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Biology

在体内人细胞 Rb 蛋白 sumo 的检测与分析

doi: 10.3791/56096 Published: November 2, 2017
* These authors contributed equally

Summary

小泛素相关的修饰剂 (相扑) 家族蛋白被共轭到靶蛋白的赖氨酸残留物来调节各种细胞过程。本文介绍了一种检测视网膜母细胞瘤 (Rb) 蛋白 sumo 的方法。

Abstract

蛋白质的修饰修饰对细胞内信号转导的适当调节至关重要。在这些修饰中, 小泛素相关的修饰剂 (相扑) 是一种泛素样蛋白, 它是以共价键的方式附着在各种靶蛋白的赖氨酸残留物上, 以调节细胞过程, 如基因转录、DNA 修复、蛋白质相互作用和退化, 亚细胞传输和信号转导。最常见的检测蛋白质 sumo 的方法是基于基因重组标记蛋白在细菌中的表达和纯化, 允许一个体外生化反应, 这是简单的, 适合解决机械问题.然而, 由于 sumo 的过程的复杂性在体内, 它是更具挑战性的检测和分析蛋白质 sumo 的细胞, 特别是在内源条件下。本文作者最近的一项研究表明, 内源性视网膜母细胞瘤 (Rb) 蛋白, 是一个肿瘤抑制物, 这是至关重要的消极调节的周期进展, 是专门 SUMOylated 在早期 G1 阶段。本文介绍了一种在细胞内源和外源条件下检测和分析 Rb sumo 的协议。本议定书适用于型和功能研究的相扑-修改的 Rb, 以及许多其他相扑靶蛋白, 在人类细胞。

Introduction

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真核细胞周期进展的精确控制是基于严密的监管网络, 确保特定事件以有序的方式1,2进行。在这个网络的关键球员之一是视网膜母细胞瘤 (Rb) 蛋白, 第一个克隆肿瘤抑制1,3。Rb 蛋白被认为是细胞周期进展的负调节因子, 尤其是对 G0/G1 S 相变和肿瘤生长4,5。Rb 功能的失败直接导致儿童、视网膜母细胞瘤的最常见的眼内恶性肿瘤, 或有助于许多其他类型的癌症的发展5。此外, Rb 涉及许多细胞通路, 包括细胞分化, 染色质重塑, 和线粒体介导的凋亡3,6,7

后平移修改在 RB 函数的调节中起着关键作用8,9。磷酸化是一个这样的修改, 它通常导致 Rb 失活。在静止 G0 细胞, Rb 是活跃的低磷酸化水平。随着细胞在 G0/G1 阶段的进展, rb 是连续的高磷酸化的一系列周期素依赖性蛋白激酶 (激酶) 和周期, 例如, 细胞周期素 E/CDK2 和 D/CDK4/6, 使 rb 失效, 并消除它的能力, 抑制电池周期相关基因表达式4,10。Rb 也可以通过小泛素相关修饰符 (相扑)11,12,13进行修改。

相扑是一种泛素状的蛋白质, 它与各种靶蛋白的共价键相连。它是关键的不同的细胞过程, 包括细胞周期调节, 转录, 蛋白质细胞定位和降解, 运输和 DNA 修复14,15,16,17,18. 相扑共轭通路包括二相扑 E1 活化酶 SAE1/UBA2, 单 E2 共轭酶 Ubc9, 多 E3 酶, 和相扑特有的蛋白酶。一般来说, 新生的相扑蛋白必须 proteolytically 加工, 以产生成熟的形式。成熟的相扑被激活的 E1 heterodimer, 然后转移到 E2 酶 Ubc9。最后, 相扑的 c-端甘氨酸与基材的靶赖氨酸共价共轭, 这一过程通常由 E3 酶。相扑蛋白可以通过特定的蛋白酶从修饰的基质中除去。本文作者先前的一项研究表明, Rb 的 sumo 增加了它与 CDK2 的结合, 导致早期 G1 阶段的超磷酸化, 这是细胞周期进程13所必需的过程。我们还证明, Rb sumo 的损失导致细胞增殖减少。此外, 最近证明, rb 的 sumo 保护 rb 蛋白从体的营业额, 从而提高了 rb 蛋白的水平, 在细胞19。因此, sumo 在各种细胞过程的 Rb 功能中起着重要的作用。为了进一步研究 rb sumo 的功能后果和生理相关性, 必须建立一种有效的方法来分析 rb 在人细胞或患者组织中的作用。

sumo 是一个可逆的、高度动态的过程。因此, 在完全内源性条件下, 通常很难检测到相扑修饰的蛋白质。本文提出了一种检测内源 Rb sumo 的方法。此外, 还说明了如何检测野生型 rb 的外源 rb sumo 和其相扑缺陷突变11。特别是, 雅各布斯et al.描述了一种方法来增加特定基板的相扑修饰, 具体由 Ubc9 融合定向 sumo (ufd)20。基于这种方法, 本协议描述了如何分析 Rb 的强迫 sumo 及其功能性后果。考虑到数百个相扑基质已经被描述过, 而且更多的假定相扑基质已经从许多 proteomic-based 的检测中发现, 这个协议可以用来分析这些蛋白质在人类细胞中的相扑修饰。

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Protocol

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1. 在早期 G1 阶段检测内源性 Rb sumo

  1. 单元格区域性和单元格周期同步.
    1. 在含有 Dulbecco 和 #39 的生长培养基中维护 HEK293 细胞 (DMEM), 辅以1% 笔链球菌和10% 胎牛血清 (FBS) 在37和 #176; C 和 5% CO 2 在孵化器中.
    2. 在 G0 阶段同步 HEK293 单元格。
      1. 使用例和种子 ~ 1.5 x 和 #160 的 HEK293 单元格计数; 10 7 单元格在 15 cm 盘中, 在治疗前为24小时的25ml 生长培养基。在达到 70%-80% 的汇合后, 吸气培养基, 用5毫升 prewarmed 磷酸缓冲盐水 (PBS) 冲洗两次细胞.
      2. 添加25毫升 DMEM, 含有1% 青霉素-链霉素, 并孵育细胞在37和 #176; C 为 72 h. 用3毫升 ice-cold PBS 清洗板上的细胞。将细胞转化为新的5毫升管.
      3. 用流式细胞仪对细胞周期进行分析 (步骤 1.2); 在室温下以 200 x g 的离心法收集剩余的大多数细胞, 然后将它们储存在 tme 温度的冷冻库中, 直到分析Rb sumo.
    3. 获取 G1-phase 单元格, 在 G0 同步过程结束时, 移除 DMEM 并添加回新的生长介质, 从而允许 HEK293 单元重新进入细胞周期。然后, 在不同的 G1 阶段收集细胞 (早 G1:30 分钟;G1: 2h) 用于细胞周期分析和进一步的相扑检测.
    4. 使用 double-thymidine 块方法在 S 阶段同步 HEK293 单元格。
      1. 将 HEK293 单元格增长为 70-100 50%, 并使用 prewarmed PBS 清洗细胞。然后加入生长培养基补充2.5 毫米胸苷为 18 h (第一块).
      2. 取下含有胸苷的培养基, 然后用 prewarmed PBS 冲洗两次细胞。添加新鲜培养基 14 h 释放细胞.
      3. 在对细胞周期和 Rb sumo 进行分析之前, 用吸管将培养基与 2.5 mM 的胸苷添加到另一 18 h (第二块) 中.
    5. 用于 G2/M 同步、板 ~ 1.5 和 #215; 10 7 HEK293 细胞到 15 cm 盘与25毫升成长媒介 24 h。然后在培养基中加入 nocodazole, 直到最终浓度达到 400 ng/毫升。最后, 在对细胞周期和 Rb sumo 进行分析之前, 先孵育16小时的细胞.
  2. 流式细胞术的细胞周期分析.
    1. 在 PBS 中重新挂起同步 HEK293, 然后在4和 #176 中使用 ice-cold 70% 乙醇对2小时内的单元悬浮进行修复; c. 注意到为了最小化细胞聚类, 在 ice-cold 100% 乙醇中加入细胞悬浮滴以获得最终浓度70% 乙醇, 同时轻轻涡流.
    2. 将细胞离心5分钟, 500 x g, 然后小心地丢弃上清液, 用 PBS 冲洗两次细胞。重复离心机步骤.
    3. 添加500和 #181; 包含50和 #181 的 PBS; g/毫升核酸染色碘碘化物, 0.1% 海卫 X-100 和1和 #181; g/毫升核糖核酸 A 对细胞和混合好。在37和 #176 孵育细胞15分钟; C.
    4. 将样品存储在4和 #176; C 直到流式细胞仪进行分析.
  3. 沉淀内生 Rb 蛋白。
    1. 准备 HEK293 单元格裂解。
      1. 通过在1毫升 ice-cold 无线电沉淀检测 (帕) 裂解缓冲区 ( 表 1 ) 中轻轻 re-suspending, 溶解同步 HEK293 细胞, 其中含有新添加的20毫米 n-Ethylmaleimide, 一种 isopeptidase 抑制剂, 可以阻止相扑蛋白酶和稳定的相扑共轭.
      2. 通过在2毫升注射器上附着的21克针, 进一步质冰上的细胞 Dounce 均匀化, 超声或简单地通过10次。然后, 在冰上孵育细胞5分钟.
        注: 阴离子洗涤剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 在帕缓冲是关键的后期确定的 rb-相扑, 因为它可以消除不相扑信号是衍生的价相互作用的 rb 蛋白和其他非 Rb 相扑种.
    2. 在4和 #176 将单元格裂解为 1.8万 x g, 30 分钟; c. 将清转移到新的1.5 毫升微离心管.
      注意: 协议可以在此处暂停。蛋白质可以储存在-80 和 #176; C 至少6月.
    3. 为以后的西部印迹准备每个样品的输入控制, 保存上面描述的上清的一小部分到新的管子和商店在-80 和 #176; C.
    4. 对上述清, 添加1和 #181; g 的非特异性小鼠免疫球蛋白 g (IgG) 的同一物种和同种的单克隆 Rb 抗体, 和20和 #181; L 50% 蛋白 A/g-琼脂浆。然后, 在4和 #176 孵育1小时; C 温和旋转.
    5. 离心样品在 3000 x g 为3分钟在4和 #176; c. 小心地收集清不干扰的珠子, 并转移到新的1.5 毫升微离心管。对每个样品, 增加5和 #181; i Rb 主要抗体和40和 #181; l 50% 蛋白 A/G-琼脂浆。然后, 在4和 #176 一夜之间孵育; C 温和旋转.
    6. 通过离心 3000 x g 收集珠子3分钟, 在4和 #176; C, 并小心地清除上清移。注意, 为了避免珠损, 不要将珠子吸干.
    7. 用1毫升的帕缓冲液洗涤珠子四次。每一次, 通过旋转他们在4和 #176 的管; c 为 15 min. 用低速离心法在 3000 x g 处收集珠子, 在4和 #176; c, 然后丢弃清.
    8. 从最后的洗涤中除去清后, 在30和 #181 中 re-suspend 珠; 1x 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 加载缓冲区 ( 表 1 ) 并混合好。
      1. 在100和 #176 中孵育管; C 在热块中进行10分钟离心, 将样品在 1.2万 x g 为1分钟, 将珠子颗粒。仔细收集清不干扰珠子, 并转移到1.5 毫升微离心管.
    9. 通过 4%-20% 梯度 SDS-页凝胶和西式印迹分析样品, 或将它们存储在-20 和 #176; C 用于以后使用.

