Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Поколение модели хронической обструктивной болезни легких у мышей, воздействие неоднократные озона

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/56095
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

Summary

Это исследование описывает успешное поколения новой модели животных хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), постоянно подвергая мышей в высоких концентрациях озона.

Abstract

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) характеризуется стойким воздуха ограничение и легких Паренхиматозный уничтожения. Она имеет очень высокую распространенность в стареющего населения. Текущий обычной терапии для ХОБЛ сосредоточиться главным образом на симптом изменение наркотиков; Таким образом срочно необходима разработка новых методов лечения. Квалифицированных Животные модели ХОБЛ может помочь охарактеризовать основные механизмы и может быть использован для скрининга новых наркотиков. Текущие модели ХОБЛ, таких как липополисахарида (LPS) или свинину Панкреатическая эластаза (СИЗ)-индуцированного эмфиземы модель, генерировать ХОБЛ как поражения в легких и дыхательных путях, но не иначе напоминают патогенеза человека ХОБЛ. Сигаретный дым (CS)-индуцированной модели остается одним из самых популярных, потому что он не только имитирует ХОБЛ как поражения дыхательной системы, но он также основан на одной из главных опасных материалов, которые вызывает ХОБЛ в организме человека. Однако длительным и трудоемким аспекты модели CS-индуцированной резко ограничивают его применение в новых наркотиков скрининг. В этом исследовании мы успешно создала новую модель ХОБЛ, подвергая мышей высокие уровни озона. Эта модель продемонстрировал следующее: 1) уменьшилась принудительного выдоха объем 25, 50 и 75/принудительном жизненной емкости (ОФВ25/FVC, ОФВ50/FVC и FEV75/FVC), указывающее ухудшением функции легких; 2) расширенного легких альвеолы, с легкого Паренхиматозный уничтожения; 3) сокращено время усталость и расстояния; и 4) увеличилась воспаление. Вместе взятые, эти данные показывают, что озонового воздействия (OE) модель является моделью надежный животных, которая похожа на людей, потому что длительное воздействие озона является одним из этиологических факторов ХОБЛ. Кроме того он только взял 6-8 недель, основанный на нашей предыдущей работы, для создания модели OE, в то время как она требует 3-12 месяцев, чтобы побудить модель сигаретный дым, указав, что OE модель может быть хорошим выбором для ХОБЛ исследований.

Introduction

Было подсчитано, что ХОБЛ, включая хронический бронхит и эмфизема может быть третьей ведущей причиной смерти в мире в 2020 году1,2. 12,7% мужчин и 8,3% в женщин в течение следующих 40 лет3оценивается потенциальных случаев ХОБЛ в популяции старше 40 лет. В настоящее время нет лекарства доступны вспять прогрессивного ухудшения больных ХОБЛ4. Надежные животных модели ХОБЛ не только требуют имитация болезнь патологического процесса, но также требуют период коротких поколения. Текущие модели ХОБЛ, включая ЛПС или PPE-индуцированной модели, может вызвать симптомы эмфиземы5,6. Единой администрации или недельной вызов ПЛАСТИНОК или СИЗ мышей или крыс результаты в отмеченные нейтрофилия Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF), увеличение провоспалительных медиаторов (например, ФНО α и IL-1β) в BALF или сыворотки, производит легких Паренхиматозный уничтожения расширенных воздушные пространства и ограничения потока воздуха5,6,,78,9,10. Однако ПЛАСТИНОК или СИЗ не являются причинами человеческого ХОБЛ и таким образом не имитировать патологического процесса11. Модель CS-индуцированной производится постоянный поток воздуха ограничение, Паренхиматозный уничтожение легких и снижение функциональной дееспособности. Однако традиционные CS протокол требует по крайней мере 3 месяца для создания ХОБЛ модель12,13,14,15. Таким образом важно генерировать новые, более эффективные животных модель, которая отвечает двум требованиям.

Недавно в дополнение к курить сигареты, загрязнения воздуха и подверженностью стали более распространенными причинами ХОБЛ16,17,18. Озон, как один из основных загрязнителей (хотя не основных компонентов загрязнения воздуха), можно непосредственно реагируют с дыхательных путей и повреждение легочной ткани как детей, так и молодые взрослые19,20,21 ,-22,-23,-24,-25. Озона, а также других стимуляторов, включая LPS, СИЗ и CS, участвуют в серьезной биохимических путей легких оксидативного стресса и повреждение ДНК и связаны с инициирование и поощрение ХОБЛ26,27. Еще одним фактором является, что симптомы некоторых больных ХОБЛ ухудшаться после воздействия озона, указав, что озон может нарушить легких функции18,,2829. Таким образом мы создали новую модель ХОБЛ, постоянно подвергая мышей в высоких концентрациях озона за 7 недель; Это привело к воздуха дефекты и повреждения легких Паренхиматозный аналогичны предыдущих расследований30,,3132. Мы расширенный протокол OE для самок мышей в этом исследовании и успешно воспроизведен эмфизема, наблюдается у мышей-самцов в наших предыдущих исследований30,31,32. Потому что ХОБЛ смертность снизилась в мужчин, но увеличение женщин во многих странах33, ХОБЛ модель в женщин необходима для изучения механизмов и разработки терапевтических методов для женщин больных ХОБЛ. Применимость модели OE для всех полов одалживает дальнейшей поддержки его использования в качестве модели ХОБЛ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: OE модель создается и используется в сообщалось ранее исследований 30 , , 31 32. Все эксперименты на животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Шанхайского университета Цзяотун.

1. мышей

  1. дом возбудителя бесплатно, 7 - до 9-недельных самок мышей BALB/c в отдельных клетках вентилируемых в животное фонда под управлением (20 ° C) температуры и влажности (40-60%). Обеспечивают 12 h света и темные цикл 12 h в объекте. Предоставления продовольствия и воды ad libitum.

2. Озон или воздействия воздуха

  1. формирования озона с электрическим генератором в коробке запечатывания акрила (например полиметилметакрилат). Blow воздух из окна с помощью небольшой воздуходувки через вентиляционную трубу воздуха, который подключен на внутри и за пределами коробки. Контролировать концентрацию озона в поле с помощью зонда озона. Подождите до тех пор, пока концентрация озона в поле достигает 2,5 частей на миллион (ppm).
    Примечание: Озон зонд может автоматически переключаться генератора озона или выключить и может поддерживать уровень озона в поле в 2,5 млн.
  2. Место мышей в поле, когда уровень озона достигает 2,5 ppm. Держите мышей в поле 3 часа каждый раз подвергать их озона.
    Примечание: Поле может поддерживать уровень озона 2,5 ppm в течение 3 ч, автоматически переключаясь генератора озона или выключить и дует CO 2, что производится мышей из коробки.
  3. Дать два воздействия озона (каждый воздействия продолжительностью 3 часа) в неделю (один раз каждые 3 дня) за 7 недель; разоблачить управления мыши воздуха в то же время и за тот же период.

3. Микро Компьютерная томография

  1. в конце недели 7, анестезировать мышей с внутрибрюшинного введения pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 мл/100 г) корректировать дозу согласно отдельным ситуациям, чтобы увидеть, что мышь не реагировать на мыс пинча. монитор и держать мышь на частоте устойчивый дыхания; и убедитесь, что существуют без добровольных движений во время процедур.
  2. Место наркотизированных мышей в палате Микро Компьютерная томография (µCT).
  3. Калибровка µCT, используя стандартный протокол и производитель ' s инструкции. Установка Рентгеновская трубка 50 кв и ток на 450 МКА.
    Примечание: Оба рентген и детектор вращаться вокруг мышей.
  4. Анализ µCT путем приобретения 515 прогнозы с эффективных пикселей размером 0,092 мм, время экспозиции 300 мс для одного фрагмента и толшины 0,093 мм.
  5. Восстановить легких с изображений с помощью программного обеспечения. Отрегулируйте яркость изображения grayscale, установив минимум и максимум серого-750 и-550 Hounsfield единиц, соответственно.
    Примечание: Программное обеспечение автоматически рассчитает объемы паренхимы легких и низким затухание площадь (LAA) 34 , 35.
  6. Вычислить процент LAA (LAA %), разделив объем ЛАА по объему всего легкого.

4. Беговая дорожка тест

  1. дать мышей в адаптации тест со скоростью 10 м/мин 10 мин на работающей третбан машины. Примечание: электричество это всегда выключен, когда проводится процедура.
  2. Администрирование испытания на мышах.
    1. Разогреть мышей со скоростью 10 м/мин за 5 мин.
    2. Увеличить скорость до 15 м/мин за 10 мин.
    3. Увеличение интенсивности упражнений: увеличение скорости, 5 м/мин, начиная с 20 м/мин, каждые 30 мин до мышей не может продолжать работать 36.
  3. Запись всего работает расстояние и время выполнения как расстояние усталость и усталость время, соответственно.

5. легочной функции измерения

  1. анестезировать мышей с внутрибрюшинного введения pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 мл/100 г) корректировать дозу согласно отдельным ситуациям, чтобы увидеть, что мышь не не реагировать на щепотку мыс и подождите, пока мышей сохранили спонтанное дыхание. монитор и держать мышь на частоте устойчивый дыхания; и убедитесь, что существуют без добровольных движений во время процедур.
  2. Тщательно tracheostomize мышей и поместите их в тело плетизмографа который подключен к компьютерным управлением вентилятора.
    Примечание: Вентиляции контролируется через клапан расположен проксимально эндотрахеальной трубки. Программа установки предоставляет различные полуавтоматический маневров, включая маневр квазистатического давления объем и маневр объемом быстрый поток.
  3. Навязать среднем дыхание частотой 150 вдохов/мин на наркотизированных мыши через давления контролируемой вентиляции до шаблон регулярного дыхания и полного истечения на каждый цикл дыхания получается.
  4. Выполнить маневр квазистатического давления объем с устройством с помощью отрицательного давления, сгенерирована плетизмограф.
  5. Выполнить маневр объемом быстрый поток в квази-статических давления объем петли для записи ФЖЕЛ и FEV. Надуть легких + 30 см H 2 O и сразу же потом подключить его к весьма отрицательное давление для обеспечения действия до остаточный объем в-30 см H 2 O. запись ОФВ в первые 25, 50 и 75 МС выдоха (ОФВ 25 ОФВ 50 и 75 FEV, соответственно). Отклонить субоптимальные маневров. Для каждого испытания с каждой мыши, провести как минимум три приемлемых маневров для получения надежным средством для всех числовых параметров.

6. Коллекция BALF

  1. после терминала анестезии с pelltobarbitalum natricum ((1%, 1,8-2,4 мл/100 г) корректировать дозу согласно отдельным ситуациям, чтобы увидеть, что мышь не реагировать щепотку мыс и потерять дыхание), промывание мышей с 2 мл PBS через эндотрахеальную трубку 1 мм в диаметре и затем извлечь BALF 10.
  2. Бассейн проверено промывание аликвоты и центрифуги их на 4 ° C и 250 g x 10 мин
  3. Собирать супернатант для немедленного использования и хранить остаток на-80 ° C или жидкого азота.
  4. Подсчитать общее количество клеток с использованием Горяева.
  5. Ресуспензируйте Пелле клеток в PBS и затем спина (1400 x g, 6 мин) 250 мкл ресуспензированы клеток на слайды с помощью центрифуги спиннер слайд.
  6. Применять Райт пятная для клеток на слайды по заявлению производителя ' протокол s.
  7. Количество 200 клеток / мыши; идентифицировать клетки как макрофаги и нейтрофилы, согласно стандартным морфологии, при 400-кратном; и подсчитать их количество.

7. Кардиологических проб крови

  1. сбора крови через сердца прокол, загрузить его в 1,5 мл пробирок и держать его на льду на 30 мин
  2. Центрифугуйте образцы крови за 5 мин на 2000 x g и 4 ° C.
  3. Передачи супернатант (серум) для новой трубки и хранить его на-80 ° C или жидкого азота.
  4. Подготовить сыворотки для ИЛ 1β, Ил-10 и ФНО α обнаружения тестов с помощью соответствующих наборов ИФА.

8. Морфометрический анализ легких

  1. вскрыть легких и трахеи от мышей.
    1. Позиция каждого Усыпленных мыши на доске хирургической сразу же после жертвоприношения.
    2. От вскрыть подкожная мышца шеи и передней трахеи мышцы, чтобы визуализировать и доступ к кольца трахеи.
    3. Открыть вверх грудной полости. Вскрыть легкие и трахею, но не отдельные сердце от легких.
  2. Подключить эндотрахеальной катетер к шприцу, содержащие параформальдегида 4% через трубки полиэтиленовые PE90.
    Предупреждение: Параформальдегида является токсичным. Надевайте перчатки и защитные очки и использовать решение внутри зонта.
  3. Надуть легких, полностью используя параформальдегида 4% (10 капель, ~ 200 мкл) через эндотрахеальную катетер. Удаление сердце после завершения инфляции.
  4. Поддерживать легких в 15 мл, содержащие 10 мл параформальдегида 4% для по крайней мере 4-х.
  5. Внедрить легких в парафин. Получите 5-мкм разделы блоком парафина, секционирование с Ротари микротома. При резании, предоставляют максимальную площадь поверхности легочной ткани в области бронхиального дерева.
  6. Для анализа морфометрических, выполняют гематоксилином и эозином (H & E) пятная на участках.
  7. Изображение разделы с ярко поле вертикально микроскопа (объектив, 20 X; время экспозиции, 1.667 ms).
  8. Имеют два следователя, ослепленный протокол лечения самостоятельно рассчитывать Гистологические срезы. Среднее линейное перехвата (L m) можно используйте в качестве параметра для измерения расстояния между альвеолярного межжелудочковой перегородки стены. Определить Л м, используя следующие шаги:
    1. откройте изображения секций в Photoshop и нарисовать ридикюль сетку на изображение с пятью 550 мкм длинные линии.
    2. Количество альвеол через линию сетки.
    3. Вычислить Л м, длина линии сетки путем деления на количество альвеол. Для количественной оценки изображения пяти секций на мышь. Получение десять образов каждого раздела (одно изображение на поле) и оценить случайным образом. Во время выбора поля, Избегайте полей airways и сосудов перемещая одно поле впереди или в другом направлении.
      Примечание: Данные представлены как среднее ± S.E.M. ООН парный t тест был проведен для сравнения между воздействию воздуха мышей и воздействию озона мышей. Три животных каждой группы были использованы для расчета существенной разницы. P значение < 0,05 считался значительным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Примеры изображений 3D µCT каждой группы отображаются на рисунке 1. Воздействию озона мышей были значительно больший объем всего легкого (рис. 1и b) и LAA % (рис. 1c) чем воздействию воздуха управления мышей. Объем легких и LAA % остается повышенным после шести недель озонового воздействия31,32. Увеличение легких объем и LAA % представляют фенотип эмфиземы. Примерах формирование эмфиземы легких альвеолярного расширения на рисунке 2 . Увеличение средней линейной перехвата (Lm) было отмечено в подвергшихся воздействию озона мышей (рис. 2b), которые подтвердили, что легких Паренхиматозный разрушения произошли после воздействия озона.

Легочную функцию была измерена скорость параметрами воздуха, показанный как ОФВ25/FVC, ОФВ50/FVC и FEV75/FVC. Результаты показали, что все параметры, которые снизились в подвергшихся воздействию озона мышей (рис. 3a-c) согласуются с типичной легких функциональных дефектов в4,больных ХОБЛ37. Для дальнейшей оценки OE модель, мы провели проверку терпимости упражнения, заменяемого на 6-мин ходьбы тест (6MWT)38,39, который обычно используется для оценки изменений в функциональной дееспособности в больных ХОБЛ. Воздействие озона значительно сократили расстояние время и усталость усталость (рис. 4и b).

Для решения патогенеза ХОБЛ в OE модели, макрофаги и нейтрофилы были подсчитаны от BALFs мышей; в мыши sera были обнаружены провоспалительных цитокинов (ИЛ 1β и TNF-α) и противовоспалительных цитокинов (Ил-10). Воздействию озона мышей показало значительное увеличение воспалительные клетки, макрофаги и нейтрофилы (рис. 5a-c), а также значительное снижение в Ил-10 и увеличение в IL-1β и ФНО α (рис. 6a-c ). Все данные показали, что OE модель резюмировалась человека ХОБЛ подобные симптомы.

Figure 1
Рисунок 1. Воздействие озона увеличили объем легких и LAA % обнаруживаемых µCT. () представитель 3D изображения, показывая легкие воздуха или озона подвергаются мышей на 7 недель после соответствующей экспозиции. (b) отдельных всего легкого томов двух групп были извлечены из 3D изображения для статистики. Воздействию озона мышей показало значительное увеличение объема общего легких. (c) индивидуальных и среднее LAA % этих двух групп. Воздействию озона мышей показало значительное увеличение в LAA %. Красный цвет указывает LAA (вокселей с плотностью Hounsfield 2550-2700 единиц). Трахеи и бронхов, показано красным цветом на рисунке были удалены для вычисления легких LAA. Данные представлены как среднее ± S.E.M. ** P < 0.01, *** P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Воздействие озона увеличилось л. (a) представитель микроскопии легких альвеолярного пространств в он окрашенных участков воздействию воздуха или воздействию озона мышей. (b) отдельные значения Lm были количественно из легких разделы двух групп для статистики. Воздействию озона мышей наблюдалось увеличение Lm. Данные представлены как среднее ± S.E.M. ** P < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Воздействие озона снижение легочной функции. (a-c) Для воздуха, воздействию и воздействию озона мышей, индивидуальный ОФВ в первые 25, 50 и 75 МС быстро истечения (ОФВ25, ОФВ50и75FEV, соответственно), а также ФЖЕЛ, все были записаны. Проценты ОФВ25, ОФВ50и75 ОФВ для ФЖЕЛ были рассчитаны отдельно. ОФВ25/FVC, ОФВ50/FVC и FEV75/FVC все уменьшилось воздействию озона значительно в мышей. Данные представлены как среднее ± S.E.M. * P < 0,05, ** P < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Воздействие озона сократилось время усталость и усталость расстояние. () индивидуальный работающий раз для воздуха или озона воздействию мышей были записаны. Воздействию озона мышей показало значительное уменьшение в времени усталости. (b) индивидуальные работает расстояния двух групп были записаны. Воздействию озона мышей выставлены значительное снижение усталости расстояния. Данные представлены как среднее ± S.E.M. * P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . Воспалительные клетки отсчитывается от BALF. () индивидуальных и среднее количество всего клетки (всего) в воздух или озона подвергаются мышей. (b) индивидуальных и среднее количество макрофагов (MAC) в двух группах. (c) индивидуальных и среднее число нейтрофилов (NEU) в двух группах. Данные представлены как среднее ± S.E.M. * P < 0,05, ** P < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

а страница = «1» >Figure 6
Рисунок 6 . Обнаружение воспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке. () индивидуальных и средние значения количество Ил-10 в воздействию воздуха или озона мышей. (b) индивидуальных и средние значения количество ИЛ 1β в двух группах. (c) индивидуальных и средние значения количество ФНО α в двух группах. Данные представлены как среднее ± S.E.M. * P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании мы представляем надежный метод для создания новой модели ХОБЛ. По сравнению с другими моделями (т.е., ПЛАСТИНОК или СИЗ модели), эта модель OE резюмирует патологического процесса больных ХОБЛ. Потому что сигаретного дыма является основным опасных материалов, что вызывает ХОБЛ в человека пациентов40, модель CS остается наиболее популярным ХОБЛ модель41,42. Однако, модель CS требует 3 - 12-месячный R & D период для новых лекарств. По сравнению с моделью CS, текущая модель OE уменьшает период поколения до 6-8 недель. Мы наблюдали эмфизема легких у мышей-самцов после 6 недель воздействия озона в наших предыдущих исследований30,31,32. В этом исследовании мы применяется протокол OE для самок мышей за 7 недель и успешно создан женский модель OE. Потому что было сообщено, что ХОБЛ смертности снизился в мужчин, но увеличилось в женщин в некоторых странах33, это необходимо для изучения патогенетических механизмов и разработать подходы лечения для женщин больных ХОБЛ, используя женской модели ХОБЛ. Мы знаем, что вышеупомянутые ХОБЛ модели (то есть, LPS, СИЗ и CS) могут работать в обоих мужчин и женщин животных43. Целью этой работы было предложить дополнительные модель ХОБЛ, резюмирует патологический процесс ХОБЛ и требует очень короткий период поколения.

Ключевым шагом для создания этой модели был подвергая мышей озона (на уровне 2,5 ppm) два раза в неделю (один раз каждые 3 дня) по 6-8 недель (в этом исследовании, мы использовали 7 недель, хотя мы не пробовали эскалации дозы). Контроля критических параметров частоты воздействия и концентрации озона, мы успешно воспроизведена эмфиземы мужчины C57BL/6 мышей31,32, мужской мышей BALB/c30и самок мышей BALB/c (текущий исследование). Фенотип эмфиземы в результате воздействия озона, с воздуха ограничение и легких Паренхиматозный уничтожения аналогичные изменения, видел в ХОБЛ больные44,45.

По-прежнему существуют ограничения для данного исследования. К примеру потому что патогенез человека ХОБЛ связана с Анатомия легких, идеальная модель ХОБЛ должны создаваться в животных, имеющих легочной анатомической структуре похож на людей. По сравнению с крупных животных, мелких домашних животных обладают даже менее обширные сократимость, ветвление чем люди46. Мы должны признать, что было бы более целесообразно создать модель ХОБЛ в крупных животных. Однако это очень трудно установить крупномасштабных моделей в животных. Еще одним ограничением этой модели является ее клиническое значение. Хотя он уверен, что озон может реагировать с дыхательных путей и повреждения легких тканей19,22, и хотя есть свидетельства того, что симптомы некоторых больных ХОБЛ ухудшаться после воздействия озона28, Озон не является главной причиной у больных ХОБЛ. Однако мы по-прежнему предлагая и использование этой модели OE, потому что озона и CS повредить дыхательную систему, вызывая воспаление и привести к окислительному стрессу26,27. Таким образом новый препарат, который может assumably лечения ХОБЛ в OE модели можно также работать в модели CS и поэтому потенциально быть разработаны для больных ХОБЛ.

Применение модели OE не ограничиваются расшифровка молекулярных и клеточных механизмов ХОБЛ. Наши две недавние документы также исследованы эффективность N-ацетилцистеин (NAC)31 и32 NaHS (внешних доноров H2S) в лечении ХОБЛ через экзогенные администрации двух препаратов в OE модель. В первом исследовании мы нашли вспять сократимость гипер оперативность и сокращение сократимость гладкой мышечной массы после отправления нац. Эти эффекты могут указывать основу для потенциальных клинические преимущества НАК в больных ХОБЛ31. Во втором исследовании модели OE мы обнаружили, что администрация экзогенных NaHS вспять воспаление легких и частично отменил особенности эмфиземы. Таким образом с этой моделью OE, мы в предварительном исследовании показали, что NaHS могут быть разработаны как потенциального кандидата наркотиков для больных ХОБЛ32. Таким образом OE модель имеет потенциальные приложения как механизма исследований и наркотиков скрининг для ХОБЛ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Z.W.S. и W.W. являются нынешние работники и держатели опционов группы сотовой биомедицины (NASDAQ: CBMG). Другие авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить благодарность г-н Цинь Boyin (Шанхай общественного здравоохранения клинический центр) для оказания технической помощи с µCT оценки в настоящем Протоколе.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c mice Slac Laboratory Animal,Shanghai, China N/A 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages Suhang, Shanghai, China Model Number: MU64S7 The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box Suhang, Shanghai, China N/A The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany Model 500  The device was used for generating ozone.
Ozone probe ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK Ozone 300 The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum Sigma, St. Louis, MO, USA P3761 Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography GE Healthcare, London, ON, Canada RS0800639-0075 This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software GE Healthcare, London, ON, Canada Micro-view 2.01  This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine  Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China DSPT-208 This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge Denville Scientific, Holliston, MA, USA C1183  It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining Hanhong, Shanghai, China RE04000054  It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer Hausser Scientific, Horsham, PA, USA 4000 It was used to count cells.
IL-1β Abcam, Cambridge, MA, USA ab100704 They were used to test the respective factors in serum.
IL-10 Abcam, Cambridge, MA, USA ab46103 They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α Abcam, Cambridge, MA, USA ab100747 They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde  Sigma, St. Louis, MO, USA P6148 The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin Hualing, Shanghai, China 56# It was used to embed the lung.
Rotary Microtome Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany RM2255 It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution Solarbio, Beijing, China G1120 H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope Olympus, Center Valley, PA, USA CX41 It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12 Adobe, San Jose, CA, USA Adobe Photoshop 12 It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5 Graphpad Software Inc., San Diego, CA GraphPad prism 5 It was used for data analysis and production of figures.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
  2. Chapman, K. R., et al. Epidemiology and costs of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 27, 188-207 (2006).
  3. Afonso, A. S., Verhamme, K. M., Sturkenboom, M. C., Brusselle, G. G. COPD in the general population: prevalence, incidence and survival. Respir Med. 105, 1872-1884 (2011).
  4. Rabe, K. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am J Respir Crit Care Med. 176, 532-555 (2007).
  5. Ogata-Suetsugu, S., et al. Amphiregulin suppresses epithelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. Biochem Biophys Res Communi. 484, 422-428 (2017).
  6. Oliveira, M. V., et al. Characterization of a Mouse Model of Emphysema Induced by Multiple Instillations of Low-Dose Elastase. Front Physiol. 7, 457 (2016).
  7. Vernooy, J. H., Dentener, M. A., van Suylen, R. J., Buurman, W. A., Wouters, E. F. Long-term intratracheal lipopolysaccharide exposure in mice results in chronic lung inflammation and persistent pathology. Am J Respir Cell Mol Biol. 26, 152-159 (2002).
  8. Birrell, M. A., et al. Role of matrix metalloproteinases in the inflammatory response in human airway cell-based assays and in rodent models of airway disease. J Pharm Exp Ther. 318, 741-750 (2006).
  9. Gamze, K., et al. Effect of bosentan on the production of proinflammatory cytokines in a rat model of emphysema. Exp Mol Med. 39, 614-620 (2007).
  10. Vanoirbeek, J. A., et al. Noninvasive and invasive pulmonary function in mouse models of obstructive and restrictive respiratory diseases. Am J Respir Cell Mol Biol. 42, 96-104 (2010).
  11. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 1-15 (2008).
  12. Huh, J. W., et al. Bone marrow cells repair cigarette smoke-induced emphysema in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, 255-266 (2011).
  13. Schweitzer, K. S., et al. Adipose stem cell treatment in mice attenuates lung and systemic injury induced by cigarette smoking. Am J Respir Crit Care Med. 183, 215-225 (2011).
  14. Guan, X. J., et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung and pulmonary function partly via VEGF-VEGF receptors. J Cell Biochem. 114, 323-335 (2013).
  15. Gu, W., et al. Mesenchymal stem cells alleviate airway inflammation and emphysema in COPD through down-regulation of cyclooxygenase-2 via p38 and ERK MAPK pathways. Sci Rep. 5, 8733 (2015).
  16. Cordasco, E. M., VanOrdstrand, H. S. Air pollution and COPD. Postgrad Med. 62, 124-127 (1977).
  17. Berend, N. Contribution of air pollution to COPD and small airway dysfunction. Respirology. 21, 237-244 (2016).
  18. DeVries, R., Kriebel, D., Sama, S. Outdoor Air Pollution and COPD-Related Emergency Department Visits, Hospital Admissions, and Mortality: A Meta-Analysis. COPD. 14 (1), 113-121 (2016).
  19. Penha, P. D., Amaral, L., Werthamer, S. Ozone air pollutants and lung damage. IMS Ind Med Surg. 41, 17-20 (1972).
  20. Stern, B. R., et al. Air pollution and childhood respiratory health: exposure to sulfate and ozone in 10 Canadian rural communities. Environ Res. 66, 125-142 (1994).
  21. Tager, I. B., et al. Chronic exposure to ambient ozone and lung function in young adults. Epidemiology. 16, 751-759 (2005).
  22. Romieu, I., Castro-Giner, F., Kunzli, N., Sunyer, J. Air pollution, oxidative stress and dietary supplementation: a review. Eur Respir J. 31, 179-197 (2008).
  23. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54, 5185-5197 (2015).
  24. Chu, H., et al. Comparison of lung damage in mice exposed to black carbon particles and ozone-oxidized black carbon particles. Sci Total Environ. 573, 303-312 (2016).
  25. Jin, M., et al. MAP4K4 deficiency in CD4(+) T cells aggravates lung damage induced by ozone-oxidized black carbon particles. Environ Toxicol Pharmacol. 46, 246-254 (2016).
  26. Brusselle, G. G., Joos, G. F., Bracke, K. R. New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 378, 1015-1026 (2011).
  27. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K., Loridas, S. Pulmonary oxidative stress, inflammation and cancer: respirable particulate matter, fibrous dusts and ozone as major causes of lung carcinogenesis through reactive oxygen species mechanisms. Int J Environ Res Public Health. 10, 3886-3907 (2013).
  28. Medina-Ramon, M., Zanobetti, A., Schwartz, J. The effect of ozone and PM10 on hospital admissions for pneumonia and chronic obstructive pulmonary disease: a national multicity study. Am J Epidemiol. 163, 579-588 (2006).
  29. Lee, I. M., Tsai, S. S., Chang, C. C., Ho, C. K., Yang, C. Y. Air pollution and hospital admissions for chronic obstructive pulmonary disease in a tropical city: Kaohsiung, Taiwan. Inha Toxicol. 19, 393-398 (2007).
  30. Triantaphyllopoulos, K., et al. A model of chronic inflammation and pulmonary emphysema after multiple ozone exposures in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 300, 691-700 (2011).
  31. Li, F., et al. Effects of N-acetylcysteine in ozone-induced chronic obstructive pulmonary disease model. PLoS ONE. 8, e80782 (2013).
  32. Li, F., et al. Hydrogen Sulfide Prevents and Partially Reverses Ozone-Induced Features of Lung Inflammation and Emphysema in Mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 55, 72-81 (2016).
  33. Rycroft, C. E., Heyes, A., Lanza, L., Becker, K. Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease: a literature review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 7, 457-494 (2012).
  34. Washko, G. R., et al. Airway wall attenuation: a biomarker of airway disease in subjects with COPD. J Appl Physiol. 107, 185-191 (2009).
  35. Yamashiro, T., et al. Quantitative assessment of bronchial wall attenuation with thin-section CT: An indicator of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease. AJR Am J Roentgenol. 195, 363-369 (2010).
  36. Tang, X., et al. Arctigenin efficiently enhanced sedentary mice treadmill endurance. PLoS ONE. 6, e24224 (2011).
  37. Schmidt, G. A., et al. Official Executive Summary of an American Thoracic Society/American College of Chest Physicians Clinical Practice Guideline: Liberation from Mechanical Ventilation in Critically Ill Adults. Am J Respir Crit Care Med. 195, 115-119 (2017).
  38. ATS Committee on Proficiency Standards for Clinical Pulmonary Function Laboratories. ATS statement: guidelines for the six-minute walk test. Am J Respir Crit Care Med. 166, 111-117 (2002).
  39. Shigemura, N., et al. Autologous transplantation of adipose tissue-derived stromal cells ameliorates pulmonary emphysema. Am J Transplant. 6, 2592-2600 (2006).
  40. Bchir, S., et al. Concomitant elevations of MMP-9, NGAL, proMMP-9/NGAL and neutrophil elastase in serum of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. J Cell Mol Med. , 1-12 (2016).
  41. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opin Drug Discov. 9, 629-645 (2014).
  42. Perez-Rial, S., Giron-Martinez, A., Peces-Barba, G. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Arch Bronconeumol. 51, 121-127 (2015).
  43. Antunes, M. A., et al. Effects of different mesenchymal stromal cell sources and delivery routes in experimental emphysema. Respir Res. 15, 118 (2014).
  44. Celli, B. R., MacNee, W., Force, A. E. T. Standards for the diagnosis and treatment of patients with COPD: a summary of the ATS/ERS position paper. Eur Respir J. 23, 932-946 (2004).
  45. U.S. Preventive Services Task Force. Screening for chronic obstructive pulmonary disease using spirometry: U.S. Preventive Services Task Force recommendation statement. Ann Intern Med. 148, 529-534 (2008).
  46. Ward, R. E., et al. Design considerations of CareWindows, a Windows 3.0-based graphical front end to a Medical Information Management System using a pass-through-requester architecture. Proc Annu Symp Comput Appl Med Care. , 564-568 (1991).

Tags

Медицина выпуск 126 хроническая обструктивная болезнь легких хронический бронхит эмфизема ограничения потока воздуха Паренхиматозный уничтожение легких воздействие озона
Поколение модели хронической обструктивной болезни легких у мышей, воздействие неоднократные озона
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W.… More

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W. Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (126), e56095, doi:10.3791/56095 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter