Summary
Kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) Familie Proteine sind an Lysin-Reste von Zielproteine, verschiedene zelluläre Prozesse regulieren konjugiert. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von Retinoblastom (Rb) Protein Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen.
Abstract
Die post-translationalen Modifikationen von Proteinen sind entscheidend für die richtige Regulierung der intrazellulären Signaltransduktion. Unter diesen Änderungen ist kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) ein Ubiquitin-wie Protein, das die Lysin-Rückstände verschiedener Zielproteine zu regulieren zelluläre Prozesse wie Gentranskription, DNA-Reparatur, Protein kovalent verbunden ist Interaktion und Abbau, subzelluläre Transport und Signaltransduktion. Die gängigste Methode zur Erkennung von Protein Sumoylierung basiert auf den Ausdruck und die Reinigung von rekombinanten tagged Proteinen in Bakterien, so dass für eine in-vitro- biochemische Reaktion, die ist einfach und eignet sich für den Umgang mit mechanistischen Fragen. Aufgrund der Komplexität des Prozesses der Sumoylierung in Vivoist es jedoch schwieriger zu erkennen und zu analysieren, Protein Sumoylierung in Zellen, vor allem unter endogenen Bedingungen. Eine aktuelle Studie von den Autoren dieses Artikels ergeben, dass endogene Retinoblastom (Rb) Protein, ein Tumorsuppressor, die entscheidend für die negative Regulierung des Zellzyklus Progression, speziell sumoyliert in der frühen G1-Phase. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Analyse von Rb Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen. Dieses Protokoll eignet sich für die phänotypische und funktionelle Untersuchung der SUMO-Änderung der Rb, sowie viele andere SUMO-gezielte Proteine in menschlichen Zellen.
Introduction
Die genaue Steuerung der Zellzyklus Progression in eukaryontischen Zellen beruht auf einer engen regulatorischen Netzwerk sorgt dafür, dass bestimmte Ereignisse in einer geordneten Art und Weise1,2stattfinden. Einer der wichtigsten Akteure in diesem Netzwerk ist das Retinoblastom (Rb)-Protein, das erste geklonte Tumorsuppressor1,3. Das Rb-Protein wird angenommen, dass ein negativer Regulator der Zellzyklus Progression, vor allem für die G0/G1 S Phasenübergang und Tumor Wachstum4,5. Ausfall der Rb führt entweder direkt auf die am häufigsten verwendeten intraokularen Bösartigkeit bei Kindern, Retinoblastom, oder trägt zur Entwicklung von vielen anderen Arten von Krebs5. Darüber hinaus engagiert sich die Rb in viele zelluläre Signalwege einschließlich der Zelldifferenzierung, Chromatin umgestalten und Mitochondrien-vermittelten Apoptose3,6,7.
Post-translationalen Modifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des RB Funktion8,9. Phosphorylierung ist eine solche Änderung, und es führt in der Regel zu Rb Inaktivierung. In ruhenden G0-Zellen ist Rb aktiv mit einem niedrigen Phosphorylierung. Fortschritt durch G0/G1-Phase Zellen, ist Rb sequenziell hyper phosphoryliert durch eine Reihe von cyclin-abhängige Proteinkinasen (CDKs) und Cyclin, z. B. cyclin E/CDK2 und cyclin D/CDK4/6, die Rb zu inaktivieren und seine Fähigkeit, Zellzyklus unterdrücken zu beseitigen im Zusammenhang mit gen-Ausdruck4,10. RB konnte auch durch kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO)11,12,13geändert werden.
SUMO ist ein Ubiquitin-wie Protein, das eine Vielzahl von Zielproteinen kovalent verbunden ist. Es ist wichtig für verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich der Regulierung des Zellzyklus, Transkription, Protein zellulären Lokalisation und Abbau, Transport und DNA-Reparatur14,15,16, 17 , 18. der SUMO Konjugation Weg besteht aus dimeres SUMO E1 aktivierende Enzym SAE1/UBA2, der einzigen E2 conjugating Enzym Ubc9 und mehrere E3 Ligases SUMO-spezifische Proteasen. Im Allgemeinen müssen im Entstehen begriffenen SUMO Proteine proteolytisch verarbeitet werden, um die ältere Form zu erzeugen. Reife SUMO ist durch E1-Heterodimer aktiviert und dann auf das Enzym E2 Ubc9 übertragen. Schließlich die C-terminale Glycin Sumo ist kovalent an die Ziel-Lysin eines Substrats konjugiert, und dieser Prozess wird in der Regel durch E3 Ligases erleichtert. Das SUMO Protein kann durch spezifische Proteasen aus dem modifizierten Substrat entfernt werden. Eine frühere Studie von den Autoren dieses Papiers ergab, dass Sumoylierung Rb die Bindung an CDK2 erhöht, führt zu hyper-Phosphorylierung bei der frühen G1-Phase, ein Prozess, der für Zellzyklus Fortschreiten13notwendig ist. Wir zeigten auch, dass der Verlust der Rb Sumoylierung eine verminderte Zellvermehrung verursacht. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass die Sumoylierung Rb proteasomalen Umsatz, das Rb-Protein schützt somit die Erhöhung des Rb-Protein in Zellen19. Daher spielt Sumoylierung eine wichtige Rolle bei Rb-Funktion in verschiedenen zellulären Prozessen. Weiter zu studieren der funktionalen Konsequenz und physiologische Relevanz von Rb Sumoylierung, ist es wichtig, eine wirksame Methode um die SUMO-Status der Rb in menschlichen Zellen oder Geweben Patienten analysieren zu entwickeln.
Sumoylierung ist eine reversible, hoch dynamischen Prozess. So ist es in der Regel schwer zu erkennen, die SUMO-modifizierte Proteine vollständig endogenen Bedingungen. Dieses Papier stellt eine Methode, um endogene Rb Sumoylierung zu erkennen. Außerdem zeigt es, wie exogene Rb Sumoylierung Wildtyp Rb und seine SUMO-defizienten Mutation11erkannt. Jacobs Et Al. beschrieben vor allem eine Methode, um die SUMO-Änderung eines bestimmten Substrats speziell von Ubc9 unter der Regie von Fusion Sumoylierung (UFD)20erhöhen. Basierend auf dieser Methode, beschreibt dieses Protokoll die erzwungene Sumoylierung Rb und seiner funktionellen Konsequenzen zu analysieren. Da die Hunderte von SUMO Substrate bisher beschrieben worden sind und weitere vermeintliche SUMO Substrate aus vielen Proteomic basierende Assays identifiziert wurden, kann dieses Protokoll angewendet werden, um die SUMO-Modifikation dieser Proteine in menschlichen Zellen zu analysieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Erkennung von endogenen Rb Sumoylierung in der Frühphase G1
- Zell-Kultur und Zellzyklus Synchronisation.
- Pflegen HEK293 Zellen im Dulbecco-haltigem Wachstumsmedium ' s Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 1 % Pen-Strep und 10 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 37 ° C und 5 % CO 2 in einem Inkubator.
- Synchronisieren der HEK293 Zellen in der G0-Phase.
- Zählen die HEK293 Zellen mit einem Hemocytometer und Samen ~1.5 X 10 7 Zellen in ein 15 cm mit 25 ml Wachstumsmedium für 24 h vor der Behandlung Schüssel. Nach dem Erreichen eines Zusammenfluss von 70-80 %, Absaugen, Medium und waschen die Zellen zweimal mit 5 mL vorgewärmt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Fügen Sie 25 mL DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin und die Zellen bei 37 ° C inkubieren Sie für 72 h waschen Sie die Zellen aus der Platte mit 3 mL eiskaltem PBS. Übertragen Sie die Zellen in eine neue 5-mL-Tube.
- Vorbehaltlich Zellzyklus Analyse einen kleinen Teil der Zellen durch Durchflusszytometrie (Schritt 1.2); die verbleibenden Mehrheit der Zellen durch Zentrifugation bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur zu sammeln, und dann speichern Sie sie in ein Ultra-niedriger Temperatur Gefrierschrank bis zur Analyse der Rb Sumoylierung.
- G1-Phase zu erhalten am Ende des Synchronisierungsprozesses G0-Zellen, die DMEM entfernen und hinzufügen wieder frische Wachstumsmedium, wodurch die HEK293 Zellen der Zellzyklus erneut eingeben zu müssen. Dann sammeln die Zellen in verschiedenen Phasen G1 (frühen G1: 30 min; G1: 2 h) für Zellzyklus Analyse und weitere SUMO assay.
- Synchronisieren der HEK293 Zellen in der S-Phase mit der Doppel-Thymidin-Block-Methode.
- Wachsen HEK293 Zellen eine Konfluenz von 50 % und waschen Zellen mit vorgewärmte PBS. Fügen Sie dann Wachstumsmedium ergänzt mit 2,5 mM Thymidin für 18 h (erster Block).
- Das Thymidin-haltigen Medium zu entfernen und dann die Zellen zweimal mit vorgewärmte PBS waschen. Fügen Sie frisches Wachstumsmedium für 14 h, die Zellen freizugeben.
- Das Medium mit einer Pipette zu verwerfen und fügen Wachstumsmedium ergänzt mit 2,5 mM Thymidin für eine weitere 18 h (2. Block) vor der Durchführung einer Analyse des Zellzyklus und Rb Sumoylierung.
- Für G2/M-Synchronisation, Platte ~1.5 × 10 7 HEK293 Zellen auf einen 15 cm Teller mit 25 mL Wachstumsmedium für 24 h. Fügen Sie Nocodazole auf das Medium, bis eine Endkonzentration von 400 ng/mL erreicht ist. Zu guter Letzt die Zellen für 16 h vor der Durchführung der Analysis des Zellzyklus und Rb Sumoylierung inkubieren.
- Zellzyklus Analyse von Durchflusszytometrie.
- Wieder aussetzen der synchronisierten HEK293 mit PBS-Puffer und dann fix die Zellsuspension mit eiskalten 70 % Ethanol für 2 h bei 4 ° c beachten Sie, dass zu minimieren, clustering-Zelle, die Zellsuspension tropfenweise hinzufügen das eiskalte 100 % Ethanol, eine Endkonzentration von zu erhalten 70 % Ethanol während sanft aufschütteln.
- Die Zellen für 5 min bei 500 X g Zentrifugieren dann sorgfältig überstand verwerfen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Wiederholen Sie den Schritt Zentrifuge.
- Hinzufügen 500 µL PBS mit 50 µg/mL-Nukleinsäure Fleck Propidium Jodid, 0,1 % Triton X-100 und 1 µg/mL RNase A zu den Zellen und gut mischen. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei 37 ° c
- Speichern die Proben bei 4 ° C bis zur Analyse von Durchflusszytometrie.
- Immunopräzipitation des endogenen Rb-Proteins.
- Bereiten die HEK293 Zelle Lysates.
- Lyse der synchronisierten HEK293 Zellen sanft wieder aussetzen sie in 1 mL eiskaltes Radio-Immunopräzipitation (RIPA) Lyse Testpuffer (Tabelle 1) frisch mit 20 mM N-Ethylmaleimide, ein Isopeptidase-Inhibitor hinzugefügt, die konnte SUMO Proteasen zu blockieren und zu stabilisieren SUMO Konjugate.
- Weitere Homogenisierung der Zellen auf Eis durch Dounce Homogenisierung, Beschallung oder Durchreise durch 10 Mal eine Nadel 21 G auf einer 2 mL Spritze. Inkubieren Sie dann die Zellen auf Eis für 5 min.
Hinweis: Die anionische Detergenzien Dodecyl Natriumsulfat (SDS) im RIPA Puffer ist entscheidend für die spätere Bestimmung der Rb-SUMO, da es das unspezifische SUMO-Signal beseitigen könnte, das aus der nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen der Rb-Protein und anderen abgeleitet ist nicht-Rb SUMO-Art.
- Zentrifugieren der Zelle Lysates bei 18.000 x g für 30 min bei 4 ° c die Überstände an neuen 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren übertragen.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proteine können bei-80 ° C für mindestens 6 Monate gelagert werden. - Um das Eingabesteuerelement jeder Probe der späteren Western-Blot vorzubereiten, speichern Sie einen kleinen Teil der oben beschriebenen Überstand auf eine neue Röhre und speichern bei-80 ° c
- 1 µg von unspezifischen Maus Immunglobulin G (IgG) der gleichen Spezies und Isotype Agrega zu den oben genannten Überstände der monoklonalen Antikörper Rb und 20 µL 50 % Protein A/G-Sepharose Gülle. Dann 1 h bei 4 ° C mit sanften Drehung inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C. sorgfältig die Überstände ohne zu stören die Perlen zu sammeln, und übertragen Sie sie auf neue 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren. Jedes der Beispiele fügen Sie 5 µL Rb Primärantikörper und 40 µL 50 % Protein A/G-Sepharose Gülle hinzu. Dann über Nacht bei 4 ° C mit sanften Drehung inkubieren.
- Sammeln die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch pipettieren. Beachten Sie, dass zur Vermeidung von Verlust der Wulst, aspirieren Sie trockenen Perlen nicht.
- Waschen die Perlen viermal mit 1 mL des Puffers RIPA. Jedes Mal, mischen die Rohre gut durch Rotation bei 4 ° C für 15 min. sammeln die Perlen von langsamem Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C und verwerfen Sie die Überstände.
- Nach der Entfernung der letzten Wäsche Überstände, erneut unterbrechen die Perlen in 30 µL 1 x Natrium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) laden Puffer (Tabelle 1) und gut mischen.
- Inkubieren blockieren die Rohre bei 100 ° C in die Hitze für 10 min Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 1 min um die Perlen zu Pellets. Sorgfältig die Überstände ohne zu stören die Perlen zu sammeln, und übertragen Sie sie auf 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.
- Analysieren die Proben von 4-20 % Steigung SDS-PAGE gel und Western blot oder bei-20 ° C für die spätere Verwendung zu speichern.
- Bereiten die HEK293 Zelle Lysates.
2. Analyse der 6XHis-tagged exogene Rb Sumoylierung in menschlichen Zellen
- Zell-Kultur und Transfektion.
- Samen ~ 6 × 10 6 HEK293 Zellen in ein 10 cm Schale und inkubieren Sie für 24 h im Wachstumsmedium unter normalen Zelle Kulturbedingungen, 75-85 % konfluierende Zellen zu erwerben. Vor Transfektion, entfernen das Wachstumsmedium und 6 mL vorgewärmte reduzierte Serum-Medium (siehe Tabelle der Materialien) und legen Sie dann das Geschirr wieder in den Inkubator.
- Für Rb konstitutive Sumoylierung Assay, bzw. 15 µg 6XHis-tagged Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT und Ubc9-C93S-Plasmide in 500 µL reduzierte Serum Medium in 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren, hinzufügen.
- Zu analysieren, die SUMO-Konjugation der Wildtyp Rb und seine Sumoylierung-defekt-Mutante, 10 µg entweder 6XHis-tagged Rb-WT oder Rb-K720R Plasmid zusammen mit GFP-SUMO1 mischen (10 µg) in 500 µL reduziert Serum Medium in 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhrchen 13.
- Unterdessen in einem separaten Rohr mix 50 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) in 500 µL Serum Medium reduziert und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min.
- Voll kombinieren die zwei separate Röhren, die oben beschriebenen und Inkubation bei Raumtemperatur 15 Minuten hinzufügen die Transfektion Reagenz/Plasmid-komplexe, die Zellen und weiterhin Kultur für 8 h bei 5 % CO 2 und 37 ° c
- Ersetzen Sie reduzierte Serum Medium mit Wachstumsmedium und inkubieren Sie die Zellen unter normalen Kulturbedingungen für 48 h nach Transfektion.
- Nickel Pulldown-Affinität des Rb 6XHis-tagged Proteins.
- Die transfizierten HEK293 Zellen lysiert und die gesamten Proteine als beschriebenen Abschnitt 1.3.1 extrahieren.
- Zentrifuge der Zelle Lysates bei 18.000 x g für 30 min bei 4 ° C. sorgfältig sammeln die Überstände und übertragen Sie sie auf saubere Rohre.
Hinweis: Das Protein eingefroren werden kann an dieser Stelle für mehr als 6 Monate bei-80 ° c - Um das Eingabesteuerelement jeder Probe der späteren Western-Blot vorzubereiten, speichern Sie einen kleinen Teil der Überstände oben beschrieben, eine neue Röhre und speichern bei-80 ° c
- Waschen 25 µL 50 % nickel Nitrilotriacetic Säure (Ni-NTA) Agarose Korne mit RIPA Puffer zweimal in einem 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen für jede Probe. Sammeln Sie die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° c
- Add 1 M Imidazol zu jeder Probe, eine Endkonzentration von 10 mM zu erhalten. Fügen Sie dann jede Probe in das Röhrchen mit der vorbereiteten Ni-NTA Agarose Korne.
- Inkubieren Sie die Perlen und die Lysates für 2 h bei 4 ° C mit sanften Drehung. Drehen Sie die Perlen bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C, und entfernen Sie vorsichtig die Überstände durch pipettieren. Aspirieren Sie um Perlen zu vermeiden, nicht die Perlen trocken.
- Waschen die Perlen mit 1 mL Waschpuffer mit 20 mM Imidazol (Tabelle 1). Jedes Mal, mischen die Rohre gut durch Rotation bei 4 ° C für 15 min. sammeln die Perlen von Spinnen bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C und verwerfen die Überstände.
- Nach dem letzten Waschen jede Probe 30 µL Elution buffer mit 250 mM Imidazol (Tabelle 1) hinzu und wechseln Sie um zu mischen. Dann 20 min bei 4 ° C, die Proteine eluieren inkubieren.
- Mischen jede Probe mit 6 × SDS-PAGE laden Puffer (Tabelle 1). Dann, brüten die Rohre bei 100 ° C in einem Hitze-Block für 10 min.
- Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min um die Perlen zu Pellets. Sorgfältig die Überstände ohne zu stören die Perlen zu sammeln, und die Proben auf 1,5 ml Mikro-Zentrifuge Rohre übertragen. Die Proben von Western-Blot analysiert oder bei-20 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden können.
3. Western-Blot
- laden die Immunopräzipitation oder pull-down Proben aus den vorherigen Schritten auf 4-20 % Steigung SDS-PAGE Gelen. Durchführung von Elektrophorese bei 120 V für 90 min um die Proteine zu trennen.
- Übertragen die Proteine aus dem Gel auf eine Membran Polyvinylidene Difluoride (PVDF) von Elektroblotting bei 300 mA für 90 min bei 4 ° C mit der Tank-Transfer-Methode. Blockieren die PVDF-Membran in mit 5 % Magermilch (Tabelle 1) für 1 h bei Raumtemperatur-Blockpuffer.
- Inkubation der Membran mit Primärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper enthält 3 % Rinderserumalbumin (BSA) (Tabelle 1) über Nacht bei 4 ° C. Verwenden Sie für primären Antikörper eine arbeiten-Konzentration von 0,5 µg/mL (Anti-SUMO1 Antikörper) oder einer Verdünnung von 1: 2000 (Anti-Rb und Anti-Tubulin Antikörper) oder 1:5,000 (Anti-GFP und Anti-His Antikörper).
- Waschen die Membran 3 X für 10 min jeweils mit 1 x Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween (TBST) Puffer (Tabelle 1). Inkubieren Sie die Membran mit Arten bestimmten Meerrettich Peroxidase HRP-konjugierten Sekundärantikörper verdünnten 1:5,000 in Blockpuffer, enthält 5 % Magermilch (Tabelle 1). Waschen Sie die Membran 3 X für 10 min jeweils mit 1 Puffer X TBST.
- Inkubieren Sie die Membran mit verstärkte Chemilumineszenz (ECL) Lösung arbeiten. Die Membran mit Plastikfolie abdecken und setzen Sie es je nach Signalstärke Röntgenfilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um endogene Rb Sumoylierung während Zellzyklus Progression zu erkennen, synchronisiert diese Studie zunächst HEK293 Zellen in fünf verschiedenen Phasen des Zellzyklus (G0, frühe G1, G1, S und G2/M), wie im Abschnitt "Protokoll" dieses Artikels beschrieben. Die Qualität der Synchronisation wurde bestätigt, indem die Nukleinsäure-Fleck mit Propidium Jodid gefolgt von Flow-Zytometrie-Analyse (Abbildung 1). Als nächstes wurden die Zellen gesammelt und durch Denaturierung RIPA Puffer lysiert. Der SUMO-Proteasen-Inhibitor, N-Ethylmaleimide, wurde hinzugefügt, eine Endkonzentration von 20 mM, das native SUMO-Signal während der Experimente zu erhalten. Nach Immunopräzipitation der endogenen Rb Arten unter denaturierenden Bedingungen, die nicht-kovalente unspezifische Interaktion und der folgenden western-Blot mit einem Anti-SUMO1 Antikörper zu blockieren, die Anwesenheit des SUMO Signals festgestellt speziell bei der frühen G1-Phase (Abbildung 2). Obwohl die globale Sumoylierung in der S/G2/M-Phase im Zeit Punkt der Rb Sumoylierung erweitert wurde hatte es nicht (Abbildung 2, Eingabebereich) geändert. Dieser Befund legt nahe, dass die Sumoylierung Rb nicht einfach die Folge der veränderten globalen SUMO Konjugation Aktivität ist. So ermöglichen diese Ergebnisse zeigen, die das Protein Immunopräzipitation und Western blot Analyse, die in diesem Dokument beschriebenen für die Erkennung von Sumoylierung des endogenen Rb-Proteins.
