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Biology

Vivo में मानव कोशिकाओं में आरबी प्रोटीन SUMOylation का पता लगाने और विश्लेषण

Published: November 2, 2017 doi: 10.3791/56096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1Department of Ophthalmology, Eye and ENT Hospital of Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Visual Impairment and Restoration, Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

छोटे ubiquitin-संबंधी संशोधक (सूमो) परिवार के प्रोटीन विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए लक्ष्य प्रोटीन के lysine अवशेषों को संयुग्मित हैं । यह कागज मानव कोशिकाओं में अंतर्जात और exogenous शर्तों के तहत retinoblastoma (आरबी) प्रोटीन SUMOylation का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है ।

Abstract

प्रोटीन के बाद के अनुवाद संशोधन intracellular संकेत transduction के उचित विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं । इन संशोधनों के अलावा, छोटे ubiquitin-संबंधित संशोधक (सूमो) एक ubiquitin प्रोटीन की तरह है कि covalently है लक्ष्य प्रोटीन की एक किस्म के lysine अवशेषों से जुड़ी सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए, जैसे जीन प्रतिलेखन, डीएनए मरंमत, प्रोटीन संपर्क और क्षरण, उपसेलुलर परिवहन, और संकेत transduction । सबसे आम दृष्टिकोण प्रोटीन SUMOylation का पता लगाने के लिए अभिव्यक्ति और संयोजक बैक्टीरिया में प्रोटीन टैग की शुद्धि पर आधारित है, के लिए अनुमति देता है एक में इन विट्रो जैव रासायनिक प्रतिक्रिया जो सरल और यंत्रवत को संबोधित करने के लिए उपयुक्त है प्रश्न. हालांकि, vivo मेंSUMOylation की प्रक्रिया की जटिलता के कारण, यह अधिक चुनौतीपूर्ण है कोशिकाओं में प्रोटीन SUMOylation का पता लगाने और विश्लेषण, विशेष रूप से जब अंतर्जात शर्तों के तहत. इस पत्र के लेखकों द्वारा हाल ही में एक अध्ययन से पता चला कि अंतर्जात retinoblastoma (आरबी) प्रोटीन, एक ट्यूमर शमन कि कोशिका चक्र प्रगति के नकारात्मक विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है, जल्दी G1 चरण में विशेष रूप से SUMOylated है । इस पेपर का पता लगाने और मानव कोशिकाओं में दोनों अंतर्जात और exogenous शर्तों के तहत आरबी SUMOylation के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है । इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त है सुमो के phenotypical और कार्यात्मक जांच-आरबी के संशोधन, साथ ही साथ कई अंय सूमो लक्षित प्रोटीन, मानव कोशिकाओं में ।

Introduction

युकेरियोटिक कोशिकाओं में कोशिका चक्र प्रगति का सही नियंत्रण एक तंग विनियामक नेटवर्क पर आधारित है, जो यह सुनिश्चित करता है कि विशेष घटनाओं को एक अर्दली तरीके से1,2में जगह ले । इस नेटवर्क में प्रमुख खिलाड़ियों में से एक retinoblastoma (आरबी) प्रोटीन, पहली क्लोन ट्यूमर शमन1,3है । आरबी प्रोटीन के लिए सेल चक्र प्रगति का एक नकारात्मक नियामक, विशेष रूप से G0/एस के लिए चरण संक्रमण है, और ट्यूमर विकास4,5माना जाता है । आरबी समारोह की विफलता या तो सीधे बच्चों, retinoblastoma, या कैंसर के कई अंय प्रकार के विकास के लिए योगदान में सबसे आम intraocular द्रोह की ओर जाता है5। इसके अलावा, आरबी सेल भेदभाव सहित कई सेलुलर रास्ते में शामिल है, क्रोमेटिन remodeling, और mitochondria-मध्यस्थता apoptosis3,6,7.

बाद के अनुवाद संशोधन आरबी समारोह8,9के विनियमन में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । फास्फारिलीकरण एक ऐसी संशोधन है, और यह आमतौर पर आरबी निष्क्रियता की ओर जाता है । quiescent G0 कोशिकाओं में, आरबी एक कम फास्फारिलीकरण स्तर के साथ सक्रिय है । G0/G1 चरण के माध्यम से सेल प्रगति के रूप में, आरबी क्रमिक रूप से हाइपर-phosphorylated cyclin-निर्भर प्रोटीन kinases (CDKs) और cyclins की एक श्रृंखला, जैसे cyclin ई/CDK2 और cyclin डी CDK4/6 के रूप में है, जो आरबी निष्क्रिय और अपनी क्षमता को समाप्त करने के लिए सेल-चक्र दमन संबंधित जीन अभिव्यक्ति4,10. आरबी भी छोटे ubiquitin से संबंधित संशोधक (सूमो)11,12,13द्वारा संशोधित किया जा सकता है ।

सूमो में प्रोटीन जैसी ubiquitin होती है जो कई तरह के लक्ष् य प्रोटीन से जुड़ी covalently है । यह सेल चक्र विनियमन, प्रतिलेखन, प्रोटीन सेलुलर स्थानीयकरण और क्षरण, परिवहन, और डीएनए की मरंमत14,15,16, सहित विविध सेलुलर प्रक्रियाओं, के लिए महत्वपूर्ण है 17 , 18. सूमो विकार मार्ग dimeric सूमो E1 सक्रिय एंजाइम SAE1/UBA2 के होते हैं, एकल E2 conjugating एंजाइम Ubc9, एकाधिक E3 ligases, और सूमो-विशिष्ट टीज़ । आम तौर पर नवजात सूमो प्रोटीन proteolytically परिपक्व रूप उत्पंन करने के लिए संसाधित किया जाना चाहिए । परिपक्व सूमो E1 heterodimer द्वारा सक्रिय है और फिर E2 एंजाइम Ubc9 को हस्तांतरित । अंत में, सूमो के सी टर्मिनल glycine एक सब्सट्रेट के लक्ष्य lysine करने के लिए संयुग्मित covalently है, और इस प्रक्रिया को आम तौर पर E3 ligases द्वारा सुविधा है. सूमो प्रोटीन विशिष्ट टीज़ द्वारा संशोधित सब्सट्रेट से हटाया जा सकता है । इस पत्र के लेखकों द्वारा पिछले एक अध्ययन से पता चला कि आरबी के SUMOylation CDK2 के लिए अपनी बाध्यकारी बढ़ जाती है, जल्दी G1 चरण में हाइपर-फास्फारिलीकरण के लिए अग्रणी, एक प्रक्रिया है जो सेल चक्र प्रगति13के लिए आवश्यक है । हमने यह भी दर्शाया कि आरबी SUMOylation के नुकसान में कमी सेल प्रसार का कारण बनता है । इसके अलावा, यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया कि आरबी के SUMOylation proteasomal कारोबार से आरबी प्रोटीन की रक्षा, इस प्रकार कोशिकाओं में आरबी प्रोटीन के स्तर में वृद्धि19। इसलिए, SUMOylation विभिंन सेलुलर प्रक्रियाओं में आरबी समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । आगे कार्यात्मक परिणाम और आरबी SUMOylation के शारीरिक प्रासंगिकता का अध्ययन करने के लिए, यह मानव कोशिकाओं या रोगी के ऊतकों में आरबी की सूमो स्थिति का विश्लेषण करने के लिए एक प्रभावी तरीका विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

SUMOylation एक प्रतिवर्ती, अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है । इस प्रकार, यह आमतौर पर पूरी तरह से अंतर्जात शर्तों के तहत सूमो संशोधित प्रोटीन का पता लगाने के लिए मुश्किल है । यह पेपर अंतर्जात आरबी SUMOylation का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, यह दिखाता है कि दोनों जंगली प्रकार आरबी और उसके सूमो की कमी उत्परिवर्तन11के exogenous आरबी SUMOylation का पता लगाने के लिए । विशेष रूप से, याकूब एट अल. Ubc9 फ्यूजन द्वारा विशेष रूप से दिए गए सब्सट्रेट के सूमो संशोधन को बढ़ाने के लिए एक विधि वर्णित SUMOylation (UFDS)20. इस विधि के आधार पर, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे आरबी की मजबूर SUMOylation और उसके कार्यात्मक परिणाम का विश्लेषण करने के लिए । यह देखते हुए कि सूमो सब्सट्रेट के सैकड़ों पहले से वर्णित किया गया है और अधिक ख्यात सूमो सब्सट्रेट कई proteomic से पहचान की गई है आधारित परख, इस प्रोटोकॉल को सूमो विश्लेषण मानव कोशिकाओं में इन प्रोटीन के संशोधन लागू किया जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. जल्दी G1 चरण में अंतर्जात आरबी SUMOylation की खोज

