- Na geladeira de 4 ° C, recuperar a solução de magnética do grânulo de PEG/1 M NaCl 20% e 30% solução de PEG/1 M NaCl e incubar a temperatura ambiente pelo menos 30 min.
Nota: A solução de PEG/1 M NaCl 30% que não contêm grânulos magnéticos. - Depois de ambas as soluções atingirem a temperatura, para cada amostra prepare 80 µ l de mistura 1:2, de 30% de PEG/1 M NaCl e soluções de magnética do grânulo de PEG/1 M NaCl 20%. Um exemplo para 24 amostras: 80 µ l x 24 = 1.920 µ l (640 µ l de 30% PEG/1 M NaCl e 1.288 µ l das soluções de esferas magnéticas de PEG/1 M NaCl 20%).
- Alíquota da solução do grânulo misturar, volume igual, em uma linha de uma placa de 96 poços reservatório e mantê-lo em temperatura ambiente. Alíquota tampão EB (40 µ l por amostra x n º de linhas) em uma linha de uma placa de 96 poços limpo reservatório. Um exemplo para duas linhas: 40 µ l x 2 = 80 µ l/poço.
- Usando uma pipeta multicanal, adicione 75 µ l da mistura do grânulo preparada no passo 4.2.2 para cada linha de amostras da etapa 4.1.7 e misturar acima e para baixo 10 vezes. Trocar dicas entre linhas. Incube a temperatura ambiente por 15 min. Continue com o procedimento de limpeza do grânulo, conforme descrito em etapas 3.3.3-3.3.10. Cubra o prato com um selo plástico, volta rápida e colocá-lo no gelo. Siga para o passo 4.3.
- Na geladeira de 4 ° C, recuperar a solução de magnética do grânulo de PEG/1 M NaCl 20% e 30% solução de PEG/1 M NaCl e incubar a temperatura ambiente pelo menos 30 min.
- Rejeito-A reação
- Recuperar do congelador-20 ° C todos os reagentes (exceto enzimas) necessário para a reação de A-Tailing (tabela 7), descongelá-los à temperatura ambiente, em seguida, transferir imediatamente para o gelo.
- Trabalhando no gelo, siga a tabela 7 para configurar o A-Tailing Master Mix em um tubo estéril, de microcentrifuga de 1,5 mL. Siga as instruções de instalação de fermentação enzimática geral conforme descrito em etapas 4.1.4-4.1.6.
- Usando uma pipeta multicanal, adicionar 15 µ l do Mix Master A-Tailing para cada linha de amostras e misture 10 vezes pipetando para cima e para baixo. Trocar dicas entre linhas. A placa com uma tampa PCR do selo, spin para baixo a 200 x g por 1 min a 4 ° C e incubar em um thermocycler a 37 ° C por 30 min. Após a incubação, girar a placa para baixo a 200 x g por 1 min e mantê-lo em temperatura ambiente.
- Grânulo limpar após A-Tailing
- Execute as etapas descritas na etapa 4.2. Cubra o prato com um selo plástico, volta rápida do rótulo "-cauda + BC," e colocá-lo no gelo. Prossiga para a etapa 4.5.
- Ligadura de adaptador
- Recuperar do congelador-20 ° C todos os reagentes (exceto enzimas) necessário para a reação de ligadura do adaptador (tabela 8), descongelá-los à temperatura ambiente, em seguida, transferir imediatamente para o gelo.
- Recuperar a 10 µM PE adaptador (quadro suplementar 1) solução e diluir a 0,5 µM usando EB. Misture bem por num Vortex de pulso. O volume exigido é de 3 µ l x n º de amostras. Trabalhando no gelo, alíquota do adaptador de 0,5 µM PE, volume igual, em 12 poços de uma placa de 96 poços limpo reservatório. Mantê-lo no gelo.
- Trabalhando no gelo, siga a tabela 8 para configurar o adaptador da ligadura Master Mix em um tubo estéril, de microcentrifuga de 1,5 mL. Siga as instruções de instalação de fermentação enzimática geral conforme descrito em etapas 4.1.4-4.1.6. Certifique-se que o 5 X rápida da ligadura Buffer é totalmente descongelado e muito bem misturado antes do uso.
- No gelo, alíquota um volume adequado do adaptador da ligadura Master Mix em uma linha de uma nova placa de 96 poços reservatório. Por exemplo, o cálculo para duas linhas: (23 µ l x 2) + 5 µ l = 51 µ l/poço. Manter a placa no gelo.
