Abnormale sensorische functie ten grondslag ligt aan viscerale pijn en andere symptomen van functionele en inflammatoire darmziekten. Een protocol voor het elektrofysiologische opname van de Colon afferent zenuwen in een ex vivo -voorbereiding van het rat-colorectum wordt hier gepresenteerd.
Dysfunctie van het Colon sensorische zenuwen heeft betrokken bij de pathofysiologie van verschillende gemeenschappelijke voorwaarden, met inbegrip van functionele en inflammatoire darmziekten en diabetes. Hier beschrijven we een protocol voor de in vitro -karakterisering van de elektrofysiologische eigenschappen van Colon afferents bij ratten. De colorectum, met de intact bekken ganglion (PG) aangesloten, wordt verwijderd uit de rat; superfused met carbogenated Krebs oplossing in de vergaderzaal van de opname; en gecanuleerde aan de uiteinden van het oraal en anaal te voorzien van de zwelling. Een bundel van de fijne zenuwen die afkomstig zijn van de PG is geïdentificeerd, en de activiteit van multiunit afferent zenuw is opgenomen met behulp van een zuignap elektrode. Zwelling van het Colon segment lokt geleidelijke stijgingen van de multiunit kwijting. Een analyse van de belangrijkste component is uitgevoerd om te differentiëren van de laagdrempelige, de hoge-drempel en de wide-Dynamiekomvang afferent vezels. Chemische gevoeligheid van Colon afferents kan worden bestudeerd door de administratie van het bad of intraluminale van test verbindingen. Dit protocol kan worden aangepast voor toepassing op andere diersoorten, zoals muizen en cavia’s, en te bestuderen van de verschillen in de elektrofysiologische eigenschappen van thoracolumbar/hypogastric en lumbosacrale/bekken afferents van de dalende dikke darm in normale en pathologische condities.
Het maag-darmkanaal (GIT) is rijkelijk geïnnerveerd met extrinsieke afferent zenuwen die vervoeren sensorische signalen van de darm naar het centrale zenuwstelsel en die bijdragen aan de gut-brain-interactie. Gewijzigde prikkelbaarheid van deze extrinsieke afferents, evenals gewijzigde centrale verwerking van de afferent ingangen, ten grondslag ligt aan viscerale pijn en andere symptomen van GI voorwaarden, met inbegrip van functionele en ontstekingsziekten darm ziekten1. Sensorische informatie van de colorectum wordt voornamelijk via de thoracolumbar/hypogastric en de lumbosacrale/bekken zenuwen (PN)2overgebracht. Er is een verhoogde belangstelling bestuderen de elektrofysiologische eigenschappen van deze primaire afferent vezels in knaagdier ziekte modellen. Echter, in vivo elektrofysiologische registraties van de Colon afferents in knaagdieren is een technische uitdaging en vereist aanzienlijke chirurgische vaardigheden. Daarnaast hemodynamische wijzigingen, weefsel beweging en verdoving kunnen ook gevolgen hebben zenuw activiteit en gevoeligheid voor prikkels in vivotest. Daarom, in de afgelopen jaren hebben een toenemend aantal studies tewerkgesteld in vitro (ex vivo) preparaten voor de mens, verschillende soorten, waaronder muizen, ratten en cavia’s te onderzoeken van de mechanismen van sensorische signaaltransductie in Colon afferents en de gewijzigde prikkelbaarheid in ziekten. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Er zijn voornamelijk twee soorten ex vivo Colon voorbereiding gemeld: de “flat-blad” voorbereiding5,9,10 en de “buis” voorbereiding3,4. Een video protocol voor de “flat-blad” lymfkliertest colorectum voorbereiding geweest eerder gepubliceerde11. In dit protocol, de muis colorectum, met de PN) of lumbale splanchnic zenuwen (LSN) aangesloten, is gekapt en superfused in een kamer van het weefsel. De colorectum is opengesneden lengterichting en de zenuw bundel wordt uitgebreid tot een opname compartiment gevuld met paraffineolie. Zenuw activiteit is opgenomen met behulp van een monopolaire platina-iridium-elektrode. Het protocol voorziet in de identificatie van de Receptieve velden van individuele afferent vezels met behulp van onbevooroordeelde elektrische stimulatie. Het lokaliseert de toepassing van chemische stimuli, alsmede de toepassing van verschillende mechanische stimulatie paradigma’s (bijvoorbeeld focal mucosal indringende en ze stretch), aan de afferent zenuwuiteinden. Omdat de zenuw moet worden uitgebreid tot een aparte kamer uit de zaal weefsel, is het essentieel om te houden van de bijgevoegde zenuw relatief lang; de succesvolle dissectie van de zenuwen vormt een uitdaging voor die nieuw aan deze methode. Meer recentelijk gepubliceerd Nullens et al. een video protocol voor de in vitro -opname van de lymfklieren afferents in lymfkliertest jejunal en Colon segmenten12. In deze voorbereiding “tube” is het segment van de darm met het mesenterium aangesloten bewaard gebleven, waardoor voor gesorteerde zwelling en de intra – en extra-luminal administratie van verschillende chemische stoffen. Aangezien het mesenterium zenuw is opgenomen met behulp van een zuignap elektrode, die kan worden geplaatst dicht bij het weefsel, kan afferent activiteit worden opgenomen, hoewel het mesenterium zenuw relatief kort is. Echter, het mesenterium zenuw bestaat uit gemengde bevolking van vagale en spinale afferent vezels die het jejunum innervate of thoracolumbar hypogastric. Lumbosacraal bekken afferents innervate de colorectum, die in dit protocol kan niet worden gediscrimineerd. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het elektrofysiologische opname van Colon afferents rat met behulp van de “buis” colorectum opstelling met een intact PG. Deze methode kan toestaan voor de karakterisatie van de functionele eigenschappen van lumbale splanchnic (hypogastric) en lumbosacrale bekken afferents.
Het protocol hier gepresenteerd is een relatief eenvoudig experimentele methode te beoordelen van de elektrofysiologische eigenschappen van het Colon afferents van ratten. Het protocol (van weefsel dissectie voor het opzetten van de opname van de zenuw) duurt meestal ongeveer 2 uur om te voltooien. Weefsel-collectie (stap 3) en de voorbereiding van de zuiging elektrode (stap 5) zijn de kritische stappen. Het is van cruciaal belang om te kunnen om de PG, de LSN, en de PN te vinden en te verzorgen niet te beschadigen de ga…
The authors have nothing to disclose.
Dit protocol werd ondersteund door onderzoekssubsidies uit de nationale Natural Science Foundation van China (#31171066, #81270464) en de Sino-Duitse Science Center (GZ919).
Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
Capsaicin | Sigma | M2028 | |
Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
Heating bath | Grant | GR150 | |
Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
Cigarette lighter | any | NA | |
Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |