En Vivo Detección y análisis de la sumoilación de la proteína Rb en células humanas
Summary
Proteínas familiares pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO) se conjugan para los residuos de lisina de las proteínas diana para regular diversos procesos celulares. Este papel describe un protocolo para la detección de la proteína retinoblastoma (Rb) la sumoilación condiciones endógenas y exógenas en células humanas.
Abstract
Las modificaciones post-traduccionales de las proteínas son esenciales para la adecuada regulación de la transducción de señales intracelulares. Entre estas modificaciones, pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO) es una proteína ubiquitin-like que se une covalentemente a los residuos de lisina de una variedad de proteínas diana para regular procesos celulares, tales como la transcripción genética, la reparación del ADN, la proteína interacción y degradación, transporte subcelular y transducción de la señal. El enfoque más común para detectar la sumoilación de la proteína se basa en la expresión y purificación de proteínas recombinantes etiquetadas en bacterias, lo que permite una en vitro reacción bioquímica que es simple y conveniente para abordar los mecanismos preguntas. Sin embargo, debido a la complejidad del proceso de la sumoilación en vivo, es más difícil detectar y analizar proteína sumoilación en las células, especialmente bajo condiciones endógenas. Un estudio reciente realizado por los autores de este trabajo revelaron que la proteína endógena retinoblastoma (Rb), un supresor de tumor que es vital para la regulación negativa de la progresión del ciclo celular, es específicamente sumoiladas en la fase G1 temprana. Este papel describe un protocolo para la detección y análisis de la sumoilación Rb condiciones endógenas y exógenas en células humanas. Este protocolo es apropiado para la investigación fenotípica y funcional de la modificación SUMO de Rb, así como muchos otros dirigidos por el SUMO proteínas, las células humanas.
Introduction
El control preciso de la progresión del ciclo celular en células eucariotas se basa en una red reguladora apretada, que asegura que determinados eventos ocurren en una forma ordenada1,2. Uno de los principales protagonistas de esta red es la proteína del retinoblastoma (Rb), el primer clonado tumor supresor1,3. La proteína Rb se piensa para ser un regulador negativo de la progresión del ciclo celular, especialmente para el G0/G1 a la transición de la fase S y tumor crecimiento4,5. Falta de función de Rb o directamente conduce a la neoplasia intraocular más frecuente en niños, retinoblastoma, o contribuye al desarrollo de muchos otros tipos de cáncer5. Por otra parte, Rb participa en muchas vías celulares incluyendo la diferenciación celular, remodelación de la cromatina y apoptosis mediada por la mitocondria3,6,7.
Modificaciones post-traduccionales juegan un papel fundamental en la regulación de la función de RB8,9. La fosforilación es un tal modificación, y generalmente conduce a la inactivación de Rb. En células de reposo G0, Rb es activa con un nivel bajo de la fosforilación. Como células de progreso a través de la fase G0/G1, Rb es secuencialmente hyper-fosforilado por una serie de kinases de proteína cyclin-dependientes (CDKs) y ciclinas, como la ciclina E/CDK2 y ciclina D/CDK4/6, Rb de inactivar y eliminar su capacidad de reprimir el ciclo celular relacionados con la expresión de gene4,10. RB también podría ser modificado por pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO)11,12,13.
SUMO es una ubiquitina-como la proteína que se une covalentemente a una variedad de proteínas objetivo. Es fundamental para diversos procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, transcripción, localización celular de la proteína y la degradación, transporte y ADN reparación14,15,16, 17 , 18. vía de conjugación el SUMO consiste en la enzima activadora de SUMO E1 dimérica SAE1/UBA2, la única enzima de E2 Conjugación Ubc9, múltiples E3 ligasas y proteasas específicas de SUMO. En general, nacientes proteínas SUMO deben ser proteolytically procesadas para generar la forma madura. El SUMO maduro es activado por el heterodímero E1 y luego transferido a la enzima E2 Ubc9. Finalmente, la glicina c-terminal de SUMO se conjuga covalentemente a la lisina de destino de un substrato, y este proceso es facilitado generalmente por E3 ligasas. La proteína SUMO puede extraerse el sustrato modificado por proteasas específicas. Un estudio previo de los autores de este trabajo reveló que la sumoilación de Rb aumenta su unión a CDK2, lleva a hiper-fosforilación en la fase G1 temprana, un proceso que es necesario para el ciclo de la célula progresión13. También hemos demostrado que la pérdida de Rb sumoilación provoca una proliferación celular disminuida. Por otra parte, recientemente se demostró que la sumoilación de Rb protege la proteína Rb proteasomal facturación, aumentando así el nivel de proteína Rb en células19. Por lo tanto, la sumoilación desempeña un papel importante en la función de Rb en varios procesos celulares. Para estudio adicional la consecuencia funcional y relevancia fisiológica de la sumoilación de la Rb, es importante desarrollar un método efectivo para analizar el estado SUMO de Rb en células humanas o tejidos del paciente.
La sumoilación es un proceso reversible, altamente dinámico. Así, es generalmente difícil de detectar las proteínas SUMO modificado bajo condiciones completamente endógenas. Este artículo presenta un método para detectar endógeno la sumoilación de la Rb. Además, muestra cómo detectar exógeno sumoilación Rb Rb de tipo salvaje y su SUMO deficiente mutación11. En particular, Jacobs et al describieron un método para aumentar la modificación SUMO un sustrato determinado específicamente por Ubc9 dirigido por fusión sumoilación (UFDS)20. Basado en este método, este protocolo describe cómo analizar la sumoilación forzada de Rb y sus consecuencias funcionales. Dado que anteriormente se han descrito cientos de sustratos SUMO y más sustratos putativos de SUMO se han identificado de muchos ensayos de proteómica, este protocolo se puede aplicar para analizar la modificación SUMO de estas proteínas en las células humanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este papel describe un protocolo para detectar y analizar la sumoilación endógena de Rb en células humanas. Como este método se centra específicamente en la proteína endógena de la Rb sin cualquier alternancia de señal relacionadas con SUMO mundial, es una herramienta importante para la investigación de modificación de la Rb-SUMO bajo circunstancias fisiológicas totalmente naturales.
Para lograr este objetivo, es importante tener en cuenta que: 1) aunque SUMO comprende cuatro isofor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la ciencia y tecnología Comisión de Shangai (Grant no. 14411961800) y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant no. 81300805).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
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