- Usando uma pipeta multicanal, adicionar 2 µ l a 0,5 µm adaptador emparelhado final (PE) em cada linha de amostras da etapa 4.4.1 e mistura. Trocar dicas entre linhas.
- Usando uma pipeta multicanal, adicionar 23 µ l do Mix adaptador ligadura mestre para cada linha de amostras e misturar 15 vezes pipetando para cima e para baixo. Trocar dicas entre linhas. Selar a placa com uma tampa de metal, rótulo "Ligadura", spin-down a 200 x g por 1 min a 4 ° C e incubar à temperatura ambiente durante a noite.
- Dia 4: Grânulo limpar #1 após ligadura do adaptador
- Na geladeira de 4 ° C, recuperar a solução de esferas magnéticas de PEG/1 M NaCl 20% e incubar a temperatura ambiente pelo menos 30 min. Enquanto a solução é desenroscada preparar fresco 70% EtOH.
- Alíquota da solução de magnética do grânulo de PEG/1 M NaCl 20%, 55 µ l, por exemplo, em uma linha de um reservatório de 96 poços da placa e mantê-lo em temperatura ambiente. Um exemplo para duas linhas: 55 µ l x 2 = 110 µ l/poço.
- Alíquota tampão EB, 50 µ l, por exemplo, em uma linha de uma placa de 96 poços limpo reservatório. Um exemplo para duas linhas: 50 µ l x 2 = 100 µ l/poço.
- Usando uma pipeta multicanal, adicionar 48 µ l da solução de esferas magnéticas de PEG/1 M NaCl 20% em cada linha das amostras da placa da ligadura da etapa 4.5.6 e misturar acima e para baixo 10 vezes. Trocar dicas entre linhas. Incube a temperatura ambiente por 15 min. Continue com o procedimento de limpeza do grânulo, conforme descrito em etapas 3.3.3-3.3.7.
- Pegue a placa de ímã a placa e com uma pipeta multicanal, adicione µ l 45 EB (Tabela de materiais). Misture bem pipetando acima e para baixo 10 vezes. Trocar dicas entre linhas. Incube durante a temperatura ambiente por 3 min eluir.
- Após a incubação, coloque o prato de reação de IP sobre o íman em forma de placa e incubar por 2 min. com uma pipeta multicanal, sem perturbar os grânulos, transferir com cuidado o sobrenadante para os poços correspondentes de uma nova placa de 96 poços. Rotule a placa "Ligadura + 1 A.C.".
- A cada poço Adicione 5 µ l de tampão de alta fidelidade 10 x PCR e misture bem pipetando para cima e para baixo. Trocar dicas entre linhas. Cubra o prato com um selo plástico, volta rápida e mantê-lo em temperatura ambiente.
- Grânulo limpar #2 após ligadura do adaptador
- Executar limpeza do grânulo, conforme descrito na seção 4.6, com as seguintes alterações: Adicionar 60 µ l de solução de magnética do grânulo de PEG/1 M NaCl 20% a cada poço ativo na ligadura + placa de 13:00 (etapa 4.6.7) e eluir de grânulos usando 35 µ l de tampão EB. Rotular a placa "Ligadura + 2 A.C." e mantê-lo no gelo.
- Amplificação por PCR
- Recuperar do congelador a-20 ° C todos os reagentes (exceto enzimas) necessários para a reação de PCR (tabela 9), descongelá-los à temperatura ambiente, em seguida, imediatamente, coloque-os em gelo.
- Trabalhando no gelo, siga a tabela 9 para configurar o PCR Master Mix em um tubo estéril, de microcentrifuga de 1,5 mL. Siga as instruções de instalação de fermentação geral conforme descrito em etapas 4.1.4-4.1.5. No gelo, um volume adequado do PCR Master Mix em uma linha de uma nova placa de 96 poços reservatório de alíquota. Mantê-lo no gelo. Consulte a etapa 4.5.4 para cálculos de amostra.
- Trabalhando no gelo, usando uma pipeta multicanal, adicionar 2 µ l de cada único 12,5 µM PCR reverso de indexação da primeira demão (Supplemental tabela 2) em cada poço na ligadura + placa 2 A.C. (etapa 4.7.1) e misture lentamente acima e para baixo. Trocar dicas entre linhas. Manter a placa no gelo.
- Trabalho no gelo, usando uma pipeta multicanal, adicionar 23 µ l do mix mestre PCR em cada linha de amostras da etapa 4.8.3 e mistura 10 vezes pipetando para cima e para baixo. A placa com uma tampa PCR do selo, girá-lo para baixo a 200 x g por 1 min e incubar em um thermocycler (ver tabela 10 para ciclismo condições do PCR).
- Grânulo limpar após amplificação por PCR
- Após a amplificação por PCR girar a placa a 200 x g por 1 min, 4 ° C. Executar o grânulo limpeza conforme descrito na seção 4.6, com as seguintes alterações: Adicionar 51 µ l de solução de magnética do grânulo de PEG/1 M NaCl 20% para cada reação de PCR e eluir de grânulos usando 25 µ l de tampão EB. A placa com uma tampa de alumínio do selo e spin para baixo a 200 x g por 1 min. loja as amostras a-20 ° C.
- Para validar construídas bibliotecas, realizar a quantificação de DNA usando um ensaio baseado em fluorescência, Visualizar o produto final usando um analisador de chip baseada em eletroforese capilar (teste de alta sensibilidade) e executar o enriquecimento PCR quantitativo (qPCR) (ver Resultados de representante, validação de qualidade de biblioteca ndChIP-seq por qPCR).
Representative Results
Perfis de digestão da cromatina
Otimização da digestão MNase é essencial para o sucesso do presente protocolo. É crucial para gerar um perfil de digestão dominado por tamanhos de fragmento único nucleossoma, enquanto não over digerido, para permitir a recuperação de fragmentos de nucleossoma de ordem superiores. Um perfil ideal de digestão consiste de uma maioria de fragmentos nucleossoma único com uma pequena fração que representa fragmentos menores e maiores do que os nucleossomas único. A Figura 1 mostra exemplos de um tamanho ideal, excesso digerido e digerido sob perfis de distribuição. Observe que sub-ótimo digestão da cromatina também será evidente no perfil da biblioteca de sequenciamento, gerado a partir do material IP (Figura 2).
Validação da qualidade de biblioteca ndChIP-seq por qPCR
qPCR é um método bem estabelecido para avaliação da qualidade do ChIP18,19,20. Quando executando ndChIP-seq em 10.000 células o rendimento do ácido nucleico após IP será abaixo de 1 ng. Portanto, é essencial para executar qPCR após a construção da biblioteca para avaliar o enriquecimento relativo de regiões-alvo sobre o plano de fundo. Para fornecer uma estimativa do fundo, bibliotecas, construídas a partir da cromatina MNase digerido (entrada) são geradas. Para cada biblioteca IP, dois conjuntos de primers são necessários (ver suplementartabela 3 para obter uma lista dos primers para marcas de histona comumente usados). Um conjunto de primeira demão deve ser específico para uma região genômica consistentemente associado com a modificação do histone de interesse (alvo positivo) e uma outra região que não está marcada com a modificação do histone de interesse (alvo negativo). Como dobrar o enriquecimento com relação a entrada biblioteca será avaliada a qualidade da biblioteca de ChIP-seq. Enriquecimento de dobra pode ser calculado usando a seguinte equação que assume uma amplificação exponencial da região genômica alvo: 2Ctentrada-CtIP. Nosso costume feito pacote de software estatístico R, qcQpcr_v1.2, é adequado para análise de enriquecimento qPCR de baixa entradas bibliotecas nativas de ChIP-seq (Arquivos de código suplementar). A Figura 3 representa um resultado de qPCR para bibliotecas de ChIP-seq bem-sucedidas e malsucedidas. O valor de enriquecimento mínimo esperado dobra para bibliotecas de ndChIP-seq de boa qualidade são 16 por Marcos estreitos, tais como H3K4me3 e 7 para grandes marcas, por exemplo, H3K27me3.
