Summary
선물이 nucleosome 밀도 칩 seq 분석 프레임 워크를 통합 하는 micrococcal nuclease (MNase) 접근에 대 한 적합 한 시퀀스 데이터 집합의 세대에 대 한 (칩 seq) 방법론을 시퀀싱 수정된 네이티브 chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 측량와.
Abstract
선물이 시퀀싱 (칩 seq) 실험 프로토콜 호환 가우스 혼합물 배급 기반 분석 방법론 (nucleosome 밀도 칩 seq; ndChIP-seq)의 생성을 가능 하 게 수정 된 네이티브 chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 게놈 넓은 micrococcal nuclease (MNase) 접근의 결합 된 측량. Nucleosome 위치 및 로컬 밀도, 그리고 그들의 히스톤 subunits posttranslational 수정 로컬 전송 상태를 조절 하는 콘서트에서 행동. NdChIP-seq에 의해 생성 된 히스톤 수정 nucleosome 접근의 조합 측정 이러한 기능의 동시 심문 수 있습니다. NdChIP-seq 방법론 1 차 셀 기반된 칩 seq 프로토콜 cross-linking에 액세스할 수의 작은 숫자에 적용 됩니다. 함께 찍은, ndChIP-seq 드문 1 차 셀 인구 내에서 RNA 전사 조절 공유 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻기 위해 로컬 nucleosome 밀도와 히스톤 수정 조합에서의 측정을 수 있습니다.
Introduction
진 핵 게놈 DNA1,2의 146의 기본적인 쌍에 의해 circumscribed 4 개의 히스톤 단백질 (예를 들어, H2A, H2B, H3, H4)의 두 개의 복사본으로 구성 하는 nucleosome 구조 반복을 통해 chromatin에 패키지 됩니다. Chromatin 개장 단지 유전자 발기인 경계 내 nucleosome 위치 제어 및 유전자 발현의 규칙에 참여 하는 전사 인자와 RNA 중 합 효소 기계3, DNA의 액세스 가능성을 변경 하 여 4.
nucleosome 내 히스톤의 아미노 맨끝 꼬리 acetylation, 메 틸 화, 인 산화, ubiquitylation, sumoylation, formylation, 및 특정 아미노산5 의 hydroxylation를 포함 하 여 다양 한 화학식 수정 대상이 되는 , 6 , 7 , 8. 위치 및 이러한 변경의 영향 전사7의 정품 인증을 허용 하는 분자 복합물의 염색 질 구조 및 제어 액세스 chromatin 상태 지시. 그 두 nucleosome 밀도 히스톤 수정 유전자 전사의 로컬 컨트롤에서 역할을 할 우리 네이티브 칩 접근 nucleosome 밀도 히스톤 수정9의 동시 측정을 가능 하 게 개발 10.
기본 칩 seq endonuclease micrococci nuclease 핵11,12, nucleosome13 위치를 지도에 활용 되는 속성 내에서 기본 상태에서 그대로 chromatin 소화 (MNase)의 활용 , 14 , 15. nucleosome 밀도 칩 seq (ndChIP-seq) 히스톤 수정10MNase 접근을 결합 하는 측정을 생성 하는 chromatin의 영역을 열려면 MNase의 특혜 접근의 속성 활용. ndChIP-seq는 히스톤 수정 드문 1 차 셀, 조직 및 배양된 세포에서의 프로 파일링 적합 합니다. 여기, 선물이 적합 조각 크기 게시물 immunoprecipitation, 쌍 간 경계, 읽기에 의해 결정을 통합 하는 앞에서 설명한 분석 프레임 작업10 시퀀스 데이터 집합 생성을 가능 하 게 상세한 프로토콜 동시에 히스톤 수정 측정 MNase 접근성 조사. 이전에, 10000 기본 인간 코드 혈액이 프로토콜의 응용 프로그램 파생 CD34+ 세포와 인간 배아 줄기 세포 염색 질 구조와 히스톤 수정이 내 간의 독특한 관계 셀 유형10 공개 . NdChIP-seq 단일 nucleosome 수준에서 세포 인구에서 epigenomic 기능을 공개 하 고 다른 유형의 서명으로 해결은 nucleosome 접근성 및 히스톤 수정 동시에 측정 하는 능력을 감안할 때, 그들의 구성 요소입니다. NdChIP-seq에 의해 다른 유형의 세포 인구의 탐험의 예는 어디 H3K4me3, 적극적인 마크와 H3K27me3, 억압 적인 마크는 현재10가 발기인의 조사입니다.
Protocol
참고:이 프로토콜에 대 한 최소 입력 단일 면역-강 수 (IP) 반응 당 10, 000 셀입니다. 제공 된 실험적인 워크시트 인쇄 및 실험을 계획 하는 지침으로 활용. 실 온에서 외피 ~ 22 ° c.에 것으로 간주 버퍼 조리법의 모든 표 1에 제공 됩니다. 버퍼의 모든 4 ° C에서 저장 한다 고 명시 되지 않는 한 절차 동안 얼음에 보관.
1. 세포 준비
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배양된 세포
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 1 mL로 세포 세척 하 고 정확 하 게는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 농도 결정. 1 백만 개 이상의 셀이, PBS의 볼륨을 증가.
- 살 균 1.5 mL 튜브, 4 ° c.에 6 분 x 500g에 다운 스핀으로 70000-100000 셀의 해당 셀 카운트, aliquot에 따라 피 펫을 사용 하 여, 천천히 제거 (셀 펠 렛을 방해) 하지 않고는 상쾌한 삭제 그리고 얼음 세포의 용 해 버퍼 + 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (PIC) 1000 세포의 농도를 x 1에서 펠 릿 resuspend / µ L. 20-30 아래로 pipetting으로 잘 믹스 번입니다. 그것은 중요 한 세포 덩어리 혼란 된다입니다. 거품을 생성 하지 마세요.
- NdChIP-seq 프로토콜의 하루 1 (제 2)에 직접 진행 또는 플래시 액체 질소와-80 ° c.에 게에 셀 펠 릿을 동결
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정렬된 셀
- 행 크의 버퍼링 된 소금물 (HBSS), 또는 PBS + 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 350 µ L 1.5 mL 튜브에 70000-100000 정렬된16 셀을 수집 합니다.
- 각 셀은 4 ° c.에 6 분 500g x에서 aliquot 아래로 회전 천천히 (셀 펠 렛을 방해) 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 얼음 세포의 용 해 버퍼 + 1 resuspend는 피 펫을 사용 하 여, 1000 셀의 최종 농도에 PIC x / µ L.를 위아래로 pipetting으로 세포의 용 해 버퍼에서 잘 믹스 20-30 시간. 셀 덩어리 중단 됩니다 있는지 확인 합니다. 거품을 생성 하지 마세요.
- NdChIP-seq 프로토콜의 하루 1 (제 2)에 직접 진행 또는 플래시 액체 질소와-80 ° c.에 게에 셀 펠 릿을 동결
2. 제 1 일: ndChIP-seq
- 항 체-비드 복합물의 준비
- 37 ° C 물 목욕과 얼음 양동이 준비. 얼음에서 작업, PIC x 1 x IP 버퍼/1과 항 체 (Ab) 희석 버퍼, x 1을 준비 하 고 얼음에 그들을 유지. 부드러운 펄스-vortexing에 의해 잘 4 ° C 저장 및 혼합에서 단백질 A (또는 G) 자석 구슬 (선택 기준에 대 한 토론 을 참조 하십시오)를 검색 합니다. 얼음에 그것을 유지.
참고: 펄스-vortexing vortexing 전체와 동 튜브에 형성 된다 때마다 중지 의미 합니다. - 새로운 2 mL 튜브에 IP 반응 당 24 µ L 단백질 A (또는 G)의 자석 구슬을 전송 합니다. 구슬의 볼륨을 기록 하 고 얼음에 튜브를 유지. 예를 들어, 7의 ips 사용 7 x 24 µ L = 168 µ L.