2。6 xhis 标记外源 Rb sumo 在人类细胞中的分析

  1. 单元格区域性和转染.
    1. 种子 ~ 6 和 #215; 10 6 HEK293 在 10 cm 盘中的细胞, 在正常细胞培养条件下孵育 24 h, 以获得 75%-85% 的汇合细胞。在转染前, 移除培养基, 加入6毫升的 prewarmed 降低血清培养基 (见 材料表 ), 然后将这些盘子放回孵化器.
    2. 对于 Rb 本构 sumo 测定, 增加15和 #181; g 在500和 #181 中分别添加了 6 xhis 标记的 Rb-Ubc9-WT、Rb-Ubc9-C93S、Ubc9-WT 和 Ubc9-C93S 质粒; 在1.5 毫升微离心管中降低了血清培养基。
      1. 分析野生型 Rb 及其 sumo 缺陷突变体的相扑共轭, 混合10和 #181; g 6 xhis 标记的 Rb 或 Rb-K720R 质粒连同 GFP-SUMO1 (10 和 #181; g) 在500和 #181; 在 1.5 mL 微离心机中降低血清培养基管 13 .
    3. 同时, 在一个单独的管中, 混合50和 #181; l 转染试剂 (见 材料表 ) 在500和 #181; l 降低血清培养基, 室温孵育5分钟。
    4. 完全结合上述两个单独的管, 并在室温下孵育15分钟. 将转染试剂/质粒配合物添加到细胞中, 并继续培养8h 在 5% CO 2 和37和 #176; C.
    5. 用培养基取代还原培养基, 在正常培养条件下孵育细胞48小时后转染.
  2. 镍亲和力拉下 6 xhis 标记的 Rb 蛋白.
    1. 溶解转染的 HEK293 细胞并提取总蛋白, 如描述的 1.3.1.
    2. 离心机裂解在 1.8万 x g 的30分钟, 在4和 #176; c. 仔细收集清和转移到清洁管.
      注: 在这一点上, 蛋白质可以冻结在6月以上的-80 和 #176; C.
    3. 为以后的西部印迹准备每个样本的输入控制, 将上面描述的清的一小部分保存到一个新的管道上, 并存储在-80 和 #176; C.
    4. 洗涤25和 #181; 50% 镍三酸 (Ni-NTA) 琼脂糖珠与帕缓冲两次在1.5 毫升微离心管为每个样品。收集的珠子离心 3000 x g 为3分钟, 在4和 #176; C.
    5. 将1米咪唑添加到每个样品中以获得最终浓度10毫米。然后, 将每个样品添加到含有制备的 NTA 琼脂糖珠的试管中.
    6. 在4和 #176 上孵育珠子和裂解的2小时; C 温和旋转。旋转珠子在 3000 x g 为3分钟在4和 #176; C, 并且小心地去除清由移。为避免珠损, 请勿将珠子吸干.
    7. 用1毫升洗涤缓冲液洗涤含有 20 mM 咪唑的珠子 ( 表 1 )。每一次, 在4和 #176 的旋转, 混合管; c 为15分钟, 在 3000 x g 处旋转3分钟, 在4和 #176; c, 并丢弃清.
    8. 最后一次洗涤后, 添加30和 #181; 洗脱缓冲液中含有250毫米咪唑 ( 表 1 ), 每个样品和轻弹混合。然后, 孵育20分钟, 在4和 #176; C 洗蛋白质.
    9. 将每个示例与6和 #215 混合; SDS-页加载缓冲区 ( 表 1 )。然后, 在100和 #176 的试管中孵育; C 在热块中为 10 min.
    10. 离心机在 1.2万 x g 为1分钟颗粒的珠子。仔细收集清不干扰珠子, 并转移样品到1.5 毫升微离心管。样品可以用印迹或-20 和 #176 的方法储存, 以备以后使用.

3。西部印迹

  1. 将从先前步骤中获得的沉淀或拉下的样本加载到4-20% 渐变 SDS 页凝胶中。在120伏进行电泳90分钟分离蛋白质.
  2. 将 electroblotting 在300毫安的氟 (PVDF) 膜上的蛋白质从凝胶中转移到90分钟, 在4和 #176; C 使用坦克转移法。在室温下, 在含有5% 脱脂牛奶 ( 表 1 ) 的块缓冲中, 将 PVDF 膜阻挡在1小时内.
  3. 在4和 #176 过夜的抗体稀释缓冲液中孵育含有3% 牛血清白蛋白 (BSA) ( 表 1 ) 的原抗体的膜;对于主要抗体, 使用0.5 和 #181 的工作浓度; g/毫升 (anti-SUMO1 抗体), 或稀释 1:2000 (抗 Rb 和抗蛋白抗体), 或 1:5, 000 (抗 GFP 和抗他的抗体).
  4. 每次使用1x 的三缓冲盐水 (TBST) 缓冲 ( 表 1 ) 将膜冲洗10分钟。用种特异性辣根过氧化物酶 (HRP) 孵育膜, 在含有5% 脱脂牛奶 ( 表 1 ) 的块缓冲液中稀释1:5、000的共轭二抗体。每次使用 1x TBST 缓冲液清洗膜 3x 10 分钟.
  5. 用增强化学发光 (ECL) 工作溶液孵育膜。用塑料包覆膜, 根据信号强度将其暴露在 x 光胶片上.

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Representative Results

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为了在细胞周期进展过程中检测内源性 Rb sumo, 本研究首先在五不同的细胞周期 (G0、早期 G1、G1、S 和 G2/M) 中同步 HEK293 细胞, 如本文的协议部分所述。使用碘碘化物的核酸染色和流式细胞仪分析 (图 1) 确认了同步的质量。其次, 通过变性帕缓冲液收集和裂解细胞。相扑蛋白酶抑制剂, n-Ethylmaleimide, 被添加到最后浓度20毫米, 以保存本地相扑信号在实验。在沉淀的内源性 Rb 物种在变性条件下, 以阻止价不相互作用, 和以下的西方印迹使用 anti-SUMO1 抗体, 在相扑信号的存在是专门检测到早期 G1 阶段 (图 2)。虽然全局 sumo 在 S/G2/M 阶段得到了增强, 但在 Rb sumo 的时间点, 它没有改变 (图 2, 输入面板)。这一发现表明, Rb 的 sumo 不只是改变全球相扑共轭活动的结果。结果表明, 本文所描述的蛋白质沉淀和免疫印迹分析可以检测内源性 Rb 蛋白的 sumo。

为了检测 rb 蛋白的强迫 sumo, 本研究通过将唯一的相扑 E2 连接 Ubc9 融合到它的 C 终端, 生成了一个本构 SUMOylated rb 结构, 从而可以有效和选择性地 sumo rb (图 3a)。功能突变的 Ubc9, C93S, 也被融合到 C 终端的 Rb 作为一个控制 (图 3a)。为了进一步加强相扑-Rb 信号的特异性, non-fused Ubc9 单独建造。所有四的他标记的质粒被转染为48小时前的 HEK293 细胞, 在它们被裂解在帕缓冲中, 并辅以20毫米 n-Ethylmaleimide。所有的蛋白质, 然后接受了拉下来的化验, 如本文的协议部分所述。用免疫印迹法分析了洗 Rb 蛋白。使用 anti-SUMO1 抗体 (图 3B, SUMO1 面板) 检测到 Rb 的 Ubc9 融合定向 sumo, 而 Ubc9 缺陷突变, C93S, 无法产生此信号。注意, 由 Ubc9-fusion 引起的高效率的相扑改变导致了更高的分子量带, 甚至可以直接使用 rb 抗体检测, 它对应于相扑信号 (图 3B, rb 面板)。此外, Ubc9 单独没有造成任何相扑共轭, 进一步确认 Rb 特定的 sumo (图 3B)。

由于 SUMO1 是共轭的720的 rb 蛋白11, 为了进一步分析 rb sumo, 这项研究产生了一个相扑缺陷的突变, 取代这种赖氨酸残留与精氨酸 (K720R)。为了便于检测两个瞬时表达的 Rb 蛋白的相扑结合, 增加了一个 GFP-SUMO1 结构来增强胞内相扑信号。他标记的野生类型或突变 Rb 被 co-transfected 入 HEK293 细胞与 GFP-SUMO1, 其次是拉下化验和分析 Rb-SUMO1 共轭能力。正如观察到的那样, K720R 突变体完全取消了对 rb 的修改, 进一步加强了所提出的方法检测 rb sumo 的能力 (图 4)。

Figure 1
图 1: 流式细胞仪对细胞周期同步测定的验证.HEK293 细胞的培养和同步在 G0, 早期 G1, G1, S 和 G2/M 阶段的细胞周期如本协议所述。细胞周期分布是由荧光活化的细胞分类 (外地) 确定的。所代表的数据显示了对外地资产管制署的定量分析的一个例子 (n = 1)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: Rb 在早期 G1 阶段 SUMOylated.HEK293 细胞在细胞周期的不同阶段被同步, 如本协议所述。细胞被收集并且裂解在帕缓冲补充了以20毫米 n-Ethylmaleimide。输入控制加载在 4%-20% SDS 页梯度凝胶, 转移, 并涂抹 anti-SUMO1 和反蛋白, 如所示。其余的细胞裂解, 然后受到沉淀使用抗 Rb 抗体在稀释1:200。采用 anti-SUMO1 抗体和抗 Rb 抗体, 用 4%-20% SDS-页梯度凝胶和 immunoblotted 分离结果剂。这个实验重复了两次, 结果相同。此图已通过权限13进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.测定 Rb-Ubc9 融合蛋白的相扑修饰.(A) Ubc9 融合定向 sumo (ufd) 构造的图 (B) 由 ufd 引起的 rb 的本构 sumo。HEK293 细胞瞬时转染他的标记的 ufd 结构是裂解在帕的缓冲区与20毫米 n-Ethylmaleimide。每个样品的总裂解液与镍-NTA 琼脂糖珠一起孵化, 以拉下他的标签 Rb-Ubc9 融合蛋白或 Ubc9 (用作阴性对照), 分别。用 4%-20% SDS-页梯度凝胶分离纯化蛋白, immunoblotted anti-SUMO1 和抗他抗体。他的 Rb: 6XHis 标签 Rb-Ubc9 融合蛋白;His-Ubc9: 6XHis 只标记 Ubc9。Rb-Ubc9: 未修改的 Rb-Ubc9;Rb-Ubc9-S: SUMOylated Rb-Ubc9;Hyper-pRb-Ubc9: 超磷酸化 Rb-Ubc9。图中显示的结果是三独立试验的代表。此图已通过权限13进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.相扑缺陷的 K720R 突变减少了 Rb 的 sumo.HEK293 细胞瞬时 co-transfected 与野生类型或突变 Rb-他的结构连同 GFP-SUMO1。细胞被收集并且裂解在帕缓冲补充了以20毫米 n-Ethylmaleimide。裂解的一小部分被西方印迹直接分析为输入控制。其余的裂解被孵化与镍 NTA 琼脂糖珠, 以拉下他的标签 Rb 蛋白质如本议定书所述, 他们是 immunoblotted 与 anti-SUMO1 和抗他的抗体。注意, lysine-to-arginine 突变在720的 Rb艾丽废除了相扑对这种蛋白质的修饰。该实验曾与先前报告的11的结果类似。此图已通过权限13进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.

解决 组件 评论
帕裂解缓冲液 50毫米三, pH = 8.0;150毫米氯化钠;1% NP-40;1% 胆酸钠;0.1% SDS 在使用前立即加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒和 n-ethylmaleimide。
洗涤缓冲器 50 mM NaH2PO4 pH = 8.0;300毫米氯化钠;20毫米咪唑 仅用于下拉试验
洗脱缓冲器 50 mM NaH2PO4 pH = 8.0;300毫米氯化钠;250毫米咪唑 仅用于下拉试验
6x 加载缓冲区 0.5 M 三, pH = 6.8;30% 甘油;10% SDS;5% β-基;0.1% 溴蓝色 贮存在-20 ° c
10x 运行缓冲区 0.25M 三, pH 值 8.6;1.9M 甘氨酸;1% SDS 要使1x 运行缓冲区: 混合 100 ml 10x 运行缓冲区与900毫升 ddH2O
10x 传输缓冲区 0.25 m 三, pH 8.3, 1.9 m 甘氨酸 要使1x 传输缓冲区: 混合100毫升10x 传输缓冲区与200毫升甲醇和700毫升 ddH2O
10x TBS 缓冲器 在 ddH 的 1 L 中2O: 24.08 克, 三 pH 7.4;80克氯化钠 要使 1x TBST 缓冲区: 混合100毫升 10x TBS 缓冲区与900毫升 ddH2O 和1毫升的 Tween-20
阻塞缓冲区 1x TBST 5% 脱脂干奶 在使用前立即准备缓冲区
抗体稀释缓冲液 1x TBST 与 3% BSA 和0.02% 叠氮化钠 这个缓冲器可以存储在4° c 至少6月

表 1: 解决方案和缓冲区。

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Discussion

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本文介绍了一种检测和分析人体细胞 Rb 的内源性 sumo 的协议。由于这种方法是专门针对内源性 rb 蛋白没有任何变化的全球相扑相关的信号, 它是一个重要的工具, 调查 Rb-相扑在完全自然的生理环境。

为了达到这个目的, 重要的是要记住: 1) 虽然相扑包括四个异构体 (SUMO1-4, 每个编码不同的基因) 相比, 泛, 所有的相扑物种都少得多;2) 对于大多数相扑靶蛋白, 只有一小部分的特定蛋白质是 SUMOylated 在稳态, 这是在相扑共轭酶和降解14,21之间的持续竞争的结果。3) 相扑目标可以经历 sumo 和 deSUMOylation 的快速循环。例如, 本文作者最近获得的数据表明, 在早期的 G1 阶段, Rb-SUMO1 只存在于非常短的时间窗口, 这与 sumo 是可逆的、高度动态的过程的概念是一致的13.所有这些事实都使得直接检测特定蛋白质的内源性 sumo 具有挑战性。因此, 要成功地检测到这一点, 必须确定发生此修改的确切条件。例如, 在这个提议的协议中, 单元周期同步的时间是检测 Rb sumo 的关键。一个优化的实验程序对于成功地检测某一特定蛋白质的低级相扑品种也很重要。例如, 适当的超声或通过针可以防止由于基因组 DNA 而形成粘性和粘性成分, 因此适当的超声可以促进总蛋白的提取。此外, 良好的单克隆抗体对靶蛋白有很强的亲和力, 有助于提高沉淀的数量和特异性。总之, 该方法对于进一步探索 SUMOylated 内源性 Rb 的生理条件是非常重要的, 这是以下 overexpression-based 功能测定的前提。

为了放大给定蛋白质的相扑信号, 在细胞中 co-overexpress 这种蛋白以及其他与相扑相关的蛋白质 (通常是 Ubc9 和相扑蛋白) 是很常见的。虽然一个简单的西方印迹使用的抗体对基板是最容易的方法找到更高的分子量, SUMOylated 形式的这种蛋白质, 我们没有发现的相扑-Rb 信号的方法。因此, 本文仅就一种测定沉淀外源 Rb 蛋白的相扑修饰方法进行了研究。此外, 该方法还描述了如何人为地提高或消除 Rb 的相扑共轭。作为唯一的 E2 连接, Ubc9 已被发现直接转移相扑的具体目标22。因此, 通过对 rb 的 C 终端的融合, Ubc9 极大地促进了铷的改性. 利用这种方法, 本文作者成功地证明了 rb 的 sumo 通过增加其结合力, 充分促进了其自身的磷酸化为 CDK213。此外, 为了研究 rb sumo 损失的功能后果, 作者产生了一个相扑缺陷的 rb 结构, 如先前所报告的11。利用本论文提出的方法, 证明了在正常的细胞周期进展和细胞增殖过程中, 相扑 Rb 是必要的13

除了 SUMO1, SUMO2 和 SUMO3 还在蛋白质 sumo14,17中扮演重要角色。SUMO2 和 SUMO3 通常被称为 SUMO2/3, 因为它们是密切相关的, 并共享97% 身份。SUMO1 与 SUMO2/3 有着50% 的相似之处。人们普遍认为, SUMO1 负责正常的细胞生理功能和维护, 而 SUMO-2/3 主要涉及细胞应激反应15,17,23,24. 考虑到 rb 也可以由未知函数12的 SUMO2/3 SUMOylated, 因此本研究中提出的方法仍然适合于对 rb 的这种修改进行检测和分析。除 Rb 外, 本文所述方法可广泛应用于各种靶蛋白 sumo 的检测和功能分析。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了上海科学技术委员会 (grant No. 14411961800) 和中国国家自然科学基金 (grant No. 81300805) 的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM  Thermo Fisher Scientific 31985070
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 26140079
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
Thymidine Sigma T9250
Nocodazole Sigma M1404
propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566
Triton X-100  AMRESCO 694
RNase A  Thermo Fisher Scientific EN0531
N-Ethylmaleimide Sigma E3876 
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) AMRESCO M107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40) AMRESCO M158
protease inhibitor Roche 5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-2025
Rb antibody Cell Signaling Technology #9309
Protein A/G-Sepharose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003
Lipofectamine-2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads Qiagen 30230
Imidazole Sigma I0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel BIO-RAD 4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane Millipore IPVH00010
Tween-20 AMRESCO M147
Tubulin antibody Abmart M30109
SUMO1 antibody Thermo Fisher Scientific 33-2044
GFP antibody Abmart M20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories 715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) Kit Thermo Fisher Scientific 32106

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References

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<em>在体内</em>人细胞 Rb 蛋白 sumo 的检测与分析
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Meng, F., Li, X., Ren, H., Qian, J. In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells. J. Vis. Exp. (129), e56096, doi:10.3791/56096 (2017).More

Meng, F., Li, X., Ren, H., Qian, J. In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells. J. Vis. Exp. (129), e56096, doi:10.3791/56096 (2017).

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