Modelagem MNase acessibilidade
Análise computacional de ChIP-seq é complexo e único para cada configuração experimental. Um conjunto de diretrizes estabelecidas pela International Consortium de Epigenomic humano (IHEC) e o livre de DNA elementos (ENCODE) pode ser usado para avaliar a qualidade do ChIP-seq bibliotecas21. É importante observar que a profundidade de sequenciamento de bibliotecas impacta a detecção e resolução de regiões enriquecido20. O número de picos detectados aumento e aproxima-se um platô com o aumento da profundidade de leitura. Nós recomendamos ndChIP-seq bibliotecas a ser sequenciado em conformidade com as recomendações do IHEC de 50 milhões emparelhado-leituras (fragmentos de 25 milhões) para estreitas marcas (por exemplo, H3K4me3) e 100 milhões emparelhado-leituras (fragmentos de 50 milhões) para grandes marcas ( por exemplo,, H3K27me3) e22de entrada. Estas profundidades de sequenciamento fornecem suficiente alinhamentos de sequência para a deteção dos picos mais significativos usando amplamente usado ChIP-seq chamadores de pico, como MACS2 e Homero, sem atingir a saturação23,24. Uma biblioteca de mamíferos ndChIP-seq de alta qualidade tem uma taxa de PCR duplicada de < referência e 10% taxa de alinhamento do genoma de > 90% (incluindo leituras duplicadas). Bibliotecas de sucesso ndChIP-seq irão conter repetições altamente correlacionadas com uma parcela significativa (> 40%) dos picos de leituras alinhadas dentro MACS222 identificadas enriquecidos e inspeção de leituras alinhadas em um navegador de genoma deve revelar visualmente detectáveis avanços em relação à biblioteca de entrada (Figura 4). Além disso, ndChIP-seq pode ser utilizada para avaliar a densidade nucleossoma, utilizando um algoritmo de distribuição gaussiana mistura (w1 * n(x; Μ 1,σ1) + w2 * n(x; μ2, σ2) = 1) na MACS2 identificada regiões enriquecidas à densidade do nucleossoma modelo conforme definido por limites acessíveis MNase. Neste modelo, w1 representa a distribuição de mono-nucleossoma peso e w2 representa o peso de distribuição di-nucleossoma. Onde w1 é maior do que w2, há predominância de fragmentos de mono-nucleossoma e vice-versa. Esta análise requer que bibliotecas ser sequenciados de forma emparelhado-fim para que o fragmento tamanhos podem ser definidos. Para aplicar o algoritmo de distribuição gaussiana mistura, regiões enriquecidas estatisticamente significantes primeiro são identificadas. Sugerimos a vocação do pico, com MACS2, usando a entrada como um controle e com as configurações padrão para marcas estreitas e um limite de valor q de 0,01 para grandes marcas. Um número de pacotes estatísticos, empregando um algoritmo de distribuição gaussiana mistura está disponível a partir de pacotes de software estatísticos amplamente utilizado. Utilizando o tamanho médio do fragmento, determinado por limites de leitura emparelhada-fim das amostras IPed, distribuições no MACS2 identificaram promotores enriquecidos, e um algoritmo de distribuição gaussiana de mistura pode ser aplicado a cada promotor usando o pacote R-estatística Mclust versão 3.025 para calcular uma distribuição ponderada. Nesta aplicação, recomendamos eliminar promotores contendo menos de 30 fragmentos alinhados porque abaixo deste limiar, o peso resultante estimativas tornar-se confiável. Uma biblioteca de ndChIP-seq de boa qualidade gera uma distribuição gaussiana mistura que consistem em dois componentes principais com valores médios correspondentes a mono-, comprimentos de fragmento de di-nucleossoma.
Figura 1 : Avaliação da digestão MNase antes geração biblioteca. Perfis de analisador chip baseada em eletroforese capilar de um ideal MNase digerido (A), sob-digerido (B) e digerido over (C) da cromatina. Réplicas biológicas são mostradas como traços de azuis, vermelhos e verdes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Avaliação da digestão MNase após a geração de biblioteca. (A) postar perfis de construção de biblioteca de entrada otimamente digerida (réplicas biológicas; vermelho, verde, preto) e IP (réplicas biológicas; ciano, roxo, azul) e (B) entrada sub-ótimo (réplicas biológicas; vermelho, verde, azul) e IP ( réplicas biológicas; bibliotecas de ciano, roxas, laranja). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Pós construção biblioteca PCR quantitativo pode ser usado para avaliar a qualidade das bibliotecas ndChIP-seq. Enriquecimento de dobra das bibliotecas H3K4me3 IP com respeito a bibliotecas de entrada é calculado como 2(Ct de entrada - Ct de IP) para alvos positivos e negativos, usando qcQpcr_v1.2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : NdChIP-seq representante biblioteca construída a partir de 10.000 primárias CD34+ cabo glóbulos. Correlação de Pearson do sinal de H3K4me3 (leituras por milhão leituras mapeadas) calculado em promotores (TSS + /-2Kb) entre 3 réplicas biológicas, replicar (A) 1 e 2, (B) replicar 1 e 3, replicar (C) 2 e 3. (D) UCSC exibição de navegador do cluster do gene HOXA de reticulado ChIP-seq gerados a partir de 1 milhão de células por IP, ndChIP-seq bem sucedida de 10.000 células por IP e ndChIP-seq malsucedido de 10.000 células por IP. (vermelho: H3K27me3, verde: H3K4me3 e preto: entrada). (E) fração de leituras mapeadas dentro MACS2 identificadas regiões enriquecidas de H3K4me3 (preto) e H3K27me3 (cinza). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Composição do tampão |
| A. 1. amortecedor da imunoprecipitação (IP) |
| pH de 20 mM Tris-HCl 7.5 |
| 2 mM EDTA |
| 150 mM NaCl |
| 0,1% Triton X-100 |
| 0,1% Deoxycholate do |
| Butirato de sódio de 10 mM |
| A. 2. Low sal tampão de lavagem |
| pH de 20 mM Tris-HCl 8.0 |
| 2 mM EDTA |
| 150 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,1% SDS |
| A. 3. o tampão de lavagem de sal elevado |
| pH de 20 mM Tris-HCl 8.0 |
| 2 mM EDTA |
| 500 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,1% SDS |
| Tampão de eluição do ChIP a. 4. |
| 100 mM NaHCO3 |
| 1% SDS |
| A. 5. 1 x tampão de Lise – 1 mL |
| 0,1% Triton |
| 0,1% Deoxycholate do |
| Butirato de sódio de 10 mM |
| Tampão de diluição de Ab 6. |
| 0,05% (p/v) de azida |
| 0,05% amplo espectro antimicrobiano (por exemplo, ProClin 300) |
| em PBS |
| A. 7. 30% PEG / 1M NaCl solução magnética do grânulo (referência16) |
| PEG-30% |
| 1 M NaCl |
| 10 mM Tris HCl pH 7.5 |
| 1 mM EDTA |
| 1 mL de lavado super paramagnéticos grânulos |
| 8. 20% PEG / 1M NaCl solução magnética do grânulo (referência16) |
| PEG-30% |
| 1 M NaCl |
| 10 mM Tris HCl pH 7.5 |
| 1 mM EDTA |
| 1 mL de lavado super paramagnéticos grânulos |
Tabela 1: composição de tampão de ndChIP-seq.
| Modificação de histona | Concentração (µ g / µ l) |
| H3K4me3 | 0,125 |
| H3K4me1 | 0.25 |
| H3K27me3 | 0,125 |
| H3K9me3 | 0,125 |
| H3K36me3 | 0,125 |
| H3K27ac | 0,125 |
Tabela 2: Quantidade de anticorpo necessária para ndChIP-Seq
| Reganet | Volume (µ l) |
| Água ultra pura | 478 |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | 10 |
| 0.5 EDTA DE M | 10 |
| NaCl 5 M | 2 |
| Glicerol | 500 |
| Volume total | 1.000 |
Tabela 3: Receita de tampão de diluição de MNase.
| Reagente | Volume (µ l) |
| Água ultra pura | 13 |
| 20 mM DTT | 1 |
| 10x Buffer MNase | 4 |
| 20 Mnase U / µ l | 2 |
| Volume total | 20 |
Tabela 4: Receita para MNase Master Mix.
| Reagente | Volume (µ l) |
| Tampão de eluição | 30 |
| Tampão G2 | 8 |
| Protease | 2 |
| Volume total | 40 |
Tabela 5: Receita para mistura de mestre de purificação de DNA.
| Reagente | Volume (µ l) |
| Água ultra pura | 3.3 |
| 10x Buffer Endonuclease de restrição (por exemplo, NEBuffer) | 5 |
| ATP de 25 mM | 2 |
| dNTPs 10 mM | 2 |
| T4 Quinase de polinucleotido (10 U / µ l) | 1 |
| T4 DNA polimerase (3 U / µ l) | 1.5 |
| DNA polimerase I, o grande (Klenow) fragmento (5 U / µ l) | 0.2 |
| Volume total | 15 |
Tabela 6: Receita para mestre de reparação final Mix.
| Reagente | Volume (µ l) |
| Água ultra pura | 8 |
| 10x Buffer Endonuclease de restrição (por exemplo, NEBuffer) | 5 |
| 10 mM dATP | 1 |
| Klenow (3' - 5' exo-) | 1 |
| Volume total | 15 |
Tabela 7: Receita para A-Tailing Master Mix.
| Reagente | Volume (µ l) |
| Água ultra pura | 4.3 |
| 5 x tampão de ligação rápida | 12 |
| T4 DNA ligase (2000 U / µ l) | 6.7 |
| Volume total | 23 |
Tabela 8: Receita para adaptador ligadura Master Mix.
| Reagente | Volume (µ l) |
| Água ultra pura | 7 |
| 25 hum primer PCR 1.0 | 2 |
| 5 x tampão HF | 12 |
| DMSO | 1.5 |
| DNA polimerase | 0,5 |
| Volume total | 23 |
Tabela 9: Receita para PCR Master Mix.
| Temprature (° C) | Duração (s) | Número de ciclos |
| 98 | 60 | 1 |
| 98 | 30 | |
| 65 | 15 | 10 |
| 72 | 15 | |
| 72 | 300 | 1 |
| 4 | Segure | Segure |
Quadro 10: PCR executar método.
| Oligo | Sequência de | Modificação |
| PE_adapter 1 | 5'-5Phos/GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG -3 ' | 5' modificação: fosforilação |
| PE_adapter 2 | 5' - ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC * T - 3' | 3' modificação: * T é um laço phosphorothioate |
Suplementar tabela 1: Oligo sequências para geração de adaptador de PE.
| Nome da primeira demão | Sequência de | Índice | IndexRevC (a ser usado para sequenciamento) | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CGTGAT | atcacg | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CTGATC | gatcag | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGGGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GGGGTT | aacccc | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CTGGGT | acccag | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AGCGCT | agcgct | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CTTTTG | caaaag | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 7 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | TGTTGG | ccaaca | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 8 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AGCTAG | ctagct | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 9 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AGCATC | gatgct | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 10 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CGATTA | taatcg | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 11 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATTCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CATTCA | tgaatg | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 12 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GGAACT | agttcc | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 13 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | ACATCG | cgatgt | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 14 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AAGCTA | tagctt | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 15 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAAGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CAAGTT | aacttg | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 16 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GCCGGT | accggc | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 17 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGCCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CGGCCT | aggccg | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 18 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | TAGTTG | caacta | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 19 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GCGTGG | ccacgc | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 20 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTATAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GTATAG | ctatac | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 21 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTTGCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CCTTGC | gcaagg | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 22 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTGTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GCTGTA | tacagc | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 23 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGGCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | ATGGCA | tgccat | |||||||
| Cartilha de indexação reversa de PCR 24 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | TGACAT | atgtca | |||||||
Suplementar tabela 2: PCR reversa indexação sequências da primeira demão.
| Primeiras demão | Sequência de | |
| ZNF333_genic_H3K9me3_F | 5'-AGCCTTCAATCAGCCATCATCCCT-3' | |
| ZNF333_genic_H3K9me3_R | 5'-TCTGGTATGGGTTCGCAGATGTGT-3' | |
| HOXA9-10_F | 5'-ACTGAAGTAATGAAGGCAGTGTCGT-3' | |
| HOXA9-10_R | 5'-GCAGCAYCAGAACTGGTCGGTG-3' | |
| GAPDH_genic_H3K36me3_F | 5'-AGGCAACTAGGATGGTGTGG-3' | |
| GAPDH_genic_H3K36me3_R | 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3' | |
| GAPDH-F | 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3' | |
| GAPDH-R | 5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3' | |
| Modificação de histona | Alvo positivo | Alvo negativo |
| H3K4me3 | GAPDH | HOXA9-10 |
| H3K4me1 | GAPDH_genic | ZNF333 |
| H3K27me3 | HOXA9-10 | ZNF333 |
| H3K27ac | GAPDH | ZNF333 |
| H3K9me3 | ZNF333 | HOXA9-10 |
| H3K36me3 | GAPDH_genic | ZNF333 |
Suplementar tabela 3: Uma lista de primers para marcas de histona comumente utilizados (H3K4me3, H3K4me1, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3 e H3K36me3).
Arquivo suplementar 1: planilha de ndChIP-seq. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivos de código suplementar: qcQpcr_v1.2. Pacote de software estatístico R para análise de enriquecimento qPCR de baixas bibliotecas nativas entradas de ChIP-seq. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Dada a natureza combinatória de modificação da cromatina e nucleossoma posicionamento no Regulamento transcriptional, um método que permite medições simultâneas desses recursos é susceptível de fornecer novos insights sobre regulamento epigenético. O ndChIP-seq apresentado aqui é um protocolo de ChIP-seq nativo otimizado para habilitar o interrogatório simultâneo das modificações de histona e densidade nucleossoma em raras células primárias9,10. ndChIP-seq utiliza digestão enzimática da cromatina que, quando acoplado ao sequenciamento maciçamente paralelo emparelhado-final e um modelo de distribuição gaussiana mistura, permite para as modificações do histone de investigação a nível único nucleossoma e o deconvolução de perfis epigenomic impulsionada pela heterogeneidade dentro de uma população. Usando este protocolo, anteriormente informamos uma única distribuição de tamanhos de fragmento imuno-precipitado, determinado pelo emparelhado-fim ler limites, associados com Estados de cromatina específico definidos pelo ChromHMM10,24.
A qualidade de uma biblioteca ndChIP-seq depende de vários fatores, tais como a especificidade do anticorpo e sensibilidade, condições ideais de digestão de MNase e qualidade da cromatina. A especificidade dos anticorpos usados é crucial na produção de biblioteca ndChIP-seq bem sucedida. Um anticorpo ideal mostra afinidade elevada contra o epítopo de interesse com pouca reactividade cruzada com os outros resumos. É igualmente importante escolher grânulos magnéticos com a mais alta afinidade para o anticorpo de escolha.
MNase digestão é uma reação crítica e tempo de concentração-sensível - e neste protocolo. Portanto, ao processar várias amostras, é importante que cada reação é incubada por uma quantidade equivalente de tempo (Veja o passo 2.2). A qualidade da cromatina é outro fator que afeta significativamente o resultado da ndChIP-Seq fragmentado cromatina leva um perfil de digestão MNase sub-ótimo e resultados nas bibliotecas com um baixo sinal à relação de ruído. Amostras primárias com baixa viabilidade celular ou degradados da cromatina, tais como tecido de (FFPE) parafina fixada em formol não são recomendados para este protocolo.
A adição de um PIC durante a extração de cromatina reduz indesejada (ou seja, aleatórios) cromatina fragmentação e preserva integridade de caudas de histona. Como tal, precisa ter ser adicionado a Lise e amortecedor da imunoprecipitação antes de usar. Enquanto selecionando células através da citometria de fluxo, selecione para células viáveis e certifique-se de células são classificadas em uma baixa taxa de fluxo para aumentar a precisão da estimativa de número de célula e a viabilidade das células. Evite a classificação de células diretamente em Lise. O buffer de bainha diluirá a Lise e impede a efetiva permeabilização da membrana celular para MNase. Dependendo de um tipo de células ou organismo, titulação de MNase pode ser necessária para obter a melhor digestão.
ndChIP-seq em células de mamíferos requer uma profundidade mínima de sequenciamento de 50 milhões emparelhado-leituras (fragmentos de 25 milhões) para marcas estreitas e 100 milhões emparelhado-leituras (fragmentos de 50 milhões) para entrada e grandes marcas. O algoritmo de distribuição gaussiana mistura não executará otimamente em bibliotecas que têm sido sequenciadas a uma profundidade significativamente abaixo esta recomendação. ndChIP-seq não classificará os promotores com pouca separação entre o valor de distribuição ponderada para comprimentos de fragmento de mono - e di-nucleossoma em mono - ou di-nucleossoma dominado promotores. Portanto, esses promotores devem ser removidos na análise subsequente. Réplicas biológicas podem ser geradas para aumentar a confiança nas distribuições previstas e identificar a variabilidade técnica na construção MNase digestão e biblioteca.
Ao contrário de iterações anteriores dos protocolos de ChIP-seq nativos, ndChIP-seq fornece os meios para investigar o efeito combinatório de modificação de estrutura e histonas cromatina utilizando imunoprecipitação de post de tamanho de fragmento para integrar a densidade nucleossoma, determinado pela acessibilidade de MNase, com medidas de modificação de histona. Aplicação de ndChIP-seq de células primárias e tecidos fornecerá novos insights sobre a natureza Integrativa do Regulamento epigenética e permitir a identificação de assinaturas epigenéticas devido à heterogeneidade da população.
Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
A.L. foi apoiado por uma bolsa de estudos de pós-graduação canadense dos institutos canadenses de pesquisa em saúde. Este trabalho foi apoiado por concessões do genoma British Columbia e o canadense institutos de pesquisa em saúde (CIHR-120589) como parte da epigenética canadense, ambiente e iniciativa de consórcio de pesquisa de saúde e pelo programa de Instituto de pesquisa de Terry Fox Projeto Grant #TFF-122869 M.H. e Instituto de pesquisa do Terry Fox novo investigador prêmio (Grant # 1039) para M.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Tris-HCl –pH 7.5 | Thermo Scientific | 15567-027 | |
| 1M Tris-HCl –pH 8 | Thermo Scientific | 15568-025 | |
| 0.5M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 5M NaCl | Sigma | 1001385276 | |
| Triton X-100 | Sigma | 1001412354 | |
| Sodium-Deoxycholate | Sigma | 1001437582 | |
| SDS | Thermo Scientific | 15525-017 | |
| Sodium-Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| 100% EtOH | NA | NA | |
| V-bottom 96 well plate (AB 1400) | Thermo Scientific | AB-1400-L | |
| Gilson P2 pipetman | Mandel | F144801 | |
| Gilson P10 pipetman | Mandel | F144802 | |
| Gilson P20 pipetman | Mandel | F123600 | |
| Gilson P100 pipetman | Mandel | F123615 | |
| Gilson P200 pipetman | Mandel | F123601 | |
| Gilson P1000 pipetman | Mandel | F123603 | |
| Micrococcal Nuclease | NEB | M0247S | |
| Thermo Mixer C (Heating block mixer) | Eppendorf | 5382000023 | |
| Multi 12-channel Pippet P20 | Rainin | 17013803 | |
| Multi 12-channel Pippet P200 | Rainin | 17013805 | |
| 1.5 ml LoBind tube | Eppendorf | 22431021 | |
| 0.5 ml LoBind tube | Eppendorf | 22431005 | |
| Plastic Plate Cover | Edge Bio | 48461 | |
| PCR cover | Bio Rad | MSD-1001 | |
| Aluminum Plate Cover | Bio Rad | MSF-1001 | |
| Elution buffer (EB buffer) | Qiagen | 19086 | |
| 1M DTT | Sigma | 646563 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Eppendorf | 22625004 | |
| Ultrapure water | Thermo Scientific | 10977-015 | |
| Protein G dynabeads | Thermo Scientific | 10001D | |
| Protein A dynabeads | Thermo Scientific | 10001D | |
| Protease inhibitor Cocktail | Calbiochem | 539134 | |
| Rotating platform | Mandel | 1b109-12052010 | |
| Plate magnet | Alpaqua | 2523 | |
| Domed 12-cap strip | Bio Rad | TCS1201 | |
| Buffer G2 | Qiagen | 1014636 | |
| Protease | Qiagen | 19155 | |
| Tube Magnet (DynaMag-2) | Thermo Scientific | 12321D | |
| Tube Magnet (DynaMag-2) | LabCore | 730-006 | |
| V shape Plastic reservoir | Mandel | S0100A | |
| Vortex | Mandel | C1801 | |
| Mini Fuge | Mettler Toledo | XS2035 | |
| Analytical scale | Mandel | LB109-12052010 | |
| Quick Ligation Reaction Buffer, 5X | NEB | B6058S | |
| DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | M0210S | |
| Klenow Fragment (3'-5' exo) | NEB | M0212S | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Deoxynucleotide Solution mix, 10mM | NEB | N0447S | |
| dATP Solution 10mM | NEB | N0440S | |
| Quick T4 DNA Ligase | NEB | M0202T | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP), 25mM | NEB | P0756S | |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F549L | |
| NEBuffer 2 | NEB | B7002S | |
| Hank's buffered salt solution | Thermo Scientific | 14025076 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | A3160702 | |
| phosphate buffer saline | Thermo Scientific | 10010023 | |
| H3K4me3 | Cell Signaling | 9751S | |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410037 | |
| H3K27me3 | Diagenode | pAb-069-050 | |
| H3K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| H3K9me3 | Diagenode | C15410056 | |
| SeraMag super-paramagnetic beads |
References
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