Um die erzwungene Sumoylierung das Rb-Protein, diese Studie erzeugt erkennen konstruieren eine konstitutive sumoyliert Rb durch die Verschmelzung von Ubc9, die alleinige SUMO E2-Ligase seine C-Terminal ermöglicht effiziente und selektive Sumoylierung von Rb(Abbildung 3). Die Verlustfunktion-Mutation des Ubc9, C93S, ist auch für die C-terminale der Rb, dienen als Kontrolle(Abbildung 3)verschmolzen. Um die Spezifität der SUMO-Rb Signal weiter zu stärken, wurde auch ohne Sicherung Ubc9 allein gebaut. Alle vier sein-tagged Plasmide wurden transfiziert in HEK293 Zellen für 48 h, bevor sie im RIPA Puffer ergänzt mit 20 mM N-Ethylmaleimide lysiert wurden. Die Proteine wurden dann ein Pull-down-Assay, unterworfen, wie im Abschnitt "Protokoll" dieses Artikels beschrieben. Die eluierten Rb-Proteine wurden von Western-Blot analysiert. Die Ubc9 directed Fusion-Sumoylierung Rb erkannt wurde mit einem Anti-SUMO1 Antikörper (Abbildung 3B, SUMO1 Panel), während die Ubc9 defektive-Mutation, C93S, versäumt, dieses Signal zu produzieren. Beachten Sie, dass die hocheffiziente SUMO-Modifikation verursacht durch Ubc9-Fusion führt zu einer höheren Molekulargewicht Band, die könnte sogar direkt mit der Rb-Antikörper erkannt werden, und es entspricht der SUMO-Signal (Abbildung 3B, Rb-Panel). Außerdem verursachte Ubc9 allein keine SUMO-Konjugation weitere Bestätigung der Rb-spezifische Sumoylierung (Abbildung 3B).
Da SUMO1 an Lysin 720 der Rb Protein11konjugiert ist, um weiter zu analysieren, die Rb Sumoylierung dieser Studie generiert eine SUMO-defizienten Mutation durch das Ersetzen dieser Lysin-Reste mit einem Arginin (K720R). Um die Erkennung von SUMO-Konjugation der beiden vorübergehend zum Ausdruck gebrachten Rb Proteine zu erleichtern, wurde ein GLP-SUMO1 Konstrukt hinzugefügt, um den intrazellulären SUMO-Signal zu verbessern. Sein-tagged Wildtyp oder Mutant war Rb Co transfizierten in HEK293 Zellen zusammen mit GFP-SUMO1, gefolgt von Pull-down-Test und Analyse von Rb-SUMO1 Konjugation Fähigkeit. Wie beobachtet, die K720R mutierten abgeschafft völlig die SUMO-Modifikation von Rb, weitere Stärkung der vorgeschlagenen Methode Fähigkeit, Rb Sumoylierung (Abbildung 4) zu erkennen.
Abbildung 1 : Validierung des Zellzyklus Synchronisation Tests durch Durchflusszytometrie. HEK293 Zellen wurden kultiviert und synchronisiert bei G0, frühen G1, G1, S und G2/M Phasen des Zellzyklus wie beschrieben in diesem Protokoll. Zellzyklus-Distributionen wurden durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) ermittelt. Die dargestellten Daten zeigt ein Beispiel für die Quantitative Analyse der FACS-Assay (n = 1). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Rb ist in frühen G1-Phase sumoyliert. HEK293 Zellen wurden in verschiedenen Phasen des Zellzyklus synchronisiert, wie in diesem Protokoll beschrieben. Die Zellen wurden gesammelt und lysiert im RIPA Puffer mit 20 mM N-Ethylmaleimide ergänzt. Die Eingabesteuerelemente wurden auf einem 4-20 % SDS-PAGE gradient Gel geladen, übertragen und mit Anti-SUMO1 und Anti-Tubulin ausgelöscht, wie angegeben. Dann wurden die restlichen Zelle Lysates Immunopräzipitation mit Anti-Rb-Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 200 unterzogen. Die daraus resultierende Eluenten wurden von 4-20 % SDS-PAGE gradient Gel und Immunoblotted mit Anti-SUMO1 Antikörper und Anti-Rb Antikörper getrennt. Dieses Experiment wurde zweimal mit dem gleichen Ergebnis wiederholt. Diese Zahl wurde mit der Erlaubnis13geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Erkennung der SUMO-Änderung des Fusionsproteins Rb-Ubc9. (A) schematische Darstellung der Ubc9 unter der Regie von Fusion Sumoylierung (UFD) Konstrukte der Rb. (B) konstitutive Sumoylierung von Rb UFD zurückzuführen. HEK293 Zellen vorübergehend mit seinem getaggt UFD Konstrukte transfiziert wurden im RIPA Puffer mit 20 mM N-Ethylmaleimide lysiert. Gesamten lysate jeder Probe wurde mit Ni-NTA Agarose Korne, pull-down-Fusionsproteinen sein-tagged Rb-Ubc9 oder Ubc9 (verwendet als die negativ-Kontrolle), bzw. inkubiert. Der gereinigten Proteine wurden von 4-20 % SDS-PAGE gradient Gel und Immunoblotted mit Anti-SUMO1 und Anti-His Antikörper getrennt. Seine-Rb: 6XHis getaggt Fusionsproteine Rb-Ubc9; Seine-Ubc9: 6XHis markiert nur Ubc9. RB-Ubc9: unveränderte Rb-Ubc9; RB-Ubc9-s: sumoyliert Rb-Ubc9; Hyper-pRb-Ubc9: hyper phosphoryliert Rb-Ubc9. In der Abbildung dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Studien. Diese Zahl wurde mit der Erlaubnis13geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Die SUMO-defizienten K720R Mutation reduziert die Sumoylierung Rb. HEK293 Zellen wurden vorübergehend Co transfected mit den Wildtyp oder Mutant Rb-HSI Konstrukten zusammen mit GFP-SUMO1. Die Zellen wurden gesammelt und lysiert im RIPA Puffer mit 20 mM N-Ethylmaleimide ergänzt. Ein kleiner Teil der Lysates wurde direkt analysiert, von Western blot als input-Regler. Der Rest der Lysates inkubiert mit Ni-NTA Agarose Korne, pull-down sein-tagged Rb Proteine wie in diesem Protokoll beschrieben, und sie waren Immunoblotted mit Anti-SUMO1 und Anti-His Antikörper. Beachten Sie, dass die Lysin zu Arginin-Mutation bei 720 von Rb totVerbündeter schafft die SUMO-Modifikation dieses Proteins. Das Experiment wurde einmal mit durchgeführt ein ähnliches Ergebnis, dass bereits11berichtet. Diese Zahl wurde mit der Erlaubnis13geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Lösung | Komponenten | Kommentare |
| RIPA Lysis Puffer | 50 mM Tris, pH = 8,0; 150 mM NaCl; 1 % NP-40; 1 % Natrium Deoxycholate; 0,1 % SDS | Protease-Hemmer cocktail und N-Ethylmaleimide unmittelbar vor der Anwendung hinzufügen. |
| Waschpuffer | 50 mM NaH2PO4 pH = 8,0; 300 mM NaCl; 20 mM Imidazol | Für Pull verwendet down Assay nur |
| Elution Buffer | 50 mM NaH2PO4 pH = 8,0; 300 mM NaCl; 250 mM Imidazol | Für Pull verwendet down Assay nur |
| 6 x Ladepuffer | 0,5 M Tris, pH = 6,8; 30 % Glycerin; 10 % SDS; 5 % β-Mercaptoethanol; 0,1 % Bromphenol blau | Shop bei-20 ° C |
| 10 x laufen Puffer | 0,25 M Tris, pH 8,6; 1,9 M Glycin; 1 % SDS | 1 x laufen Puffer zu machen: Mischen Sie 100 ml 10 x laufen Puffer mit 900 mL DdH2O |
| 10 x Transfer Buffer | 0,25 M Tris, pH 8,3, 1,9 M Glycin | 1 x Transfer Buffer zu machen: Mischen Sie 100 mL 10 x übertragen Puffer mit 200 ml Methanol und 700 mL DdH2O |
| 10 X TBS Puffer | In 1 L DdH2O: 24.08 g Tris pH 7.4; 80 g NaCl | 1 x TBST Puffer zu machen: Mischen Sie 100 mL 10 X TBS Puffer mit 900 mL DdH2O und 1 mL Tween-20 |
| Puffer zu blockieren | 1 X TBST mit 5 % fettfreie Trockenmilch | Bereiten Sie den Puffer unmittelbar vor der Anwendung |
| Antikörper-Verdünnungspuffer | 1 X TBST mit 3 % BSA und 0,02 % Natriumazid | Dieser Puffer könnte bei 4 ° C für mindestens 6 Monate gelagert werden |
Tabelle 1: Lösungen und Puffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll zum erkennen und analysieren der endogenen Sumoylierung Rb in menschlichen Zellen. Da diese Methode speziell auf das endogene Rb-Protein ohne jede Abwechslung der globalen SUMO-bezogenen Signal ausgerichtet ist, ist es ein wichtiges Instrument für die Untersuchung von Rb-SUMO Modifikation unter völlig natürlichen physiologischen Umständen.
Um dieses Ziel zu erreichen, ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass: 1) Obwohl SUMO vier Isoformen (SUMO1-4, jeweils durch verschiedene Gene kodiert) im Vergleich zu Ubiquitination umfasst, alle SUMO-Arten sind viel weniger reichlich vorhanden; (2) für die meisten SUMO Zielproteine ist nur ein kleiner Teil eines gegebenen Proteins sumoyliert im Steady-State, das ist das Ergebnis der ständigen Wettbewerb zwischen den Enzymen beteiligt SUMO Konjugation und Dekonjugation14,21; und 3) SUMO Ziele können schnelle Zyklen von Sumoylierung und DeSUMOylation zu unterziehen. Beispielsweise zeigen aktuelle Daten von den Autoren dieser aktuellen Papier erhalten, dass Rb-SUMO1 nur für ein sehr kurzes Zeitfenster in der frühen G1-Phase, die im Einklang mit der Konzeption existiert, dass Sumoylierung eine reversible, hochdynamischen13 ist . Diese Tatsachen machen es schwierig, um die endogene Sumoylierung eines gegebenen Proteins direkt zu erkennen. Also, um erfolgreich zu erkennen, ist es wichtig, die genauen Bedingungen zu identifizieren, unter denen diese Änderung auftritt. Zum Beispiel ist das Timing der Zellzyklus-Synchronisation in diesem vorgeschlagenes Protokoll, entscheidend für die Erkennung von Rb Sumoylierung. Eine optimierte Versuchsdurchführung ist auch wichtig für die erfolgreiche Erkennung der Low-Level-SUMO-modifizierte Arten eines gegebenen Proteins. Zum Beispiel richtige Beschallung oder Weitergabe durch Nadeln könnte verhindern die Bildung von klebrig und zähflüssig Komponenten aufgrund genomischer DNA, so richtige Beschallung Gesamtprotein Extraktion erleichtern kann. Darüber hinaus könnte ein guter monoklonaler Antikörper mit hoher Affinität an das Zielprotein zur Verbesserung der Quantität und Spezifität der Immunopräzipitation hilfreich sein. Zusammenfassend lässt sich sagen ist die vorgeschlagene Methode wichtig für die weitere Erkundung der physiologischen Bedingungen, unter denen endogenen Rb sumoyliert, ist die Prämisse des folgenden Überexpression-basierte funktionale Tests.
Um das SUMO-Signal eines gegebenen Proteins zu verstärken, ist es üblich, co-Overexpress dieses Protein sowie andere SUMO-Proteine (in der Regel Ubc9 und SUMO Protein) in den Zellen. Obwohl eine einfache Western-Blot mit einem Antikörper gegen das Substrat der einfachste Weg zu finden, die höheren Molekulargewicht, sumoyliert Form dieses Proteins ist, konnten wir das SUMO-Rb-Signal mit dieser Methode erkennen. So konzentrierte sich dieses Papier nur auf eine Methode, die SUMO-Modifikation des ausgefällten exogene Rb-Proteins zu erkennen. Darüber hinaus beschrieben diese Methode, wie man künstlich zu verbessern oder zu beseitigen die SUMO-Konjugation von Rb. Als die alleinige E2-Ligase wurde Ubc9 festgestellt, um SUMO direkt auf konkrete Ziele22zu übertragen. So durch die Verschmelzung, die C-terminale der Rb, Ubc9 fördert deutlich die SUMO-Modifikation des Rb. mit dieser Methode, die Autoren dieses Papiers erfolgreich unter Beweis gestellt, dass Sumoylierung Rb ausreichend eigene Phosphorylierung gefördert durch die Erhöhung seiner Bindung CDK213. Darüber hinaus um die funktionellen Konsequenzen des Verlustes der Rb Sumoylierung zu studieren, die Autoren ein SUMO-defizienten Rb-Konstrukt, als bereits berichtet11generiert. Durch die Verwendung in diesem aktuellen Papier vorgeschlagenen Methode, zeigte sich, dass SUMO-Rb für normalen Zellzyklus Fortschreiten und Cell Proliferation13notwendig ist.
Neben SUMO1 SUMO2 und SUMO3 auch eine wichtige Rolle im Protein Sumoylierung14,17. SUMO2 und SUMO3 sind oft als SUMO2/3 bezeichnet, da sie eng verwandt sind und 97 % Identität teilen. SUMO1 teilt eine 50 % Ähnlichkeit mit SUMO2/3. Es ist allgemein anerkannt, dass SUMO1 für normalen physiologischen Zellfunktionen und Wartung verantwortlich ist, während SUMO-2/3 Zelle Stress Antworten15,17,23, überwiegend beteiligt ist 24. Angesichts der Tatsache, dass Rb sumoyliert SUMO2/3 mit unbekannter Funktion12könnte auch, in dieser Studie die vorgeschlagene Methode eignet sich noch für die Erkennung und Analyse dieser Modifikation der Rb. Neben der Rb können die hier beschriebenen Methoden für die Erkennung und funktionelle Analyse von Sumoylierung verschiedener Zielproteine weit angewendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Wissenschaft und Technologie Kommission von Shanghai (Grant Nr. 14411961800) und National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