  1. सेल संस्कृति और सेल चक्र तुल्यकालन ।
    1. विकास मध्यम में HEK293 कोशिकाओं को बनाए रखने Dulbecco & #39; एस संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 1% पेन-Strep और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ ३७ & #176; सी और 5% सह 2 में एक मशीन के साथ पूरक ।
    2. G0 चरण पर HEK293 कक्षों को सिंक्रनाइज़ करें ।
      1. एक hemocytometer और बीज का उपयोग कर HEK293 कोशिकाओं की गणना ~ १.५ x & #160; उपचार से पहले 24 ज के लिए ग्रोथ मीडियम के साथ 15 सेमी डिश में 10 7 25ml सेल । ७०%-८०% के संगम तक पहुँचने के बाद, मध्यम महाप्राण और 5 मिलीलीटर गर्म फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ दो बार कोशिकाओं को धो.
      2. 25 मिलीलीटर DMEM शामिल 1% पेनिसिलिन-Streptomycin और मशीन पर कोशिकाओं ३७ & #176; C के लिए ७२ h. 3 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पंजाबियों का उपयोग कर प्लेटों से कोशिकाओं को धो लें । कोशिकाओं को एक नए 5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित.
      3. विषय कोशिकाओं के एक छोटे से हिस्से के प्रवाह cytometry द्वारा सेल चक्र विश्लेषण करने के लिए (चरण १.२); कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं के शेष बहुमत इकट्ठा, और फिर उंहें एक अल्ट्रा में स्टोर-कम तापमान फ्रीजर विश्लेषण तक च्या आरबी SUMOylation.
    3. G0 तुल्यकालन प्रक्रिया के अंत में G1 चरण कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, DMEM निकालें और वापस ताजा विकास के माध्यम जोड़ने के लिए, इस प्रकार HEK293 कोशिकाओं को फिर से सेल चक्र में प्रवेश करने की अनुमति । फिर, अलग g1 चरणों में कोशिकाओं को इकट्ठा (जल्दी g1:30 मिनट; G1: सेल चक्र विश्लेषण और आगे सूमो परख के लिए 2h) ।
    4. डबल-thymidine ब्लॉक पद्धति का उपयोग कर S चरण पर HEK293 कक्षों को सिंक्रनाइज़ करें ।
      1. ५०% के एक प्रवाह के लिए HEK293 कोशिकाओं को विकसित और गर्म पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । फिर वृद्धि मध्यम 18 घंटे के लिए २.५ mM thymidine के साथ पूरक जोड़ें (प्रथम खंड).
      2. thymidine-युक्त मध्यम निकालें, और फिर दो बार गर्म पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए 14 एच के लिए ताजा विकास माध्यम जोड़ें.
      3. एक पिपेट के साथ माध्यम त्यागने और वृद्धि मध्यम एक और 18 एच के लिए २.५ mM thymidine के साथ पूरक (द्वितीय खंड) सेल चक्र और आरबी SUMOylation के एक विश्लेषण के आयोजन से पहले ।
    5. के लिए G2/एम तुल्यकालन, प्लेट ~ १.५ & #215; 10 7 HEK293 कोशिकाओं को 24 ज के लिए 25 मिलीलीटर विकास माध्यम के साथ 15 सेमी डिश के लिए । तब nocodazole मध्यम करने के लिए जब तक एक अंतिम एकाग्रता में जोड़ें ४०० एनजी/ अंत में, सेल चक्र और आरबी SUMOylation के विश्लेषण के संचालन से पहले 16 ज के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
  2. कोशिका चक्र विश्लेषण द्वारा प्रवाह cytometry.
    1. ने पंजाबियों में सिंक्रनाइज़्ड HEK293 को फिर से सस्पेंड कर, और फिर सेल सस्पेंशन का उपयोग कर बर्फ ठंडा ७०% इथेनॉल के लिए 2 ज पर 4 & #176; C. ध्यान दें कि सेल clustering को कम करने के लिए, सेल निलंबन dropwise बर्फ ठंडा १००% इथेनॉल के लिए एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ें ७०% इथेनॉल जबकि धीरे भंवर.
    2. ५०० x जी में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को केंद्रापसारक, तो ध्यान से supernatant त्यागें और पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें । दोहराने के केंद्रापसारक कदम.
    3. Add ५०० & #181; L पंजाबस युक्ता ५० & #181; g/मब न्यूक्लिक अम्ल सना propidium आयोडाइड, ०.१% ट्राइटन X-१०० और 1 & #181; जी/एमएल RNase ए कोशिकाओं को अच्छी तरह मिक्स कर लें । ३७ पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को मशीन & #176; C.