- 튜브를 튜브 자석에 놓고 나타내는 비드 분리 될 솔루션에 대 한 대기 합니다. 방해 없이 구슬, 신중 하 게 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 삭제. 튜브 자석에서 튜브를가지고 고 얼음에 그것을 배치.
- 얼음 처럼 차가운 IP 버퍼의 한 동일한 볼륨 (즉, 구슬의 초기 볼륨) + 1 x 그림 믹스를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합. 와 동 하지 마십시오.
- IP 버퍼 + 1 x 그림 + 튜브 자석에 다시 구슬을 놓고 나타내는 비드 분리 될 솔루션에 대 한 기다려야 합니다. 방해 없이 구슬, 신중 하 게 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 삭제. 반복 차가운 IP 버퍼 + PIC 세척 2 X 1 번 총 3 세척 합니다.
- 최종 세척 후 차가운 IP 버퍼는 동일한 볼륨 (즉, 구슬의 초기 볼륨) + 1 x 그림 혼합에 구슬 resuspend. 아래로 pipetting으로 혼합. 와 동 하지 마십시오. 얼음에 튜브를 유지.
- 얼음, 25 mL V 모양의 저수지로 IP 버퍼 + 그림의 10 mL를 붓는 다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 추가 차가운 IP 버퍼의 130 µ L + 깨끗 한 V-하단 96-잘의 개별 우물에 그림 혼합 x 1 판. IP 당 하나의 잘을 작성 합니다. 라벨로 접시 "Ab-비드 복합물".
- 12 µ L 세척 단백질 A (또는 G)의 자석 구슬 잘 IP 버퍼 + 그림, 포함 된 각 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 얼음에 나머지 씻어 구슬 유지.
- 검증 된 항 체에서 얻을 그들의 냉동과 해 동, 얼음에 필요한 경우. 얼음에 working 희석 농도 표 2에 표시 된 1 x Ab 희석 버퍼와 항 체.
- Ab-비드 복잡 한 플레이트의 각 음에 적절 한, 희석 항 체 (표 1)의 1 µ L를 추가 합니다. 항 체 키에 잘 기록. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 20 번 위아래로 pipetting으로 각 행을 믹스. 팁 행 사이 변경 합니다. 알루미늄 플레이트 커버 Ab 비드 복잡 한 접시를 아주 잘 밀봉 하 고 2 시간 이상 회전 하는 플랫폼에 4 ° C에서 품 어.
참고:이 인큐베이션 단계 2.4를 시작할 준비가 될 때까지 진행할 수 있습니다.
- 37 ° C 물 목욕과 얼음 양동이 준비. 얼음에서 작업, PIC x 1 x IP 버퍼/1과 항 체 (Ab) 희석 버퍼, x 1을 준비 하 고 얼음에 그들을 유지. 부드러운 펄스-vortexing에 의해 잘 4 ° C 저장 및 혼합에서 단백질 A (또는 G) 자석 구슬 (선택 기준에 대 한 토론 을 참조 하십시오)를 검색 합니다. 얼음에 그것을 유지.
- 세포 세포의 용 해와 염색 질 소화
- 세포의 용 해 버퍼 x 1 + PIC x 1과 MNase의 1 mL 준비 얼음 작업, 난 희석 (표 3)를 버퍼링 하 고 얼음에 그들을 유지.
- 검색할 셀 알 약-80 ° C 저장 (또는 얼음, 신선 하 게 준비 하는 경우). 각 셀 펠 렛 10 s, 다음 얼음을 전송에 대 한 37 ° C 물 탕에 녹여
- 각 셀 펠 릿 즉시 차가운 1 x 세포의 용 해 버퍼 + 1 x 10000 셀/20 µ L, 그리고 10 번 pipetting으로 믹스의 최종 농도에 그림 고 거품을 만들지 않고 아래 추가 합니다. 예를 들어, 70000 셀에 대 한 최종 볼륨 140 µ L입니다.
- 얼음, aliquot 20 µ L/잘 96 잘 접시에 결과 lysates의 작업. 플라스틱 도장 플레이트 커버 하 고 20 분 라벨 플레이트 "MNase 소화" ice에 품 어 서식 파일 키에 웰 스를 기록. 염색 질 소화 반응의 정확한 타이밍을 보장 하기 위해 한 번에 샘플 2 개 이상의 행으로 소화를 진행 하지 마십시오.
- 방금 전에 20 분 세포 완료 되 면 희석 된 MNase 나 MNase와 효소 나 희석 20 U / µ L의 최종 농도를 버퍼링 하 고 얼음에 그것을 유지.
- MNase을 준비 얼음 작업, 내가 소화 저수지 96 잘 접시의 한 행에 표 4 와 샘플 플러스 5 µ L 죽은 볼륨의 각 행 마다 믹스의 aliquot 20 µ L 믹스 마스터와 얼음에 그것을 유지. 두 개의 행에 대 한 볼륨 이어야 한다: (20 µ L x 2) + 5 µ L = 45 µ L.
- lysates 잠복기 후, 얼음에서 MNase 소화 플레이트를 제거 합니다. 20 µ L MNase의 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 내가 소화 샘플의 각 행에는 믹스 마스터와 아래로 pipetting으로 10 번을 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 정확히 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 5 분 후 반응을 중지, 250 µ M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 6 µ L을 추가 하는 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 샘플의 각 행에 아래로 혼합을 몇 번. 팁 행 사이 변경 합니다. EDTA 추가 후 전환 피펫으로의 설정을 20 µ L을 혼합 10 번 소화 반응의 완전 한 정지를 보장 하기 위해서 여기저기 pipetting으로. 팁 행 사이 변경 합니다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 소화 하는 MNase 샘플의 각 행에 추가 세포의 용 해 버퍼와 혼합 x 10의 6 µ L 10 번 위아래로 pipetting으로 잘. 플라스틱 물개로 커버 하 고 15 분 동안 얼음에 품 어.
- 입력된 분리 및 전 개간
- 모든 우물 같은 살 균, 하나로 펠 릿/서식 파일 셀에 대 한 미리 냉장 얼음, 1.5 mL 튜브 (미리 서식 파일 id 표시) 및 혼합에 수영장, 얼음에 15 분 부 화를 철저 하 게 따라 있지만 천천히 세제 거품을 방지 하는 피 펫을 사용 하 여.
- 각 셀 펠 릿/서식 파일에 대 한 살 균으로 새로운 소화 chromatin, 0.5 mL 튜브 (미리 서식 파일 id 표시), 및 4 ° C에서 저장소의 8 µ L를 하룻밤으로 전송 합니다. 이 입력된 컨트롤 될 것입니다.
- 새로운 96 잘 접시에 48 µ L aliquots에 소화 chromatin의 나머지 볼륨을 배포 합니다. 웰 스 A01-A06 들어가는 셀 펠 릿/템플릿 1, 셀 펠 릿/템플릿 2 우물 A07-A12, 등등으로. 서식 파일의 키에 웰 스를 기록 합니다. "전 개간" 접시를 레이블을 지정 합니다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 추가 IP 버퍼 x 1 + 1 PIC x 120 µ L 및 세척된 단백질 A (또는 G) 자석 구슬의 12 µ L 전 개간 플레이트의 각 음에 단계 2.3.3에서. 10 번 위아래로 pipetting으로 각 행을 믹스. 팁 행 사이 변경 합니다. 알루미늄 플레이트 커버와 함께 접시를 잘 밀봉 하 고 최소 2 h 4 ° C에서 회전 플랫폼에서 품 어.
- Immunoprecipitation 반응
- Ab-비드 복잡 한 접시 (단계 2.1.10)와 전 개간 플레이트 (단계 2.3.4) 적어도 2 h. 빠른 10 centrifuging 여 두 접시를 회전 하는 동안 incubated가지고 있는지 확인 하십시오이 단계를 시작 하기 전에 200 x g에서 s.
- (에서 단계 2.1.10) Ab 비드 복잡 한 접시 접시 자석에 놓고 15 기다려 분명 될 솔루션에 대 한 s. 조심 스럽게 제거 하 고 상쾌한 구슬 방해 하지 않고 한 피 펫을 사용 하 여 삭제. 플레이트 자석에서 접시를 제거 하 고 얼음에 그것을 유지.
- (단계 2.3.4)에서 전 개간 반응 접시 접시 자석에 놓고 15 기다려 분명 될 솔루션에 대 한 별도의 구슬에 대 한 s. 방해 없이 구슬, 신중 하 게 상쾌한 복잡 한 접시 보관 얼음과 혼합에 부드럽게 15 배 아래로 pipetting Ab 구슬의 해당 우물에는 피 펫을 사용 하 여 전송 합니다. 물개는 알루미늄으로 잘 플레이트 커버 플레이트와 품 어 회전 하는 플랫폼에 4 ° C에서 (12 월 18 일 h) 하룻밤. 다시 접시 "IP 반응" 레이블을.
3. 주 2: ndCHIP-seq
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세척 및 차입
- 65 ° c 난방 믹서 설정 얼음에는 낮은 소금 워시 버퍼 및 높은 소금 워시 버퍼를 준비 합니다. 빠른 회전 10 단계의 2.4.3 IP 반응 판 200 x g에서 s.
- IP 반응 접시 접시 자석에 놓고 15 기다려 분명 될 솔루션에 대 한 s. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 구슬을 방해 하지 않고, 조심 스럽게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 플레이트 자석에서 판 하 고 얼음에 그것을 배치.
- IP 반응 판에 샘플의 각 행에 얼음 처럼 차가운 낮은 소금의 150 µ L 세척 버퍼와 혼합 천천히 10 번 아래로 완전히 구슬 resuspend을 추가 합니다.
- IP 반응 접시 접시 자석에 다시, 별도로 구슬 대기 장소와 구슬 방해 하지 않고 제거 하 고 삭제는 상쾌한 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여. 얼음에 다시 접시를 놓고 2 세척 총 3.1.3, 3.1.4 단계를 반복 합니다.
- 얼음, IP 반응 판에 샘플의 각 행에 추가 높은 소금의 150 µ L 워시 버퍼와 혼합 천천히 10 번 아래로 완전히 구슬 resuspend를 pipetting으로 합니다.
- IP 반응 접시 접시 자석에 다시, 별도로 구슬 대기 장소와 구슬 방해 하지 않고 제거 하 고 삭제는 상쾌한 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여. 얼음에 IP 반응 접시를 놓고 미리 옆에 새로운 96 잘 접시를 진정.
- IP 반응 판에 샘플의 각 행에 높은 소금의 150 µ L 세척 버퍼와 혼합 천천히 10 번 아래로 완전히 구슬 resuspend를 pipetting으로 추가 합니다. 물의 resuspension, 후 새, 미리 냉장, 96 잘 접시의 해당 하는 행을 샘플의 각 행을 전송 합니다. 레이블을 접시 "IP 반응". 오래 된 접시를 삭제 합니다.
- 판 자석에 새로운 IP 반응 접시를 놓고 구분 하는 구슬에 대 한 대기. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 구슬을 방해 하지 않고, 조심 스럽게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 실 온에서 접시를 유지.
- IP 반응 판에 샘플의 각 행에 칩 차입 버퍼 (EB)의 30 µ L을 추가 하 고 천천히 아래로 pipetting으로 10 번을 혼합. 거품 형성을 방지 있는지 확인 합니다.
- PCR 덮개로 잘 접시를 봉인 하 고 1350 rpm의 혼합 속도와 1.5 h 65 ° C에서 난방 믹서에서 품 어.
- 1.5 h 부 화 후 4 ° c.에 1 분 동안 200 x g에서 IP 반응 판 아래로 회전 50 ° c.의 난방 믹서 설정을 변경합니다
- 스핀, 후 IP 반응 접시 접시 자석에 놓고 취소 솔루션에 대 한 대기 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 구슬, 방해 하지 않고 신중 하 게 전송 30 µ L는 상쾌한의 새로운 96 잘 접시에. 각 행에 대 한 신선한 팁을 사용 합니다. 레이블을 접시 "IP 반응" 하 고 실내 온도에서 보관.
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단백질 소화
- 4 ℃ 냉장고에서 30% 못/1 M NaCl 자석 구슬17 (버퍼 구성 테이블) 솔루션을 검색 하 고 적어도 30 분 중요 한에 대 한 실내 온도 유지: 비드 솔루션 완전히 진행 하기 전에 실내 온도 도달 하는 확인 하십시오.
- 4 ° C 저장 (2.3.2 단계)와 빠른 회전 급강하에서 입력된 컨트롤 샘플을 검색 합니다. 피 펫을 사용 하 여 볼륨을 측정 하 고 초순 각 입력된 컨트롤에 대 한 추가 30 µ L. 마지막 볼륨 미리 선택 된 입력된 웰 스 (빈 우물)에 입력된 컨트롤 샘플 전송 IP 반응 플레이트 (3.1.12 단계)에서. 예제 키에 잘 기록.
- 얼음, 저수지 96 잘 접시의 한 행에 표 5 와 aliquot 같은 볼륨에서와 같이 단백질 소화 마스터 믹스를 준비 합니다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, IP 반응 판에 샘플의 각 행에 추가 40 µ L의 단백질 소화 마스터 믹스 하 고 위아래로 천천히 10 번을 혼합. PCR 덮개로 잘 접시를 봉인 하 고 1 분, 200 x g에서 스핀 다운 650 rpm에서 설정 하는 30 분 동안 50 ° C에서 난방 믹서에서 품 어. 접시 잠복기 동안 신선한 70% 에탄올 (EtOH)를 준비 하 고 실내 온도에서 보관.
- 30 분 부 화 완료 후 회전 1 분, 4 ° c.에 대 한 200 x g에서 IP 반응 판 실 온에서 접시를 유지.
참고: 총 볼륨 이어야 한다 지금 ~ 70 µ L/잘.
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비드 정리 30% 못/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션을 사용 하 여
- Aliquot 실내 온도 30% 못/1 M NaCl 자석의 저수지 깨끗 한 96 잘 접시의 한 행으로 솔루션 구슬 (샘플 당 75 µ L x 행의 #).
- 실내 온도에, 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 working IP 반응 판에 샘플의 각 행에 30% 못/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 70 µ L (1:1 비율)을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 10 번을 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 실 온에서 15 분 동안 접시를 품 어.
- 플레이트 자석에 접시를 놓고 별도의 구슬 수 있도록 5 분 동안 품 어.
- 피 펫를 사용 하 여 구슬을 방해 하지 않고, 조심 스럽게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 구슬 유지.
- IP 반응 접시 접시 자석에 여전히 동안 실내 온도 70%의 150 µ L 추가 샘플의 각 행에 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 EtOH 30 품 어 및 s. 30 후 s, 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 한 번 더 2 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- 두 번째 EtOH 세척 후 3 분 시각적으로 모든 EtOH 증발 되도록 판 검사에 대 한 '건조' 접시 접시 자석에의 품 어. 그렇지 않은 경우에 1 분 이상 건조 낮은 수율에 구슬 결과 대 한 접시를 품 어.
- 플레이트 자석 및 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 접시를 받아 35 µ L EB (자료 테이블)를 추가 합니다. 10 배를 아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 팁 행 사이 변경 합니다. 3 분 elute 실 온에서 품 어.
- 부 화, 후 IP 반응 접시 접시 자석에 다시 놓고 2 분 동안 품 어. 구슬 분리 해야 하 고 솔루션 명확 하 게 될 것 이다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 구슬, 방해 하지 않고 신중 하 게 전송는 상쾌한 새로운 96 잘 접시의 해당 우물에.
- 알루미늄 플레이트 커버 플레이트를 봉인, 라벨 "IPed + 입력 DNA", 그리고 하룻밤, 4 ° C 또는-20 ° C에서 장기 저장 (> 48 h) 저장.
4. 주 3: 도서관 건축
- 최종 수리 및 인 산화
- 결국 수리/인 산화 반응에 대 한 입력은는 IPed + 입력 단계 3.3.10 접시. 녹고, 후 4 ° C에서 1 분 동안 200 x g에서 내려 접시를 회전 하 고 얼음에 그것을 유지 합니다.
- -20 ° C 냉장고 (효소)를 제외 하 고 시 약의 모든 최종 수리/인 산화 반응 (표 6)에 필요한 그들을 실 온에서 해 동 후 즉시 얼음 전송에서 검색 합니다.
- 얼음에 working, 불 임, 1.5 mL microcentrifuge 관에서 최종 수리/인 산화 마스터 믹스를 설정 하려면 표 6 따릅니다. 모든 비-효소 구성 요소 추가 후 펄스 vortexing에 의해 잘 혼합 하 고 얼음에 다시 튜브를 놓습니다.
- 그들의 저온 저장 및 전송에서 냉장된 튜브 멋진 랙에서 벤치 관련 효소를 검색 합니다. 튜브, 빠른 스핀을 터치 하 여 각 효소를 혼합 하 고 냉장된 튜브 멋진 선반에 다시. 효소를 pipetting 때 정확한 볼륨 전송을 보장 하기 위해서 천천히 발음. 또한, 후 아래로 pipetting으로 마스터 믹스에 팁을 세척.
- 효소는 추가 부드럽게 펄스-소용돌이 마스터 믹스 5 번을 모든 구성 요소, 다음 빠른 스핀의 동등한 배급을 보장 즉시 튜브 얼음에 다시.
- 얼음, 약 새로운 저수지 96 잘 접시;의 한 행으로 최종 수리/인 산화 마스터 믹스의 적절 한 볼륨 수 aliquoted 수 양: (15 µ L 행의 # x) + 5 µ L 죽은 볼륨. 두 개의 행에 대 한 예제 계산: (15 µ L x 2) + 5 µ L = 35 µ L/잘.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 샘플의 각 행에 최종 수리/인 산화 마스터 믹스의 15 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 10 번을 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 플라스틱 커버와 함께 접시를 봉인, 4 ° C에서 1 분 동안 200 x g에 아래로 회전 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 비드 정리 후 최종 수리 및 인 산화
- 4 ℃ 냉장고에서 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션 및 30% 못/1 M NaCl 솔루션을 검색 하 고 적어도 30 분 동안 실 온에서 품 어.
참고: 30% 못/1 M NaCl 솔루션 하지 않습니다 자석 구슬 포함. - 두 솔루션 모두 실내 온도 도달, 후 각 샘플에 대 한 30% 못/1 M NaCl 및 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 1:2 혼합의 80 µ L를 준비 합니다. 24 샘플 예: 24 = 1920 x 80 µ L µ L (640 µ L 30%의 말뚝/1 M NaCl 및 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 1,288 µ L).
- Aliquot 구슬 솔루션 혼합, 같은 볼륨, 저수지 96 잘 접시의 한 행으로 하 고 실내 온도에서 보관. Aliquot EB 버퍼 (40 µ L 샘플 당 행의 # x) 저수지 깨끗 한 96 잘 접시의 한 행에. 두 개의 행에 대 한 예: 40 µ L x 2 = 80 µ L/잘.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 추가 준비 구슬 믹스의 75 µ L 단계의 4.1.7 4.2.2 샘플의 각 행에 단계 10 번 아래로 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 3.3.3-3.3.10 단계에에서 설명 된 대로 15 분 계속 구슬 정리 절차에 대 한 실 온에서 품 어. 플라스틱 도장, 빠른 회전 플레이트 커버 하 고 얼음에 그것을 배치. 4.3 단계로 진행 합니다.
- 4 ℃ 냉장고에서 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션 및 30% 못/1 M NaCl 솔루션을 검색 하 고 적어도 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- A-미행 반응
- A 미행 반응 (표 7)에 필요한 모든 시 약 (효소)를 제외 하 고는-20 ° C 냉동 고에서 가져옵니다, 그리고 실 온에서 녹여 다음 얼음을 즉시 전송 합니다.
- 얼음에 working, 표 7 살 균, 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 A 미행 마스터 믹스를 설정 하려면 따릅니다. 4.1.4-4.1.6 단계에에서 설명 된 대로 일반 효소 brew 설치 지침을 따릅니다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 샘플의 각 행에 A-미행 마스터 믹스의 15 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 10 번을 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. PCR 커버 플레이트를 봉인, 4 ° C에서 1 분 동안 200 x g에 아래로 회전 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 thermocycler에서 품 어. 부 화 후 1 분 동안 200 x g에서 내려 접시를 회전 하 고 실 온에서 보관 합니다.
- 비드 정리 후 A-미행
- 4.2 단계에서 설명 하는 단계를 수행 합니다. 플라스틱 도장, 라벨 "A 꼬리 + BC", 빠른 회전, 플레이트 커버 하 고 얼음에 그것을 배치. 4.5 단계로 진행 합니다.
- 어댑터 결 찰
- 어댑터 결 찰 반응 (표 8)에 대 한 필요한 모든 시 약 (효소)를 제외 하 고는-20 ° C 냉동 고에서 가져옵니다, 그리고 실 온에서 녹여 다음 얼음을 즉시 전송 합니다.
- 10 µ M PE 어댑터 (보충 표 1) 재고 솔루션을 검색 하 고 희석 0.5 µ M EB를 사용 하 여. 펄스 vortexing에 의해 잘 혼합. 필요한 볼륨은 3 µ L의 샘플 # x. 작업을 얼음, aliquot 0.5 µ M PE 어댑터, 같은 볼륨, 96-잘 깨끗 한 저수지 판의 12 우물에. 얼음에 그것을 유지.
- 얼음에 working, 불 임, 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 어댑터 결 찰 마스터 믹스를 설정 하려면 테이블 8 따릅니다. 4.1.4-4.1.6 단계에에서 설명 된 대로 일반 효소 brew 설치 지침을 따릅니다. 5 X 빠른 결 찰 버퍼는 완전히 해 동 하 고 아주 잘 사용 하기 전에 혼합 다는 것을 확인 하십시오.
- 에 얼음, 약 수는 적절 한 양의 새로운 저수지 96 잘 접시의 한 행으로 어댑터 결 찰 마스터 믹스. 예를 들어 두 개의 행에 대 한 계산: (23 µ L x 2) + 5 µ L = 51 µ L/잘. 얼음에 플레이트를 유지.
- 0.5 µ M의 2 µ L 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 샘플 단계 4.4.1 믹스에서의 각 행에 끝 결합 (PE) 어댑터. 팁 행 사이 변경 합니다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 샘플의 각 행에 어댑터 결 찰 마스터 믹스의 23 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 15 번을 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 레이블 "결 찰", 4 ° C에서 1 분 동안 200 x g에 아래로 회전 금속 덮개를 가진 격판덮개를 봉인 하 고 하룻밤 실 온에서 품 어.
- 제 4 일: 비드 정리 #1 어댑터 결 찰 후
- 4 ℃ 냉장고에서 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션을 검색 하 고 적어도 30 분 동안 실 온에서 품 어. 솔루션 평형 하는 동안 준비 신선한 70 %EtOH.
- 약 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션 수, 96-잘 저수지의 한 행으로 샘플 당 55 µ L 플레이트 및 실내 온도에서 보관. 두 개의 행에 대 한 예: 2 = 110 x 55 µ L µ L/잘.
- Aliquot EB 버퍼, 96-잘 깨끗 한 저수지 접시의 한 행으로 샘플 당 50 µ L. 두 개의 행에 대 한 예: 50 µ L x 2 = 100 µ L/잘.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 단계의 4.5.6 결 찰 판에 샘플의 각 행에 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 48 µ L을 추가 하 고 10 배 아래로 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 3.3.3-3.3.7 단계에에서 설명 된 대로 15 분 계속 구슬 정리 절차에 대 한 실 온에서 품 어.
- 플레이트 자석 및 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 접시를 받아 45 µ L EB (자료 테이블)를 추가 합니다. 10 배를 아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 팁 행 사이 변경 합니다. 3 분 elute 실내 온도에 대 한 품 어.
- 부 화, 후 IP 반응 접시 접시 자석에 다시 배치 구슬 방해 없이 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 2 분에 대 한 품 어, 신중 하 게 새로운 96 잘 접시의 해당 우물에는 상쾌한 전송. "결 찰 + 1 BC" 접시를 레이블을 지정 합니다.
- 각 잘 하 10 x PCR 고화질 버퍼의 5 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 잘 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 플라스틱 도장, 빠른 회전, 플레이트 커버 하 고 실내 온도에서 보관.
- 비드 정리 #2 어댑터 결 찰 후
- 다음 변경 4.6 섹션에 설명 된 대로 비드 정리 수행: 각 활성 잘 결 찰 + 1 기원전 플레이트 (단계 4.6.7)에서 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 60 µ L을 추가 하 고 EB 버퍼의 35 µ L를 사용 하 여 구슬에서 elute. "결 찰 + 2 BC" 접시를 레이블 하 고 얼음에 그것을 유지.
- PCR 증폭
- -20 ° C 냉동 고에서 모든 고 시 약 (효소)를 제외 하 고 PCR 반응 (표 9)에 필요한를 가져옵니다, 그리고 그들을 실 온에서 해 동 후 즉시 얼음에 그들을 배치.
- 얼음에 working, 불 임, 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 PCR 마스터 믹스를 설정 하려면 테이블 9 따릅니다. 4.1.4-4.1.5 단계에에서 설명 된 대로 일반 brew 설정 지침을 따르십시오. 에 얼음, 약 수는 적절 한 양의 새로운 저수지 96 잘 접시의 한 행으로 PCR 주인 혼합. 얼음에 그것을 유지. 4.5.4 샘플 계산에 대 한 단계를 참조 하십시오.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 얼음에서 작업 각 고유 12.5 µ M PCR 뇌관 (보충 표 2)에 결 찰에 각 잘 + 2 BC 플레이트 (단계 4.7.1) 인덱싱 역방향의 2 µ L을 추가 하 고 위아래로 천천히 섞어. 팁 행 사이 변경 합니다. 얼음에 플레이트를 유지.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 얼음에 작업 추가 샘플의 각 행에 마스터 PCR 혼합의 23 µ L 단계 4.8.3 믹스에서 10 배 아래로 pipetting으로. PCR 커버 플레이트를 봉인, 1 분, 200 x g에서 스핀 다운 및는 thermocycler에서 품 어 (PCR 순환 조건 표 10 참조).
- 비드 정리 PCR 증폭 후
- PCR 확대 후 1 분, 4 ° c.에 대 한 200 x g에서 접시를 회전 다음 변경 4.6 섹션에 설명 된 대로 구슬 정리 수행: 각 PCR 반응에 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 51 µ L을 추가 하 고 EB 버퍼의 25 µ L를 사용 하 여 구슬에서 elute. 알루미늄 커버 플레이트 및 스핀 다운 200 x g에서 1 분 저장소-20 ° c.에 샘플
- 생성 된 라이브러리의 유효성을 검사 하려면 형광 기반 분석 결과 사용 하 여 DNA 정량화를 수행, 칩-기반 모 세관 전기 이동 법 분석기 (높은 감도 분석 결과)를 사용 하 여 최종 제품을 시각화 하 고 농축을 실행 정량 PCR (정량) (참조 대표 결과, ndChIP-seq 라이브러리 품질 정량 유효성 검사).
Representative Results
Chromatin 소화 프로필
MNase 소화의 최적화는이 프로토콜의 성공을 위해 필수적 이다. 그것은 중요 한 소화 프로필 단일 nucleosome 조각 크기에 의해 지배를 생성 하는 동안 하지-소화, 더 높은 순서 nucleosome 파편의 복구에 대 한 허용. 이상적인 소화 프로필 극히 작고 단일 nucleosomes 보다 더 큰 조각을 나타내는 단일 nucleosome 파편의 대부분 이루어져 있습니다. 그림 1 이상적인,-소화-소화 크기 배포 프로 파일의 예를 보여줍니다. Chromatin의 최적의 소화 또한 것입니다 IP 자료 (그림 2)에서 생성 된 시퀀싱 라이브러리의 프로필에 명백한 참고.
NdChIP-seq 라이브러리 품질 정량의 유효성 검사
정량은 칩18,,1920의 품질 평가 대 한 기초가 튼튼한 방법입니다. 때에 핵 산의 수익률 세포 10000에 ndChIP-seq를 수행 후 IP 1 ng. 따라서, 배경 위에 대상 영역의 상대 농축을 평가 하기 위해 도서관 건설 후 정량 Pcr을 수행 필수적 이다. 배경 추정을 제공 하려면 MNase 소화 chromatin (입력)에서 생성 하는 라이브러리 생성 됩니다. 각 IP 라이브러리 (일반적으로 사용 되 히스톤 부호를 위한 뇌관의 목록에 대 한 Supplemental표 3 참조) 뇌관의 2 세트 필요 합니다. 한 뇌관 세트는 일관 되 게 관심 (긍정적인 대상)의 히스톤 수정에 연관 된 게놈 지역 및 관심 (제외 대상)의 히스톤 수정 표시 되지 않은 다른 영역에 대 한 특정 해야 합니다. 칩 seq 라이브러리의 품질 입력된 라이브러리 관련 농축을 접어로 부과 됩니다. 배 농축 대상 게놈 영역의 지 수 증폭을 가정 하는 다음 수식을 사용 하 여 산출 될 수 있다: 2Ct입력-CtIP. 우리의 사용자 정의 R 통계 소프트웨어 패키지, qcQpcr_v1.2는 낮은 입력된 기본 칩 seq 라이브러리 (추가 코드 파일)의 정량 농축 분석에 적합. 그림 3 은 성공과 실패 칩 seq 라이브러리에 대 한 정량 결과를 나타냅니다. 좋은 품질 ndChIP-seq 라이브러리에 대 한 최소 예상된 배 농축 값은 H3K4me3, 및 광범위 한 표시, 예를 들어 H3K27me3에 대 한 7 처럼 좁은 부호에 대 한 16.
