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Génération d’un modèle de maladie pulmonaire Obstructive chronique chez les souris par exposition à l’Ozone répétées

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/56095
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

Summary

Cette étude décrit la génération réussie d’un nouveau modèle animal de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) par une exposition répétée souris à des concentrations élevées d’ozone.

Abstract

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est caractérisée par persistants d’air limitation et poumon parenchyme destruction. Il a une incidence très élevée dans le vieillissement de la population. Les thérapies conventionnelles actuelles pour la MPOC se concentrer principalement sur symptôme médicaments modificateurs ; ainsi, le développement de nouvelles thérapies est absolument nécessaire. Qualifié de modèles animaux de la BPCO pourraient contribuer à caractériser les mécanismes sous-jacents et peuvent être utilisés pour le dépistage des drogues nouvelles. Les modèles actuels de MPOC, tels que les lipopolysaccharides (LPS) ou l’élastase pancréatique porcin (EPI)-emphysème induite par modèle, générer des BPCO-comme des lésions dans les poumons et des bronches, mais ne ressemblent pas autrement à la pathogenèse de la BPCO humaine. Une fumée de cigarette (CS)-modèle induit reste l’un des plus populaires car elle ne simule pas seulement BPCO-comme des lésions dans le système respiratoire, mais il est également basé sur l’une des principales matières dangereuses qui provoque la BPCO chez les humains. Cependant, les aspects de longues et fastidieuses du modèle induite par le CS limitent considérablement son application dans le dépistage des drogues nouvelles. Dans cette étude, nous avons généré avec succès un nouveau modèle de BPCO en exposant des souris à des concentrations élevées d’ozone. Ce modèle a démontré ce qui suit : 1) ont diminué le volume expiratoire maximal 25, 50 ou 75/forcé la capacité vitale (FEV25/FVC, FEV50/FVC et FEV75/FVC), indiquant la détérioration de la fonction pulmonaire ; 2) les alvéoles pulmonaires élargie, avec destruction parenchymateuse pulmonaire ; 3) réduit le temps de la fatigue et la distance ; et 4) augmente l’inflammation. Pris ensemble, ces résultats démontrent que le modèle d’exposition (OE) de l’ozone est un modèle animal fiable qui est semblable à l’homme car la surexposition de l’ozone est l’un des facteurs étiologiques de la BPCO. En outre, il n’a fallu 6-8 semaines, issus de nos travaux antérieurs, pour créer un modèle de OE, considérant qu’il faut de 3 à 12 mois pour induire le modèle de la fumée de cigarette, ce qui indique que le modèle de OE peut être un bon choix pour la recherche de la MPOC.

Introduction

Il a été estimé que la MPOC, y compris l’emphysème et la bronchite chronique, pourrait être la troisième cause de décès dans le monde en 2020,1,2. L’incidence potentielle de la BPCO chez une population de plus de 40 ans est estimé à 12,7 % chez les mâles et 8,3 % chez les femmes au sein de la prochaine 40 ans3. Aucuns médicaments ne sont actuellement disponibles pour inverser la détérioration progressive de patients BPCO4. Modèles animaux fiables de la BPCO non seulement exigent l’imitation du processus pathologique de la maladie mais également besoin d’une période de génération court. Les modèles actuels de la MPOC, y compris les LPS ou un modèle induite par le PPE, peuvent induire des symptômes emphysème5,6. Une seule administration ou un défi de la semaine de LPS ou PPE de souris ou rats génère une neutrophilie marquée dans le lavage bronchoalvéolaire (LBA), augmentation des médiateurs pro-inflammatoires (p. ex., TNF-α et IL-1β) dans la BALF ou le sérum, produit du poumon parenchymateuses élargie à la destruction des espaces d’air et limites d’air5,6,7,8,9,10. Cependant, LPS ou EPI ne sont pas des causes de la MPOC humaine et ainsi ne pas imiter le processus pathologique11. Un modèle induite par le CS produit une limitation persistante d’air, de la destruction parenchymateuse pulmonaire et réduit la capacité fonctionnelle d’exercice. Cependant, un protocole de CS traditionnel nécessite au moins 3 mois pour générer une MPOC modèle12,13,14,15. Ainsi, il est important de générer un nouveau modèle animal plus efficace qui répond à deux exigences.

Récemment, en plus de l’usage de la cigarette, la pollution atmosphérique et l’exposition professionnelle sont devenues des causes plus courantes de MPOC16,17,18. L’ozone, comme l’un des principaux polluants (bien que pas la composante majeure de la pollution atmosphérique), peuvent directement réagir avec les voies respiratoires et endommager le tissu pulmonaire des enfants et des jeunes adultes19,20,21 ,22,23,24,25. L’ozone, mais aussi d’autres stimulateurs dont LPS, PPE et CS, sont impliqués dans un grave des voies biochimiques du stress oxydatif pulmonaire et dommages à l’ADN et sont liés à l’initiation et la promotion des BPCO26,27. Un autre facteur est que les symptômes de certains patients BPCO se détériorent après avoir été exposés à l’ozone, ce qui indique que l’ozone peut perturber la fonction de poumon18,28,29. Par conséquent, nous avons généré un nouveau modèle de BPCO par exposition répétée des souris à des concentrations élevées d’ozone pendant 7 semaines ; Il en est résulté les défauts d’air et des lésions parenchymateuses pulmonaires semblables à ceux des précédentes enquêtes30,31,32. Nous avons étendu le protocole OE à des souris femelles dans cette étude et reproduit avec succès l’emphysème observé chez les souris mâles dans nos précédentes études30,31,32. Parce que la mortalité de la BPCO a diminué chez les hommes, mais augmenté chez les femmes dans de nombreux pays33, un modèle de BPCO chez les femmes est nécessaire pour étudier les mécanismes et d’élaborer des méthodes thérapeutiques pour les patientes de MPOC. L’applicabilité du modèle OE à tous les genres étaye davantage son utilisation comme un modèle de MPOC.

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Protocol

Remarque : modèle de l’OE a été générée et utilisée en recherche a déjà été indiqué 30 , 31 , 32. Toutes les expériences animales ont été approuvées par l’utilisation Comité (IACUC) de l’Université Jiaotong de Shanghai et d’institutionnels animalier.

1. souris

Centre de
  1. maison exempts de micro-organismes pathogènes, âgés de 7 à 9 semaines femelles souris BALB/c dans des cages ventilées individuelles chez un animal sous contrôlée température (20 ° C) et humidité (40-60 %). Fournir un 12 h de lumière et sombre cycle de 12 h dans l’établissement. Fournir de la nourriture et l’eau ad libitum.

2. L’ozone ou l’exposition à l’Air

  1. générer l’ozone avec un générateur électrique dans une étanchéité boîte acrylique (par exemple Perspex). Souffler l’air hors de la boîte à l’aide d’un petit ventilateur à travers un tuyau d’évacuation aérienne qui est connecté à l’intérieur et à l’extérieur de la boîte. Surveiller la concentration d’ozone dans la boîte à l’aide d’une sonde d’ozone. Attendez jusqu'à ce que la concentration d’ozone dans la zone atteint 2,5 parties par million (ppm).
    Remarque : La sonde d’ozone peut activer automatiquement le générateur d’ozone ou désactiver et peut maintenir le niveau d’ozone dans la boîte à 2,5 ppm.
  2. Placer les souris dans la boîte quand le niveau d’ozone a atteint 2,5 ppm. Garder les souris dans la zone pendant 3 h chaque fois des pour exposer à l’ozone.
    Remarque : La boîte peut maintenir un niveau d’ozone de 2,5 ppm durant les 3 h en commutant automatiquement le générateur d’ozone on ou off et soufflant le CO 2 qui est produite par les souris hors de la boîte.
  3. Donner deux exposition à l’ozone (chaque exposition Durée 3 h) par semaine (une fois tous les 3 jours) pendant 7 semaines, exposer les souris de contrôle à l’air en même temps et pour la même période.

3. Micro-tomodensitométrie

  1. à la fin de la semaine 7, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de pelltobarbitalum natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) adapter la dose selon les situations individuelles de voir que la souris ne fonctionne pas répondre à un orteil pincée. moniteur et garder la souris à une fréquence de respiration régulière ; et assurez-vous qu’aucun mouvements volontaires n’existent pendant les procédures.
  2. Placer les souris anesthésiés dans la chambre d’une micro-la tomodensitométrie (µCT).
  3. Calibrer le µCT utilisant le protocole standard et le fabricant ' instructions de s. Fixer le tube à rayons x à 50 kV et le courant à 450 µA.
    NOTE : Les rayons x et le détecteur tournent autour des souris.
  4. Exécuter l’analyse µCT en acquérant 515 projections avec une taille de pixels effectifs de 0,092 mm, un temps d’exposition de 300 ms pour une tranche et une épaisseur de tranche de 0,093 mm.
  5. Reconstituer le poumon avec les images acquises à l’aide d’un logiciel. Ajuster la luminosité de l’image en niveaux de gris en définissant le minimum et le maximum de l’échelle des gris-750 et -550 unités Hounsfield, respectivement.
    Remarque : Le logiciel calculera automatiquement le volume de parenchyme pulmonaire et la zone faible atténuation (LAA) 34 , 35.
  6. Calculer le pourcentage de LAA (LAA %) en divisant le volume LAA par le volume pulmonaire totale.

4. tapis roulant Test

  1. donner les souris une adaptation d’essai à une vitesse de 10 m/min pendant 10 min sur une machine de tapis roulant en cours d’exécution. Note : l’électricité est toujours éteint lorsque la procédure est menée.
  2. administrer un test de fatigue à la souris.
    1. Réchauffer les souris à une vitesse de 10 m/min pendant 5 min.
    2. Augmenter la vitesse à 15 m/min pendant 10 min.
    3. Augmenter l’intensité de l’exercice : en augmentant la vitesse de 5 m/min, à partir de 20 m/min, toutes les 30 minutes jusqu'à ce que la souris ne peut pas continuer à courir 36.
  3. Enregistrer le total distance courante et durée respectivement comme distance de fatigue et temps de fatigue,.

5. mesures de la fonction pulmonaire

  1. anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de pelltobarbitalum natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) adapter la dose selon les situations individuelles de voir que la souris ne ne répond pas à une pincée d’orteil et attendre que les souris ont maintenu la respiration spontanée. moniteur et garder la souris à une fréquence de respiration régulière ; et assurez-vous qu’aucun mouvements volontaires n’existent pendant les procédures.
  2. Soigneusement tracheostomize les souris et placez-les dans une pléthysmographie de corps qui est reliée à un ventilateur commandé par ordinateur.
    Remarque : La Ventilation est contrôlée via une soupape située dans la partie proximale de la sonde endotrachéale. Le programme d’installation fournit différentes manœuvres semi-automatique, y compris la manœuvre du volume pression quasi statique et la manœuvre des débit rapide.
  3. Imposer une moyenne fréquence de 150 respirations/min pour la souris anesthésiée par l’intermédiaire de ventilation sous pression contrôlée jusqu'à une respiration régulière de respiration et d’expiration complète à chaque cycle respiratoire est obtenue.
  4. Effectuer la manœuvre de pression-volume quasi statique avec le dispositif à l’aide de pressions négatives générées dans le pléthysmographe.
  5. Effectuer la manœuvre de volume de débit rapide dans les boucles de pression-volume quasi statique pour enregistrer la FVC et le VEMS. Gonfler les poumons à + 30 cm H 2 O et immédiatement après le connecter à une pression très négative pour appliquer l’expiration jusqu'à ce que le volume résiduel est à-30 cm H 2 O. Record le FEV dans les 25 premiers, 50 et 75 ms d’exhalation (FEV 25 FEV 50 et 75 de FEV, respectivement). Rejeter les manœuvres sous-optimale. Pour chaque test avec chaque souris, effectuer un minimum de trois manœuvres acceptables pour obtenir un moyen fiable pour tous les paramètres numériques.

6. BALF Collection

  1. après anesthésie terminal avec pelltobarbitalum natricum ((1 %, 1,8-2,4 ml/100 g) adapter la dose selon les situations individuelles de voir que la souris ne pas répondre à une pincée d’orteil et perdre haleine), lavage du souris avec 2 mL de PBS via un tube endotrachéal de 1 mm de diamètre et puis récupérer la BALF 10.
  2. Réunir les aliquotes de lavage récupérée et centrifuger à 4 ° C et 250 x g pendant 10 min.
  3. Recueillir le surnageant pour une utilisation immédiate et stocker le reste à l’azote liquide ou de-80 ° C.
  4. Compter le nombre total de cellules utilisant un hémocytomètre.
  5. Resuspendre le culot dans du PBS et essorage (1 400 x g, 6 min) puis de 250 µL de cellules resuspendues sur diapositives à l’aide d’une centrifugeuse spinner de diapositive.
  6. Wright appliquer la coloration de cellules sur les diapositives selon le fabricant ' protocole de s.
  7. Compter 200 cellules par souris ; identifier les cellules comme les macrophages ou neutrophiles, selon morphologie standard, sous un grossissement de X 400 ; et compter leurs numéros.

7. Les prélèvements sanguins cardiaques

  1. recueillir le sang par ponction cardiaque, chargez-le dans des tubes de 1,5 mL et gardez-le sur glace pendant 30 min.
  2. Centrifuger les échantillons de sang pendant 5 min à 2 000 x g et 4 ° C.
  3. Transférer le surnageant (sérum) dans un nouveau tube et conserver à-80 ° C ou liquide azote.
  4. Préparer le sérum pour IL-1β, IL-10 et les tests de détection de TNF-α en utilisant les kits ELISA respectifs.

8. L’analyse morphométrique poumon

  1. disséquer les poumons et les trachées des souris.
    1. Positionner chaque souris euthanasiés sur une planche chirurgicale immédiatement après le sacrifice.
    2. Disséquer loin le peaucier et les muscles trachées antérieurs pour visualiser et accéder aux anneaux trachées.
    3. Ouverte vers le haut le thoracique cavité. Disséquer les poumons et la trachée, mais ne séparent pas le cœur des poumons.
  2. Connecter la sonde endotrachéale à une seringue contenant 4 % de paraformaldéhyde à travers un tube de polyéthylène PE90.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique. Porter des gants et des lunettes de sécurité et d’utiliser la solution à l’intérieur d’une hotte aspirante.
  3. Gonfler les poumons complètement à l’aide de paraformaldéhyde à 4 % (10 gouttes, ~ 200 µL) par le biais de la sonde endotrachéale. Enlever le coeur à l’issue de l’inflation.
  4. Maintenir le poumon dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 4 h.
  5. Intégrer le poumon à la paraffine. Obtenir des sections de 5 µm par bloc de paraffine sectionnant avec un microtome rotatif. Au cours de la découpe, exposer la surface maximale du tissu pulmonaire dans la zone de l’arbre bronchique.
  6. Pour analyse morphométrique, effectuer l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration sur les sections.
  7. Les sections d’image avec un microscope droit lumineux-zone (porte-objectif, 20 X, temps d’exposition, ms 1,667).
  8. Ont deux enquêteurs aveuglés au protocole de traitement indépendamment de compter les coupes histologiques. Utiliser le point d’intersection linéaire moyenne (L, m) en tant que paramètre pour mesurer la distance de la paroi septale inter alvéolaire. Déterminer la L m en suivant les étapes suivantes :
    1. Ouvrez les images des sections dans Photoshop et d’en tirer une réticule-grille sur l’image avec des lignes longues de cinq 550 µm.
    2. Compter le nombre d’alvéoles à travers la ligne de grille.
    3. Calculer le L m en divisant la longueur de la ligne de la grille par le nombre d’alvéoles. Pour la quantification, image cinq sections par souris. Acquérir des dix images de chaque section (une image par champ) et évaluer de façon aléatoire. Pendant la sélection du champ, éviter les champs des voies respiratoires et les navires en déplaçant un champ avant ou dans une autre direction.
      Remarque : Les données sont présentées comme la moyenne ± S.E.M. Un non-apparié t-test a été effectué pour comparaison entre souris exposés à l’air et des souris exposées à l’ozone. Trois animaux de chaque groupe ont servi à calculer la différence significative. Une valeur p de < 0,05 était considérée comme significative.

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Representative Results

Exemples d’images 3D µCT de chaque groupe sont affichés dans la Figure 1a. Les souris exposées à l’ozone avaient considérablement accroître le volume pulmonaire totale (Figure 1a et b) et LAA % (Figure 1c) que la souris de contrôle exposés à l’air. Le volume pulmonaire et LAA % est demeurée élevées après six semaines de l’ozone exposition31,32. Volume pulmonaire accrue et LAA % représentent le phénotype de l’emphysème. Exemples d’élargissement alvéolaire pulmonaire dans la Figure 2un illustrent la formation de l’emphysème. Une augmentation dans l’interception moyenne linéaire (Lm) a été observée chez les souris exposées à l’ozone (Figure 2b), qui a confirmé que la destruction parenchymateuse pulmonaire s’est produite après exposition à l’ozone.

Fonction pulmonaire a été mesurée par les paramètres de vitesse de circulation de l’air, montrés que FEV25/FVC, FEV50/FVC et FEV75/FVC. Les résultats ont montré que tous les paramètres qui ont diminué dans les souris exposées à l’ozone (Figure 3a à c) étaient compatibles avec les défauts fonctionnels pulmonaires typiques en MPOC patients4,37. Pour continuer à évaluer le modèle OE, nous avons effectué un test de tolérance au exercice que par ce qui suit pour la marche de 6 min test (TM6)38,39, qui est couramment utilisée pour évaluer les changements de capacité fonctionnelle d’exercice chez les patients BPCO. L’exposition à l’ozone diminue significativement la distance de temps et la fatigue fatigue (Figure 4a et b).

Pour répondre à la pathogenèse de la BPCO dans le modèle de OE, les macrophages et les neutrophiles ont été comptés depuis les BALFs des souris ; les cytokines pro-inflammatoires (IL-1β et TNF-α) et cytokines anti-inflammatoires (IL-10) ont été détectés dans les sérums de souris. Les souris exposées à l’ozone ont montré une augmentation significative des cellules inflammatoires, y compris les macrophages et les neutrophiles (Figure 5a-c), ainsi qu’une diminution significative de l’IL-10 et une augmentation de TNF-α et IL-1β (Figure 6a-c ). Toutes les données ont démontré que l’OE modèle récapitulés humaine BPCO-comme des symptômes.

Figure 1
La figure 1. Exposition à l’ozone a augmenté le volume pulmonaire et LAA % détectés par µCT. (une) images 3D représentant montrant les poumons de souris ou l’ozone-exposés à l’air à 7 semaines après l’exposition respectif. (b) volumes individuels pulmonaire totale des deux groupes ont été extraites à partir des images 3D pour les statistiques. Souris exposées à l’ozone ont montré une augmentation significative du volume pulmonaire total. (c) individuel et moyenne LAA % des deux groupes. Chez les souris exposées à l’ozone ont montré une augmentation significative dans LAA %. La couleur rouge indique LAA (voxels avec des densités de 2 550-2 700 unités de Hounsfield). La trachée et les bronches en rouge dans cette figure ont été retirés pour calculer le poumon LAA. Les données sont présentées comme la moyenne ± S.E.M. ** P < 0,01, *** P < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
La figure 2. Exposition à l’ozone a augmenté la Lm. (une) micrographies représentant des espaces alvéolaires pulmonaires dans les sections colorées HE des souris exposés à l’air ou exposés à l’ozone. (b) les valeurs de Lm ont été quantifiés dans les coupes de poumon des deux groupes pour les statistiques. Une augmentation Lm a été observée chez les souris exposées à l’ozone. Les données sont présentées comme la moyenne ± S.E.M. ** P < 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Exposition à l’ozone diminue la fonction pulmonaire. (a-c) Pour les exposés à l’air et les souris exposées à l’ozone, le FEV individuel dans les 25 premiers, 50 et 75 ms de jeûner expiration (FEV25FEV50et75de FEV, respectivement), ainsi que de la CVF, tous ont été enregistrés. Les pourcentages de FEV25FEV50et FEV75 à CVF ont été calculées séparément. FÉV25/FVC, FEV50/FVC et FEV75/FVC tous a diminué sensiblement en souris exposées à l’ozone. Les données sont présentées comme la moyenne ± S.E.M. * P < 0,05, ** P < 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Exposition à l’ozone diminue les temps de la fatigue et la distance de la fatigue. (la) course individuelle fois pour ou l’ozone-exposés à l’air souris ont été enregistrés. Souris exposées à l’ozone ont montré une diminution significative dans le temps de la fatigue. (b) les distances en cours d’exécution des deux groupes ont été enregistrés. Souris exposées à l’ozone ont montré une diminution significative de la distance de la fatigue. Les données sont présentées comme la moyenne ± S.E.M. * P < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . Les cellules inflammatoires à compter de BALF. (a) individuel et moyens nombre de cellules totales (TOTAL) chez la souris ou l’ozone-exposés à l’air. (b) individuels et moyenne nombre de macrophages (MAC) dans les deux groupes. (c) individuel et moyens nombre de neutrophiles (NEU) dans les deux groupes. Les données sont présentées comme la moyenne ± S.E.M. * P < 0,05, ** P < 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

ans-page = « 1 » >Figure 6
Figure 6 . Détection de cytokines inflammatoires et anti-inflammatoire dans le sérum. b individuelles et moyennes des valeurs de la quantité d’IL-10 chez la souris ou l’ozone-exposés à l’air. (b) individuelles et moyennes des valeurs de la quantité d’IL-1β dans les deux groupes. (c) individuelles et moyennes des valeurs de la quantité de TNF-α dans les deux groupes. Les données sont présentées comme la moyenne ± S.E.M. * P < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans cette étude, nous présentons une méthode fiable permettant de générer un nouveau modèle de MPOC. Par rapport aux autres modèles (c.-à-d., LPS ou modèles d’EPI), ce modèle de OE récapitule le processus pathologique des patients BPCO. Parce que la fumée de cigarette est la principale matière dangereuse qui cause des BPCO chez les patients humains40, le modèle CS reste le plus populaire MPOC modèle41,42. Toutefois, le modèle CS nécessite un R de 3 à 12 mois & période D pour de nouveaux médicaments. Par rapport au modèle CS, le modèle actuel de OE réduit la période de génération à 6-8 semaines. Nous avons observé l’emphysème chez les souris mâles après 6 semaines d’exposition à l’ozone dans nos précédentes études30,31,32. Dans cette étude, nous avons appliqué le protocole OE à des souris femelles pendant 7 semaines et généré avec succès un modèle féminin de OE. Parce qu’il a été signalé que la mortalité de la BPCO a a diminué chez les hommes mais a augmenté chez les femmes dans certains pays33, il est nécessaire d’étudier les mécanismes pathogéniques et de développer des approches de guérison pour les patientes de MPOC à l’aide d’un modèle féminin de la MPOC. Nous savons que les modèles de MPOC susmentionnées (c.-à-d., LPS, PPE et CS) puissent travailler dans les deux animaux mâles et femelles43. Le but de ce travail était de proposer un modèle supplémentaire de BPCO qui récapitule le processus pathologique des patients BPCO et nécessite une très courte période de génération.

L’étape clé pour générer ce modèle exposait les souris à l’ozone (à un niveau de 2,5 ppm) deux fois par semaine (une fois tous les 3 jours) pendant 6 à 8 semaines (dans cette étude, nous avons utilisé 7 semaines, bien que nous n’avons pas essayé escalade de dose). En contrôlant les paramètres essentiels de la fréquence d’exposition et la concentration d’ozone, nous avons reproduit avec succès l’emphysème masculin C57BL/6 souris31,32, masculin de souris BALB/c30et les souris femelles BALB/c (le courant étude). Le phénotype de l’emphysème résulte de l’exposition à l’ozone, avec la limitation de la circulation de l’air et destruction parenchymateuse de poumon semblable aux changements dans la BPCO patients44,45.

Il y a encore des limites de cette étude. Par exemple, car la pathogenèse de la BPCO humaine est liée à l’anatomie des poumons, un modèle idéal de la BPCO devrait être généré chez les animaux qui ont une structure anatomique pulmonaire semblable à celui des humains. Par rapport aux grands animaux, petits animaux possède des voies respiratoires encore moins vastes ramifications que les humains46. Nous devons admettre qu’il serait plus significatif pour générer un modèle de BPCO chez les grands animaux. Toutefois, il est très difficile d’établir des modèles à grande échelle chez les animaux. Une autre limitation de ce modèle est sa pertinence clinique. Bien qu’il soit certain que l’ozone peut réagir avec les voies respiratoires et endommager le tissu de poumon19,22, et bien qu’il semble que les symptômes de certains patients BPCO se détériorent après exposition à l’ozone28, l’ozone n’est pas la principale cause de la BPCO chez les patients. Cependant, nous sommes toujours proposant et en utilisant ce modèle de OE parce que l’ozone et CS causent des dommages au système respiratoire en induisant l’inflammation et conduisent à un stress oxydatif26,27. Ainsi, un nouveau médicament qui peut guérir la BPCO dans la boîte du modèle OE assumably travaillent également dans le modèle CS et donc potentiellement être mis au point pour les patients BPCO.

Applications du modèle OE ne se limitent pas à déchiffrer les mécanismes moléculaires et cellulaires de la BPCO. Nos deux articles récents a aussi étudié l’efficacité de la N-acétylcystéine (NAC)31 et NaHS32 (un donneur exogène de H2S) au traitement de la MPOC via l’administration exogène de ces deux médicaments au modèle OE. La première étude, nous avons trouvé un renversement d’hyperréactivité et une réduction de la masse des muscles lisses des voies respiratoires après l’administration du CNA. Ces effets pourraient indiquer la base de potentiels avantages cliniques de NAC chez de patients BPCO31. Dans la deuxième étude du modèle OE, nous avons constaté que l’administration de NaHS exogène inversé des inflammations pulmonaires et partiellement renversé les caractéristiques de l’emphysème. Ainsi, avec ce modèle de OE, nous avons démontré dans une étude préliminaire que NaHS pourrait être développé comme un potentiel candidat-médicament pour BPCO patients32. Par conséquent, le modèle de OE a des applications potentielles pour les recherches de mécanisme et dépistage des drogues pour la MPOC.

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Disclosures

Z.W.S. et W.W. sont employés actuels et les détenteurs de stock-options du groupe biomédecine cellulaire (NASDAQ : CBMG). Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier M. Boyin Qin (Shanghai Public Health Clinical Center) pour l’assistance technique à l’évaluation de µCT dans le présent protocole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c mice Slac Laboratory Animal,Shanghai, China N/A 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages Suhang, Shanghai, China Model Number: MU64S7 The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box Suhang, Shanghai, China N/A The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany Model 500  The device was used for generating ozone.
Ozone probe ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK Ozone 300 The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum Sigma, St. Louis, MO, USA P3761 Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography GE Healthcare, London, ON, Canada RS0800639-0075 This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software GE Healthcare, London, ON, Canada Micro-view 2.01  This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine  Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China DSPT-208 This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced Manoeuvres System This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge Denville Scientific, Holliston, MA, USA C1183  It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining Hanhong, Shanghai, China RE04000054  It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer Hausser Scientific, Horsham, PA, USA 4000 It was used to count cells.
IL-1β Abcam, Cambridge, MA, USA ab100704 They were used to test the respective factors in serum.
IL-10 Abcam, Cambridge, MA, USA ab46103 They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α Abcam, Cambridge, MA, USA ab100747 They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde  Sigma, St. Louis, MO, USA P6148 The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin Hualing, Shanghai, China 56# It was used to embed the lung.
Rotary Microtome Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany RM2255 It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution Solarbio, Beijing, China G1120 H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope Olympus, Center Valley, PA, USA CX41 It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12 Adobe, San Jose, CA, USA Adobe Photoshop 12 It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5 Graphpad Software Inc., San Diego, CA GraphPad prism 5 It was used for data analysis and production of figures.

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Médecine numéro 126 bronchopneumopathie chronique obstructive bronchite chronique emphysème limitation de la circulation de l’air destruction parenchymateuse pulmonaire exposition à l’ozone
Génération d’un modèle de maladie pulmonaire Obstructive chronique chez les souris par exposition à l’Ozone répétées
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Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W.… More

Sun, Z., Li, F., Zhou, X., Wang, W. Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (126), e56095, doi:10.3791/56095 (2017).

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