Anormale sensorische Funktion zugrunde liegt, viszerale Schmerzen und andere Symptome von funktionellen und entzündlichen Darmerkrankungen. Ein Protokoll für die elektrophysiologische Aufzeichnung der Kolon afferenten Nerven in eine ex Vivo Ratte Colorectum Vorbereitung wird hier vorgestellt.
Dysfunktion des Kolon Sinnesnerven hat in der Pathophysiologie von mehreren gemeinsamen Bedingungen, einschließlich funktionelle und entzündliche Darmerkrankungen und Diabetes verwickelt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die in Vitro Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon Afferenzen in Ratten. Die Colorectum mit der intakten Becken Ganglion (PG) angeschlossen, wird aus der Ratte entfernt; unterkühlte mit Carbogenated Krebs-Lösung in der Aufnahme-Kammer; und Kontrolle an den oral- und Analsex enden, um Blähungen zu ermöglichen. Eine feine Nervenbündel aus PG wird identifiziert, und die multiunit afferenten Nerven-Aktivität ist mit einer Saug-Elektrode aufgenommen. Distension des Segments Kolon entlockt allmählichen Anstieg multiunit Entlastung. Eine Hauptkomponentenanalyse wird durchgeführt, um die niedrigschwellige, die hohe Schwelle und die weiten Dynamikbereich afferenten Fasern zu unterscheiden. Chemischen Empfindlichkeit des Kolon Afferenzen kann durch die Badewanne oder Intraluminal Gabe von Testverbindungen untersucht werden. Dieses Protokoll kann geändert werden, für die Anwendung auf andere Arten, wie Mäuse und Meerschweinchen und die Unterschiede in den elektrophysiologischen Eigenschaften des Kopf/Unterbauch und lumbosakralen/Becken-Afferenzen des absteigenden Dickdarms in Normal zu studieren und pathologischen Zuständen.
Der Magen-Darm-Trakt (GIT) ist reich mit extrinsischen afferenten Nerven innerviert, zu vermitteln, dass sensorische Signale aus dem Bauch heraus auf das zentrale Nervensystem und der Darm-Hirn-Interaktion beitragen. Veränderte Erregbarkeit des diese extrinsischen Afferenzen sowie veränderte zentrale Verarbeitung der afferenten Eingänge zugrunde liegt, viszerale Schmerzen und andere Symptome der GI-Bedingungen, einschließlich der Funktions- und entzündliche Darm-Erkrankungen-1. Sensorischer Informationen aus dem Colorectum vermittelt in erster Linie durch die Kopf/Unterbauch und lumbosakralen/Beckennerven (PN)2. Es wurde ein erhöhtes Interesse an einem Studium der elektrophysiologischen Eigenschaften dieser primären afferenten Fasern in Nagetier Krankheitsmodelle. Jedoch in Vivo elektrophysiologische Aufnahmen von Kolon Afferenzen bei Nagern ist eine technische Herausforderung und erfordert erhebliche chirurgische Fähigkeiten. Darüber hinaus können hämodynamischen Veränderungen, Gewebe Bewegung und Anästhetika auch Nerven-Aktivität und die Sensibilität für Reize in Vivozu testen auswirken. Daher haben in den letzten Jahren eine wachsende Zahl von Studien in Vitro (ex Vivo) Vorbereitungen der verschiedenen Arten, darunter Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und Menschen, zu prüfen, die Mechanismen der sensorischen Transduktion in Colon eingesetzt Afferenzen und die veränderte Erregbarkeit in Krankheitsbildern. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
In erster Linie zwei Arten von ex-Vivo Kolon Vorbereitung gemeldet wurden: die “Flat-Blatt” Vorbereitung5,9,10 und die “Tube” Vorbereitung3,4. Ein video Protokoll für die “Flat-Blatt” murinen Colorectum Vorbereitung wurde bisher erschienen11. In diesem Protokoll, die Maus Colorectum mit der PN) oder lumbale splanchnic Nerven (LSN) angeschlossen, wird geerntet und unterkühlte in einer Gewebe-Kammer. Die Colorectum ist längs aufschneiden und das Nervenbündel erstreckt sich in einem Aufnahme-Fach mit Paraffin-Öl gefüllt. Nerven-Aktivität ist eine monopolare Elektrode Platin-Iridium mit aufgenommen. Das Protokoll ermöglicht die Identifikation der rezeptiven Felder der einzelnen afferenten Fasern mittels unvoreingenommenen elektrischen Stimulation. Es lokalisiert, die Anwendung von chemischen reizen, sowie die Anwendung der verschiedenen mechanischen Stimulation Paradigmen (z.B. fokale Schleimhaut sondieren und umlaufenden Stretch), zu den afferenten Nervenendigungen. Weil der Nerv zu einer separaten Kammer aus der Gewebe-Kammer erweitert werden muss, ist es wichtig, den beigefügten Nerv relativ lange zu halten; die erfolgreiche Dissektion der Nerven stellt eine Herausforderung für die neue dieser Methodik. In jüngerer Zeit, Nullens Et Al. ein video Protokoll für die in-vitro- Aufnahme des mesenterialen Afferenzen in murinen Jejunal und Kolon Segmente12veröffentlicht. In dieser Zubereitung “Röhre” wird der Darm-Segment mit dem Mesenterium befestigt intakt, wodurch für abgestufte Blähungen und der Intra- und Extra-luminalen Verwaltung verschiedener chemischer Stoffe gehalten. Da die Mesenterium Nerven aufgezeichnet wird mit einer Absaugung Elektrode, die in der Nähe des Gewebes positioniert werden kann, kann afferenter Aktivität erfasst werden, obwohl der Mesenterium Nerv relativ kurz ist. Jedoch der Mesenterium Nerv besteht aus gemischten Populationen von vagalen und spinalen afferenten Fasern, die das Jejunum innervieren oder Kopf Unterbauch. Lumbosakralen Becken-Afferenzen innervieren die Colorectum, die in diesem Protokoll kann nicht diskriminiert zu werden. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur elektrophysiologischen Erfassung der Ratte Kolon Afferenzen mit der “Tube” Colorectum Vorbereitung mit einer intakten PG. Diese Methode kann für die Charakterisierung der funktionalen Eigenschaften der Lendenwirbelsäule splanchnic (Unterbauch) und lumbosakralen Becken-Afferenzen.
Die hier vorgestellten Protokoll ist ein relativ einfach experimentelle Methode, um die elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon Afferenzen von Ratten zu beurteilen. Das Protokoll (von Gewebe Dissektion zum Einrichten der Nerv-Aufnahme) dauert in der Regel ca. 2 Stunden in Anspruch. Gewebe-Sammlung (Schritt 3) und Vorbereitung der Saug Elektrode (Schritt 5) sind die entscheidenden Schritte. Es ist entscheidend, PG, LSN und die PN zu finden und kümmern sich nicht um das Ganglion und Nerven während Gewebe Dissektio…
The authors have nothing to disclose.
Dieses Protokoll wurde durch Forschung Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (#31171066, #81270464) und das Sino-German Science Center (GZ919) unterstützt.
Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
Capsaicin | Sigma | M2028 | |
Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
Heating bath | Grant | GR150 | |
Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
Cigarette lighter | any | NA | |
Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |