In Vitro Caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las fibras aferentes colónicas en ratas
Summary
Función sensorial anormal subyacente visceral del dolor y otros síntomas de enfermedad intestinal inflamatoria y funcional. Aquí se presenta un protocolo para el registro electrofisiológico de los nervios aferentes colónicos en una preparación de colon ex vivo rata.
Abstract
Disfunción de los nervios sensoriales colónicas ha sido implicada en la fisiopatología de varias condiciones comunes, incluyendo la diabetes y las enfermedades de intestino inflamatorias y funcional. Aquí, describimos un protocolo para la caracterización en vitro de las propiedades electrofisiológicas de los aferentes de colon en ratas. El colon, con el ganglio pélvico intacto (PG) adjuntado, se retira de la rata; sobrefundido con carbogenated solución de Krebs en la sala de grabación; y canulado en los extremos orales y anales para permitir la distensión. Se identifica un paquete del nervio fino que emana de la PG, y la actividad reciente del nervio aferente se registra utilizando un electrodo de succión. Distensión del segmento colónico provoca aumentos graduales en descarga multiunit. Se realiza un análisis de componentes principales para diferenciar el bajo umbral, el umbral alto y las fibras aferentes de rango dinámico ancho. Sensibilidad química de los aferentes colónicos puede ser estudiada a través de la administración baño o intramural de prueba compuestos. Este protocolo puede modificarse para su aplicación a otras especies, tales como ratones y conejillos de Indias y para estudiar las diferencias en las propiedades electrofisiológicas de los aferentes hipogástrica/toracolumbar y lumbosacra pélvica del colon descendente en normal y condiciones patológicas.
Introduction
El tracto gastrointestinal (TGI) es ricamente inervado con nervios aferentes extrínsecos que trasmiten las señales sensoriales del intestino al sistema nervioso central y que contribuyen a la interacción del intestino-cerebro. Excitabilidad alterada de estos aferentes extrínsecas, así como procesamiento central alterada de las entradas aferentes, es la base visceral del dolor y otros síntomas de afecciones GI, incluyendo enfermedades de intestinos inflamatoria y funcional1. Información sensorial desde el colon se transmite principalmente a través de toracolumbar/hipogástrico y los nervios sacrolumbares pélvica (PN)2. Ha habido un creciente interés en el estudio de las propiedades electrofisiológicas de estas fibras aferentes primarias en modelos de roedores de la enfermedad. Sin embargo, en vivo grabaciones electrofisiológicas de los aferentes colon en los roedores es un desafío técnico y requiere considerables habilidades quirúrgicas. Además, cambios hemodinámicos, el movimiento de tejido y anestésicos también pueden afectar actividad del nervio y sensibilidad a la prueba estímulos en vivo. Por lo tanto, en los últimos años, un creciente número de estudios ha empleado en vitro (ex vivo) preparados de diferentes especies, incluyendo ratones, ratas, conejillos de Indias y los seres humanos, a examinar los mecanismos de transducción sensorial en colon aferentes y la excitabilidad alterada en condiciones de enfermedad. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Principalmente se han reportado dos tipos de ex vivo de colon preparación: la preparación de la “hoja plana”5,9,10 y el “tubo” preparación3,4. Un video protocolo para la preparación de colon murino “hoja plana” ha sido previamente publicado11. En el presente Protocolo, el colon de ratón, con el PN) o los nervios esplácnicos lumbares (LSN) Unidos, es cosechada y sobrefundido en una cámara de tejido. El colon es abrir longitudinalmente, y el paquete del nervio que se extiende en un compartimiento de grabación llenado de aceite de parafina. Actividad del nervio es registrada mediante un electrodo monopolar de platino-iridio. El protocolo permite la identificación de los campos receptivos de las fibras aferentes individuales mediante el uso de estimulación eléctrica imparcial. Localiza la aplicación de estímulos químicos, así como la aplicación de paradigmas de estimulación mecánica diferentes (por ejemplo, focal mucosa sondeo y estiramiento circunferencial), a las terminaciones nerviosas aferentes. Debido a que el nervio debe ampliarse a una cámara separada de la cámara de tejido, es crítico para mantener el nervio conectado relativamente largo; la disección exitosa de los nervios plantea un desafío a los nuevos a esta metodología. Más recientemente, Nullens et al. publicó un protocolo de vídeo para la grabación en vitro de los aferentes mesentéricas yeyunal murino y segmentos colónicos12. En la preparación de este “tubo”, el segmento de intestino con el mesenterio Unido se mantiene intacto, lo que permite la distensión gradual y la administración intra y extra luminal de diferentes productos químicos. Puesto que el nervio del mesenterio se registra utilizando un electrodo de succión, que puede colocarse cerca del tejido, se puede grabar actividad aferente a pesar de que el nervio del mesenterio es relativamente corto. Sin embargo, el nervio de mesenterio consiste en poblaciones mixtas de fibras aferentes vagales y espinales que inervan el yeyuno o toracolumbar hipogástrica. Lumbosacra pélvicos aferentes inervan el colon, que no puede ser discriminado en el presente Protocolo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el registro electrofisiológico de aferentes colon de rata mediante la preparación de colon “tubo” con un PG intacto Este método puede permitir la caracterización de las propiedades funcionales de lumbar esplácnico (hipogástrica) y aferentes pélvico lumbosacra.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí es un método experimental relativamente sencillo para determinar las propiedades electrofisiológicas de las aferentes colon de ratas. El protocolo (de disección del tejido para configurar la grabación de nervio) generalmente toma aproximadamente 2 horas para completar. Tejido (paso 3) y preparación de la toma de aspiración (paso 5) son los pasos críticos. Es crucial para poder localizar el PG, el LSN y el PN y tenga cuidado de no para dañar el ganglio y nervios durante la disección …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este protocolo fue apoyado por becas de investigación de la Ciencia Natural la Fundación de China nacional (#31171066, #81270464) y el centro de Ciencias de China-alemán (GZ919).
Materials
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
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