MNase 접근을 모델링
칩 seq의 전산 분석은 복잡 하 고 각 실험 설정에 대 한 고유의. 국제 인간 Epigenomic 컨소시엄 (IHEC)와 백과 사전의 DNA 요소 (인코딩)에 의해 설립 지침 서의 세트는 칩 seq 라이브러리21의 품질을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 라이브러리의 시퀀싱 깊이 탐지 및 풍부한 지역20의 해상도 영향을 주의 하는 것이 중요입니다. 봉우리의 수 증가 감지 하 고 읽기 깊이 증가 함에 따라 대 지에 접근. NdChIP-seq 라이브러리 좁은 표시 (예, H3K4me3)의 50 백만 쌍 읽기 (25 백만 조각)의 IHEC 권고에 따라 시퀀스를 권장 및 100 백만 쌍-읽기 (50 백만 조각) 광범위 한 마크 ( 에 대 한 예를 들어, H3K27me3)와22를 입력. 이 시퀀싱 깊이 채도23,24에 도달 하지 않고 칩 seq 피크 호출자, 호머, MACS2 등을 사용 하는 광범위 하 게 사용 하 여 가장 중요 한 봉우리의 검출에 대 한 충분 한 시퀀스 정렬 제공 합니다. 높은 품질 포유류 ndChIP-seq 라이브러리의 PCR 중복 속도는 < > 90% (를 포함 하 여 중복된 읽기)의 10% 및 참조 게놈 정렬 속도. 성공적인 ndChIP-seq 라이브러리 정렬된 읽기 MACS222 식별 내 농축 봉우리의 상당 부분 (> 40%)와 높은 상관된 복제 포함 됩니다 및 게놈 브라우저에 정렬 된 읽기의 검사는 시각적으로 계시 해야 한다 입력된 라이브러리 (그림 4)에 비해 감지 풍부. 또한, ndChIP-seq nucleosome 밀도 가우스 혼합물 분배 알고리즘을 이용 하 여 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다 (w1 * n(x; Μ 1,σ1) + w2 * n(x; μ2, σ2) = 1) MNase 액세스할 수 경계에 의해 정의 된 대로 식별 모델 nucleosome 밀도에 풍부한 영역을 MACS2에서. 이 모델 w1 모노 nucleosome 배포 무게 나타내고 w2 디 nucleosome 배포 무게를 나타냅니다. W1 은 w2보다 큰, 지배 모노 nucleosome 파편 그리고 그 반대도 있다. 이 분석 조각 크기를 정의할 수 있도록 라이브러리 쌍 엔드 패션에 시퀀싱 할 필요 합니다. 가우스 혼합물 분배 알고리즘을 적용, 통계적으로 중요 한 풍부한 지역 먼저 식별 됩니다. MACS2와 함께 사용 하 여 입력 컨트롤을 기본 설정으로 좁은 마크와 광범위 한 마크 0.01의 q 값 구분에 대 한 피크 전화를 하시기 바랍니다. 가우스 혼합물 분배 알고리즘을 고용 통계 패키지 수 널리 사용 되는 통계 소프트웨어 패키지에서 사용할 수 있습니다. 평균 조각 크기, 결정을 활용 하 여 IPed 샘플의 쌍 간 읽기 경계로 MACS2에서 배포판 식별 농축된 발기인 및 가우스 혼합물 분배 알고리즘 연구-통계 패키지를 사용 하 여 각 발기인에 적용할 수 있습니다. Mclust 버전 3.025 가중치 분포를 계산 하. 이 응용 프로그램에서는이 임계값 결과 무게 견적 될 신뢰할 수 있기 때문에 30 정렬 된 파편을 포함 하는 발기인을 제거 하는 것이 좋습니다. 좋은 품질 ndChIP-seq 라이브러리 평균값에 해당 하는 모노-디 nucleosome 조각 길이와 두 개의 주요 구성 요소로 구성 된 가우스 혼합 분포를 생성 합니다.
그림 1 : 라이브러리 생성 하기 전에 MNase 소화의 평가. 최적의 MNase의 칩 기반 모 세관 전기 이동 법 분석기 프로필 소화 (A), (B), 소화에서-및-(C) chromatin 소화. 생물 복제, 빨간색, 파란색과 녹색 추적으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 라이브러리 생성 후 MNase 소화의 평가. (A) 최적의 소화 입력의 도서관 건설 프로필을 게시 (생물 복제, 빨강, 녹색, 검은색) 및 IP (생물 복제, 청록색, 보라색, 파란색) 및 (B) 최적의 입력 (생물 복제, 빨강, 녹색, 파랑) 및 IP ( 생물 복제; 청록색, 보라색, 주황색) 라이브러리입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 게시할 라이브러리 건설 정량 PCR ndChIP-seq 라이브러리의 품질을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. H3K4me3 IP 입력된 라이브러리 관련 라이브러리의 배 농축 2로 계산 됩니다(입력-Ct Ct의 IP) qcQpcr_v1.2를 사용 하 여 긍정적이 고 부정적인 대상에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 10000 기본 CD34에서 건설 대표 ndChIP-seq 라이브러리+ 코드 혈액 세포. 피어슨 상관 관계 H3K4me3 신호 (백만 매핑된 읽기 당 읽기) 3 생물 복제, 1, 2, (B) (A) 복제 사이 발기인 (2 Kb + TSS)에서 계산의 1, 3, 2 및 3 (C) 복제 복제 합니다. (D) UCSC 브라우저 보기 복사해올된 칩 seq의 HOXA 유전자 클러스터의 IP, IP 당 10, 000 셀에서 성공적인 ndChIP-seq 및 실패 ndChIP-seq IP 당 10, 000에서 1 백만 세포에서 생성 됩니다. (빨간색: H3K27me3, 그린: H3K4me3, 검정: 입력). MACS2 내에서 매핑된 읽기 (E) 분수 (검정) H3K4me3 및 H3K27me3 (회색)의 풍부한 영역 식별. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 버퍼 구성 |
| A.1. Immunoprecipitation 버퍼 (IP) |
| 20 mM Tris HCl pH 7.5 |
| 2 mM EDTA |
| 150 mM NaCl |
| 0.1% 트라이 톤 X-100 |
| 0.1 %Deoxycholate |
| 10 m m 나트륨 낙 산 염 |
| A.2입니다. 낮은 소금 워시 버퍼 |
| 20 mM Tris HCl pH 8.0 |
| 2 mM EDTA |
| 150 mM NaCl |
| 1% 트라이 톤 X-100 |
| 0.1% SDS |
| A.3입니다. 높은 소금 워시 버퍼 |
| 20 mM Tris HCl pH 8.0 |
| 2 mM EDTA |
| 500 mM NaCl |
| 1% 트라이 톤 X-100 |
| 0.1% SDS |
| A.4. 칩 차입 버퍼 |
| 100 mM NaHCO3 |
| 1% SDS |
| A.5. 세포의 용 해 버퍼-1 mL x 1 |
| 0.1% 트리톤 |
| 0.1 %Deoxycholate |
| 10 m m 나트륨 낙 산 염 |
| A.6입니다. Ab 희석 버퍼 |
| 0.05% (w/v) 아 지 드 |
| 0.05% 광범위 항균 (예: ProClin 300) |
| PBS에서 |
| A.7. 30% 못/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션 (기준16) |
| 30% 말뚝 |
| 1 M NaCl |
| 10 mM Tris HCl pH 7.5 |
| 1 mM EDTA |
| 씻어 초 상자성 구슬의 1 mL |
| A.8. 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션 (기준16) |
| 30% 말뚝 |
| 1 M NaCl |
| 10 mM Tris HCl pH 7.5 |
| 1 mM EDTA |
| 씻어 초 상자성 구슬의 1 mL |
표 1: ndChIP-seq 버퍼 구성입니다.
| 히스톤 수정 | 농도 (µ g / µ L) |
| H3K4me3 | 0.125 |
| H3K4me1 | 0.25 |
| H3K27me3 | 0.125 |
| H3K9me3 | 0.125 |
| H3K36me3 | 0.125 |
| H3K27ac | 0.125 |
표 2: 항 체 금액 ndChIP이 필요한
| Reganet | 볼륨 (µ L) |
| 울트라 순수 물 | 478 |
| 1 M Tris HCl pH 7.5 | 10 |
| 0.5 M EDTA | 10 |
| 5 M NaCl | 2 |
| 글리세롤 | 500 |
| 총 볼륨 | 1000 |
표 3: MNase 희석 버퍼에 대 한 제조 법입니다.
| 시 약 | 볼륨 (µ L) |
| 울트라 순수 물 | 13 |
| 20 mM DTT | 1 |
| MNase 버퍼 x 10 | 4 |
| 20 U / µ l Mnase | 2 |
| 총 볼륨 | 20 |
표 4: MNase 마스터 믹스에 대 한 제조 법입니다.
| 시 약 | 볼륨 (µ L) |
| 차입 버퍼 | 30 |
| 버퍼 G2 | 8 |
| 프로 테아 제 | 2 |
| 총 볼륨 | 40 |
표 5: DNA 정화 마스터 믹스에 대 한 제조 법.
| 시 약 | 볼륨 (µ L) |
| 울트라 순수 물 | 3.3 |
| 금지 Endonuclease 버퍼 (예: NEBuffer) x 10 | 5 |
| 25mm ATP | 2 |
| 10mm dNTPs | 2 |
| T4 Polynucleotide 키 니 아 제 (10 U / µ l) | 1 |
| T4 DNA 중 합 효소 (3 U / µ l) | 1.5 |
| Dna 중 합 효소 I, 대형 (Klenow) 조각 (5 U / µ l) | 0.2 |
| 총 볼륨 | 15 |
표 6: 최종 복구 마스터 믹스에 대 한 제조 법.
| 시 약 | 볼륨 (µ L) |
| 울트라 순수 물 | 8 |
| 금지 Endonuclease 버퍼 (예: NEBuffer) x 10 | 5 |
| 10mm dATP | 1 |
| Klenow (3'-5' 엑 소-) | 1 |
| 총 볼륨 | 15 |
표 7: A-미행 마스터 믹스에 대 한 제조 법.
| 시 약 | 볼륨 (µ L) |
| 울트라 순수 물 | 4.3 |
| 5 배 빠른 결 찰 버퍼 | 12 |
| T4 DNA 리가 (2000 U / µ l) | 6.7 |
| 총 볼륨 | 23 |
표 8: 어댑터 결 찰 마스터 믹스에 대 한 제조 법.
| 시 약 | 볼륨 (µ L) |
| 울트라 순수 물 | 7 |
| 25 uM PCR 뇌관 1.0 | 2 |
| HF 버퍼 x 5 | 12 |
| DMSO | 1.5 |
| DNA 중 합 효소 | 0.5 |
| 총 볼륨 | 23 |
표 9: PCR 주인 혼합에 대 한 제조 법입니다.
| 체 (° C) | 기간 (s) | 사이클 수 |
| 98 | 60 | 1 |
| 98 | 30 | |
| 65 | 15 | 10 |
| 72 | 15 | |
| 72 | 300 | 1 |
| 4 | 보류 | 보류 |
표 10: PCR 메서드를 실행 합니다.
| 올리고 | 시퀀스 | 수정 |
| PE_adapter 1 | 5'-/ 5Phos/GAT CGG 아 그 AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG-3 ' | 5' 수정: 인 산화 |
| PE_adapter 2 | 5'-ACA CTC TTT CCC 전술 ACG ACG CTC TTC CGA TC * T-3' | 3' 수정: * T는 phosphorothioate 본드 |
PE 어댑터의 세대에 대 한 보충 표 1: 올리고 시퀀스.
| 뇌관 이름 | 시퀀스 | 인덱스 | IndexRevC (연속 사용)를 | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CGTGAT | atcacg | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CTGATC | gatcag | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGGGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GGGGTT | aacccc | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CTGGGT | acccag | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AGCGCT | agcgct | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CTTTTG | caaaag | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 7 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | TGTTGG | ccaaca | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 8 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AGCTAG | ctagct | |||||||
| PCR 역 인덱싱 입문서 9 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AGCATC | gatgct | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 10 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CGATTA | taatcg | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 11 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATTCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CATTCA | tgaatg | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 12 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GGAACT | agttcc | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 13 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | ACATCG | cgatgt | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 14 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | AAGCTA | tagctt | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 15 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAAGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CAAGTT | aacttg | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 16 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GCCGGT | accggc | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 17 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGCCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CGGCCT | aggccg | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 18 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | TAGTTG | caacta | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 19 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GCGTGG | ccacgc | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 20 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTATAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GTATAG | ctatac | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 21 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTTGCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | CCTTGC | gcaagg | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 22 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTGTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | GCTGTA | tacagc | |||||||
| PCR 역 인덱싱 뇌관 23 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGGCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | ATGGCA | tgccat | |||||||
| PCR 역 인덱싱 입문서 24 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT | TGACAT | atgtca | |||||||
추가 표 2: PCR 뇌관 시퀀스를 인덱싱 반전.
| 뇌관 | 시퀀스 | |
| ZNF333_genic_H3K9me3_F | 5'-AGCCTTCAATCAGCCATCATCCCT-3' | |
| ZNF333_genic_H3K9me3_R | 5'-TCTGGTATGGGTTCGCAGATGTGT-3' | |
| HOXA9-10_F | 5'-ACTGAAGTAATGAAGGCAGTGTCGT-3' | |
| HOXA9-10_R | 5'-GCAGCAYCAGAACTGGTCGGTG-3' | |
| GAPDH_genic_H3K36me3_F | 5'-AGGCAACTAGGATGGTGTGG-3' | |
| GAPDH_genic_H3K36me3_R | 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3' | |
| GAPDH F | 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3' | |
| GAPDH-R | 5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3' | |
| 히스톤 수정 | 긍정적인 대상 | 제외 대상 |
| H3K4me3 | GAPDH | HOXA9-10 |
| H3K4me1 | GAPDH_genic | ZNF333 |
| H3K27me3 | HOXA9-10 | ZNF333 |
| H3K27ac | GAPDH | ZNF333 |
| H3K9me3 | ZNF333 | HOXA9-10 |
| H3K36me3 | GAPDH_genic | ZNF333 |
추가 표 3: 일반적으로 사용 되 히스톤 부호 (H3K4me3, H3K4me1, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3, 및 H3K36me3)를 위한 뇌관의 목록입니다.
보충 파일 1: ndChIP-seq 워크시트. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
추가 코드 파일: qcQpcr_v1.2. 낮은 입력된 기본 칩 seq 라이브러리의 정량 농축 분석에 대 한 R 통계 소프트웨어 패키지. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
Chromatin 수정 및 transcriptional 규칙에서 위치 하는 nucleosome의 조합 성격을 감안할 때, 이러한 기능의 동시 측정 하는 방법 후 성적인 규정에 새로운 통찰력을 제공 것입니다. 여기에 제시 된 ndChIP-seq 프로토콜은 히스톤 수정 및 드문 1 차 셀9,10nucleosome 밀도 동시 심문 수 있도록 최적화 된 네이티브 칩 seq 프로토콜이입니다. ndChIP-seq 활용 chromatin의 효소 소화, 쌍 간 대규모 병렬 시퀀싱 및 가우스 혼합 배포 모델을 사용할 경우, 단일 nucleosome 수준 조사 히스톤 수정에 대 한 수 고는 deconvolution epigenomic 프로필 인구 내에서 성분에 의해 구동. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리 이전 면역을 시 켰 던 조각 크기, 쌍 간 경계, ChromHMM10,24에 의해 정의 된 특정 chromatin 상태와 관련 된 읽기에 의해 결정의 독특한 분포를 보고 있다.
NdChIP-seq 도서관의 질 항 체 특이성, 감도, 최적의 MNase 소화 조건, 및는 chromatin의 품질 등 여러 요인에 따라 달라 집니다. 사용 하는 항 체의 특이성은 성공적인 ndChIP-seq 라이브러리 생성에서 결정적 이다. 이상적인 항 체 다른 epitopes와 작은 교차 반응성으로 관심의 피토 프에 대 한 높은 선호도 보여줍니다. 그것은 동등 하 게 자석 구슬 선택의 항 체에 대 한 높은 선호도 선택 하는 것이 중요입니다.
MNase 소화가이 프로토콜에 중요 하 고 시간 및 농도 민감한 반응입니다. 따라서, 여러 개의 샘플을 처리할 때 그것은 중요 한 시간의 상응 하는 금액에 대 한 각 반응에 대 한 알을 품는 (단계 2.2 참조). chromatin의 품질이 크게 ndChIP이 Fragmented chromatin 리드 낮은 신호 대 잡음 비와 최적의 MNase 소화 프로필 및 라이브러리에서 결과의 결과 초래 하는 또 다른 요인은. 낮은 기본 샘플 세포 생존 능력 또는 염색 질, 타락 한 같은 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직이이 프로토콜에 대 한 권장 하지 않습니다.
Chromatin 추출 하는 동안 그림의 추가 감소 (즉, 무작위) chromatin 조각화 및 보존의 무결성 히스톤 꼬리를 바라지 않는. 따라서, 그림 사용 하 여 세포의 용 해 버퍼와 그냥 이전 immunoprecipitation 버퍼에 추가 해야 합니다. Cytometry 통해 선택 셀 가능한 셀을 선택 하 고 확인 하는 동안 셀 셀 번호 추정의 정확성과 세포의 생존 능력을 증가 하는 낮은 흐름 율에 정렬 됩니다. 세포 세포의 용 해 버퍼에 직접 정렬 하지 마십시오. 칼 집 버퍼 세포의 용 해 버퍼를 희석 하 고 세포 막의 효과적인 permeabilization MNase를 방지. 셀 또는 유기 체의 종류에 따라 적정 MNase의 최적의 소화를 얻기 위해 필요할 수 있습니다.
ndChIP-seq 포유류 세포에 광범위 한 표시 및 입력에 대 한 좁은 표시 및 100 백만 쌍 읽기 (50 백만 조각) 50 백만 쌍 읽기 (25 백만 조각)의 최소 시퀀싱 깊이 필요합니다. 가우스 혼합물 분배 알고리즘 라이브러리가이 추천 아래 크게 깊이 시퀀스에 최적으로 수행 되지 않습니다. ndChIP-seq는 모노 또는 디 nucleosome 지배 발기인으로 모노 및 디 nucleosome 조각 길이 대 한 가중치 분포 값 간의 구분이 약간 발기인 분류 하지 것입니다. 따라서, 이러한 발기인 이후 분석에서 제거 되어야 합니다. 생물 복제 예측된 배포판에 대 한 자신감을 증가 하 고 MNase 소화 및 도서관 건설에서 기술 변화를 식별을 생성할 수 있습니다.
네이티브 칩 seq 프로토콜의 이전 반복, 달리 ndChIP-seq nucleosome 밀도, 통합 조각 크기 게시물 immunoprecipitation를 이용 하 여 염색 질 구조와 히스톤 수정의 조합 효과 조사 하는 수단 제공 MNase 접근성, 히스톤 수정 측정에 의해 결정. NdChIP-seq의 응용 프로그램 기본 세포와 조직에 epigenetic 규제의 통합 특성에 새로운 통찰력을 제공 하 고 인구 내의 성분으로 인해 후 서명 식별을 허용.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
앨 러 배 마 건강 연구의 캐나다 학회에서 캐나다 대학원 장학금에 의해 지원 되었다. 이 작품은 게놈 브리티시 컬럼비아 및 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR-120589) 캐나다 Epigenetics, 환경 및 건강 연구 컨소시엄 이니셔티브의 한 부분으로에서 교부 금에 의해 그리고 테리 폭스 연구 연구소 프로그램에 의해 지원 되었다 프로젝트 부여 #TFF-122869 수소와 수소에 테리 폭스 연구소 새로운 탐정 수상 (부여 # 1039)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Tris-HCl –pH 7.5 | Thermo Scientific | 15567-027 | |
| 1M Tris-HCl –pH 8 | Thermo Scientific | 15568-025 | |
| 0.5M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 5M NaCl | Sigma | 1001385276 | |
| Triton X-100 | Sigma | 1001412354 | |
| Sodium-Deoxycholate | Sigma | 1001437582 | |
| SDS | Thermo Scientific | 15525-017 | |
| Sodium-Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| 100% EtOH | NA | NA | |
| V-bottom 96 well plate (AB 1400) | Thermo Scientific | AB-1400-L | |
| Gilson P2 pipetman | Mandel | F144801 | |
| Gilson P10 pipetman | Mandel | F144802 | |
| Gilson P20 pipetman | Mandel | F123600 | |
| Gilson P100 pipetman | Mandel | F123615 | |
| Gilson P200 pipetman | Mandel | F123601 | |
| Gilson P1000 pipetman | Mandel | F123603 | |
| Micrococcal Nuclease | NEB | M0247S | |
| Thermo Mixer C (Heating block mixer) | Eppendorf | 5382000023 | |
| Multi 12-channel Pippet P20 | Rainin | 17013803 | |
| Multi 12-channel Pippet P200 | Rainin | 17013805 | |
| 1.5 ml LoBind tube | Eppendorf | 22431021 | |
| 0.5 ml LoBind tube | Eppendorf | 22431005 | |
| Plastic Plate Cover | Edge Bio | 48461 | |
| PCR cover | Bio Rad | MSD-1001 | |
| Aluminum Plate Cover | Bio Rad | MSF-1001 | |
| Elution buffer (EB buffer) | Qiagen | 19086 | |
| 1M DTT | Sigma | 646563 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Eppendorf | 22625004 | |
| Ultrapure water | Thermo Scientific | 10977-015 | |
| Protein G dynabeads | Thermo Scientific | 10001D | |
| Protein A dynabeads | Thermo Scientific | 10001D | |
| Protease inhibitor Cocktail | Calbiochem | 539134 | |
| Rotating platform | Mandel | 1b109-12052010 | |
| Plate magnet | Alpaqua | 2523 | |
| Domed 12-cap strip | Bio Rad | TCS1201 | |
| Buffer G2 | Qiagen | 1014636 | |
| Protease | Qiagen | 19155 | |
| Tube Magnet (DynaMag-2) | Thermo Scientific | 12321D | |
| Tube Magnet (DynaMag-2) | LabCore | 730-006 | |
| V shape Plastic reservoir | Mandel | S0100A | |
| Vortex | Mandel | C1801 | |
| Mini Fuge | Mettler Toledo | XS2035 | |
| Analytical scale | Mandel | LB109-12052010 | |
| Quick Ligation Reaction Buffer, 5X | NEB | B6058S | |
| DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | M0210S | |
| Klenow Fragment (3'-5' exo) | NEB | M0212S | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Deoxynucleotide Solution mix, 10mM | NEB | N0447S | |
| dATP Solution 10mM | NEB | N0440S | |
| Quick T4 DNA Ligase | NEB | M0202T | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP), 25mM | NEB | P0756S | |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F549L | |
| NEBuffer 2 | NEB | B7002S | |
| Hank's buffered salt solution | Thermo Scientific | 14025076 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | A3160702 | |
| phosphate buffer saline | Thermo Scientific | 10010023 | |
| H3K4me3 | Cell Signaling | 9751S | |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410037 | |
| H3K27me3 | Diagenode | pAb-069-050 | |
| H3K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| H3K9me3 | Diagenode | C15410056 | |
| SeraMag super-paramagnetic beads |
References
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