    4. 4 & #176 पर नमूनों का संग्रह; C तक विश्लेषण तक प्रवाह cytometry.
  3. Immunoprecipitation की अंतर्जात आरबी प्रोटीन.
    1. तैयार HEK293 सेल lysates ।
      1. लाइसे सिंक्रनाइज़ HEK293 कोशिकाओं को धीरे से फिर से उंहें बर्फ के 1 मिलीलीटर में सस्पैंड-ठंडा रेडियो immunoprecipitation परख (RIPA) lysis बफर ( तालिका 1 ) हौसले से जोड़ा 20 मिमी N-Ethylmaleimide, एक isopeptidase अवरोध करनेवाला है कि सकता है युक्त ब्लॉक सूमो teases और स्थिर सूमो conjugates.
      2. आगे Dounce homogenization द्वारा बर्फ पर कोशिकाओं homogenize, sonication या बस के माध्यम से गुजर 10 बार एक 21 जी सुई के माध्यम से एक 2 मिलीलीटर सिरिंज पर संलग्न. फिर, 5 min.
        के लिए बर्फ पर कोशिकाओं की मशीन नोट: anionic डिटर्जेंट सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) RIPA बफर में आरबी-सुमो के बाद निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में यह विशिष्ट सूमो संकेत है कि गैर से ली गई है को समाप्त कर सकता है आरबी प्रोटीन और अंय के बीच बातचीत आबंध गैर आरबी सूमो प्रजातियों.
    2. केंद्रापसारक सेल lysates पर 30 मिनट के लिए १८,००० x g पर 4 & #176; C. supernatants को नए १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों स्थानांतरण ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । प्रोटीन-८० & #176 पर संग्रहित किया जा सकता है; C कम 6 महीने के लिए ।
    3. बाद पश्चिमी ब्लाटर के लिए प्रत्येक नमूने के इनपुट नियंत्रण तैयार करने के लिए, ऊपर के एक छोटे से हिस्से को बचाने के लिए-वर्णित supernatant एक नई ट्यूब और स्टोर पर-८० & #176; C.
      4. उपरोक्त supernatants को
    4. , 1 & #181; g को एक ही प्रजाति के गैर विशिष्ट माउस immunoglobulin g (आईजीजी) के isotype आरबी मोनोक्लोनल के रूप में और 20 & #181; L का ५०% प्रोटीन A/जी-एंटीबॉडी घोल के. फिर, 1 ज के लिए मशीन 4 & #176; सी कोमल रोटेशन के साथ ।
    5. पर नमूने 3 मिनट के लिए ३,००० x g पर 4 & #176; C. ध्यान से मोती परेशान बिना supernatants इकट्ठा, और उंहें नए १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए स्थानांतरण । प्रत्येक नमूने के लिए, जोड़ें 5 & #181; l Rb primary एंटीबॉडी and ४० & #181; l के ५०% प्रोटीन A/जी-sepharose घोल. फिर, रात भर में 4 & #176, कोमल रोटेशन के साथ सी मशीन ।
    6. 4 & #176; C पर 3 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा मोतियों को इकट्ठा, और ध्यान से pipetting द्वारा supernatant हटा दें । ध्यान दें कि आदेश में मनका हानि से बचने के लिए, मोती सूखी महाप्राण नहीं है ।
    7. RIPA बफर के 1 मिलीलीटर के साथ चार बार मोतियों को धो लें । हर बार, नलियों को अच्छी तरह से मिलाकर उन्हें 4 & #176 पर घुमाएं; c 15 min. के लिए ३,००० x g पर 3 मिनट के लिए कम गति केंद्रापसारक द्वारा मोती लीजिए 4 & #176; c और फिर supernatants को त्यागें.
    8. को अंतिम वाश से supernatants निकालने के बाद, 30 & #181 में मोतियों को दुबारा सस्पेंड करना; L 1x सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) लोड हो रहा है बफर ( Table 1 ) और अच्छी तरह मिलाएं ।
      1. में ट्यूबों १०० & #176; सी के लिए एक गर्मी ब्लॉक में 10 min. 1 मिनट के लिए १२,००० x g पर नमूने के लिए मोती गोली । ध्यान से मोती परेशान बिना supernatants इकट्ठा, और उंहें १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए स्थानांतरण ।
    9. 4% द्वारा नमूनों का विश्लेषण-20% ढाल एसडीएस-पृष्ठ जेल और पश्चिमी दाग या उन पर स्टोर-20 & #176; C बाद में उपयोग के लिए.
< p class = "jove_title" > 2. 6XHis का विश्लेषण-टैग Exogenous आरबी SUMOylation मानव कोशिकाओं में

  1. सेल कल्चर और अभिकर्मक.
    1. बीज ~ 6 & #215; 10 6 एक 10 सेमी डिश में HEK293 कोशिकाओं और सामांय कोशिका संस्कृति की स्थिति के तहत विकास मध्यम में 24 घंटे के लिए मशीन 75%-८५% धाराप्रवाह कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए । अभिकर्मक से पहले, विकास मध्यम निकालें और गरम कम सीरम मध्यम के 6 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और फिर व्यंजन को वापस मशीन में रखें ।
      2. आरबी गठित SUMOylation परख के लिए
    2. , add 15 & #181; g प्रत्येक 6XHis-tagged rb-Ubc9-WT, rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT and Ubc9-C93S plasmids in ५०० & #181; L कम १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों में सीरम मध्यम, क्रमशः ।
      1. जंगली प्रकार आरबी और उसके SUMOylation-दोषपूर्ण उत्परिवर्ती के सूमो-विकार का विश्लेषण करने के लिए, mix 10 & #181; जी या तो 6XHis-tagged आरबी-WT या आरबी-K720R प्लाज्मिड के साथ मिलकर GFP-SUMO1 (10 & #181; g) in ५०० & #181; L कम सीरम मध्यम में १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों < सुप वर्ग = "xref" > १३ .
    3. इस बीच, एक अलग ट्यूब में, मिश्रण ५० & #181; l अभिकर्मक रिएजेंट (देखें Table of सामग्री ) in ५०० & #181; l कम सीरम मध्यम, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन.
    4. पूरी तरह से ऊपर वर्णित दो अलग ट्यूबों गठबंधन, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । कोशिकाओं के लिए अभिकर्मक एजेंट/प्लाज्मिड परिसरों जोड़ें और संस्कृति के लिए जारी रखने के लिए 8 ज पर 5% कं 2 र ३७ & #176; ग.
    5. वृद्धि मध्यम के साथ कम सीरम माध्यम की जगह है, और अभिकर्मक के बाद ४८ ज के लिए सामांय संस्कृति शर्तों के तहत कोशिकाओं गर्मी ।
  2. निकल संबध 6XHis के नीचे खींचो-आरबी प्रोटीन टैग की गईं ।
    1. लाइसे transfected HEK293 कोशिकाओं और कुल प्रोटीन को निकालने के रूप में वर्णित अनुभाग 1.3.1.
    2. केंद्रापसारक सेल lysates पर 30 मिनट के लिए १८,००० x g पर 4 & #176; C. ध्यान से supernatants इकट्ठा और उंहें साफ ट्यूबों के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: प्रोटीन से अधिक 6 महीने के लिए इस बिंदु पर जम सकता है-८० & #176; C.
    3. बाद में पश्चिमी दाग के लिए प्रत्येक नमूने के इनपुट नियंत्रण तैयार करने के लिए, ऊपर वर्णित supernatants के एक छोटे से हिस्से को बचाने के लिए एक नई ट्यूब और स्टोर पर-८० & #176; C.
    4. धो 25 & #181; L के ५०% निकेल nitrilotriacetic एसिड (Ni-NTA) agarose मोती RIPA बफर के साथ एक १.५ मिलीलीटर में दो बार एक नमूना के लिए माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब । 4 & #176 पर 3 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा मोती ले लीजिए; C.
    5. 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए 1 मीटर imidazole जोड़ें । फिर, तैयार नी-NTA agarose मोतियों से युक्त ट्यूब के लिए प्रत्येक नमूने जोड़ें.
    6. के लिए मोती और lysates 2 ज पर 4 & #176; सी कोमल घुमाव के साथ । 3 मिनट के लिए ३,००० x g पर मोती स्पिन 4 & #176; सी, और ध्यान से pipetting द्वारा supernatants को दूर । मनका हानि से बचने के लिए मोतियों को सुखाकर न महाप्राण.
    7. 20 मिमी imidazole ( टेबल 1 ) युक्त धोने बफर के 1 मिलीलीटर के साथ मोती धोने । हर बार, 4 & #176 पर रोटेशन द्वारा अच्छी तरह से ट्यूबों मिश्रण 15 मिनट के लिए सी. 4 & #176 पर 3 मिनट के लिए ३,००० x g पर कताई द्वारा मोतियों को इकट्ठा करें, और supernatants को त्यागें ।
      8. फाइनल वॉश करने के बाद
    8. 30 & #181; एल ऑफ रेफरेंस बफर युक्त २५० एमएम imidazole ( टेबल 1 ) को मिलाकर प्रत्येक नमूने को और फ्लिक करें । फिर, 20 मिनट के लिए मशीन 4 & #176; C को प्रोटीन elute.
    9. मिश्रण के साथ प्रत्येक नमूना 6 & #215; एसडीएस-पृष्ठ लोडिंग बफ़र ( तालिका 1 ) । फिर, १०० & #176 पर ट्यूबों मशीन, 10 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक में सी
    10. 1 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक को मोतियों की गोली । ध्यान से मोती परेशान बिना supernatants इकट्ठा, और १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए नमूने हस्तांतरण । नमूनों को पश्चिमी दाग से विश्लेषण किया जा सकता है या संग्रहित-20 & #176; C बाद में उपयोग के लिए.
< p class = "jove_title" > 3. पश्चिमी दाग

  1. लोड immunoprecipitation या पिछले कदम से प्राप्त नमूनों नीचे खींच 4-20% ढाल एसडीएस-पृष्ठ जैल पर । १२० वी पर ट्रो आचरण ९० मिनट के लिए प्रोटीन अलग ।
  2. जेल से प्रोटीन एक polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली में electroblotting द्वारा ३०० mA पर ९० मिनट के लिए 4 & #176; C पर टैंक स्थानांतरण विधि का उपयोग कर स्थानांतरण । ब्लॉक बफर में PVDF झिल्ली ब्लॉक 5% नोनफेट दूध ( टेबल 1 ) के लिए 1 ज कमरे के तापमान पर ।
  3. में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की मशीन एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर युक्त 3% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) ( Table 1 ) पर रातोंरात 4 & #176; C. प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए, ०.५ & #181; g/एमएल (anti-SUMO1 एंटीबॉडी), या 1:2000 (एंटी-आरबी और एंटी-Tubulin एंटीबॉडी), या 1:5000 (एंटी-GFP और एंटी-एंटीबॉडी) के एक कमजोर पड़ने का काम एकाग्रता का उपयोग करें ।
  4. 10 मिनट के लिए हर बार 1x tris-के बीच (TBST) बफर ( टेबल 1 ) के साथ खारा बफर का उपयोग कर समय झिल्ली धो लो । प्रजातियों के साथ झिल्ली की मशीन विशिष्ट सहिजन Peroxidase (एचआरपी)-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1: ब्लॉक बफर में 5000 5% नोनफेट दूध ( तालिका 1 ) युक्त । 10 मिनट 1x TBST बफर का उपयोग कर हर बार के लिए झिल्ली 3x धो लो ।
  5. बढ़ाया chemiluminescence (ECL) काम समाधान के साथ झिल्ली की मशीन । प्लास्टिक लपेटो के साथ झिल्ली को कवर और यह एक्स-रे संकेत की ताकत के आधार पर फिल्म के लिए बेनकाब ।

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Representative Results

सेल चक्र की प्रगति के दौरान अंतर्जात आरबी SUMOylation का पता लगाने के लिए, इस अध्ययन के पहले सेल चक्र के पांच विभिंन चरणों में HEK293 कोशिकाओं सिंक्रनाइज़ (G0, जल्दी g1, g1, एस, और G2/ तुल्यकालन की गुणवत्ता propidium आयोडाइड के साथ न्यूक्लिक एसिड दाग का उपयोग करके पुष्टि की थी प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा पीछा किया (चित्रा 1) । अगले, कोशिकाओं को एकत्र किया गया और denaturing RIPA बफर द्वारा लीजड । सूमो को रोकता है, एन Ethylmaleimide, 20 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया था प्रयोगों के दौरान देशी सूमो संकेत बनाए रखने के लिए । denaturing शर्तों के तहत अंतर्जात आरबी प्रजातियों के immunoprecipitation के बाद गैर आबंध विशिष्ट बातचीत ब्लॉक, और निंनलिखित पश्चिमी दाग एक विरोधी SUMO1 एंटीबॉडी का उपयोग कर, सूमो संकेत की उपस्थिति में विशेष रूप से पता चला था जल्दी G1 चरण (चित्रा 2) । हालांकि वैश्विक SUMOylation को S/G2/M चरण में बढ़ाया गया था, आरबी SUMOylation के समय बिंदु पर, यह नहीं बदला था (चित्रा 2, इनपुट पैनल) । यह खोज पता चलता है कि आरबी के SUMOylation नहीं बस बदल ग्लोबल सूमो विकार गतिविधि का परिणाम है । इस प्रकार, इन परिणामों से पता चलता है कि प्रोटीन immunoprecipitation और पश्चिमी दाग इस पत्र में वर्णित विश्लेषण अंतर्जात आरबी प्रोटीन के SUMOylation का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं ।

को आरबी प्रोटीन के मजबूर SUMOylation का पता लगाने के लिए, इस अध्ययन के एक गठन SUMOylated आरबी Ubc9, एकमात्र सूमो E2 ligase, अपनी सी के लिए अनुमति टर्मिनल आरबी के कुशल और चयनात्मक SUMOylation (चित्रा 3) से इनकार करके निर्माण उत्पंन । की हानि-समारोह Ubc9 के उत्परिवर्तन, C93S, भी आरबी के सी टर्मिनल से जुड़े हुए है एक नियंत्रण (चित्रा 3) के रूप में सेवा करते हैं । आगे सुमो की विशिष्टता को मजबूत करने के लिए आरबी संकेत, गैर जुड़े Ubc9 अकेले के रूप में अच्छी तरह से निर्माण किया गया था । अपने-टैग plasmids के सभी चार ४८ ज के लिए HEK293 कोशिकाओं में transfected थे इससे पहले कि वे RIPA 20 मिमी N-Ethylmaleimide के साथ पूरक बफर में लीजड थे । सभी प्रोटीन तो एक नीचे खींच परख के अधीन थे, के रूप में इस पत्र के प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है । पश्चिमी ब्लाटर द्वारा eluted आरबी प्रोटीन्स का विश्लेषण किया गया । Ubc9 फ्यूजन-आरबी के निर्देश SUMOylation एक विरोधी SUMO1 एंटीबॉडी (चित्रा 3बी, SUMO1 पैनल) का उपयोग कर पाया गया था, जबकि Ubc9 दोषपूर्ण उत्परिवर्तन, C93S, इस संकेत का उत्पादन करने में विफल । ध्यान दें कि अत्यधिक कुशल सूमो-Ubc9 की वजह से संशोधन-संलयन एक उच्च आणविक भार बैंड है कि सीधे आरबी एंटीबॉडी का उपयोग करके पाया जा सकता है की ओर जाता है, और यह सूमो संकेत (चित्रा 3बी, आरबी पैनल) से मेल खाती है । इसके अलावा, Ubc9 अकेले किसी भी सूमो विकार कारण नहीं था, और आरबी विशिष्ट SUMOylation (चित्रा 3बी) की पुष्टि ।

क्योंकि SUMO1 आरबी प्रोटीन11के ७२० lysine को संयुग्मित है, आगे आरबी SUMOylation का विश्लेषण, इस अध्ययन के एक lysine (arginine) के साथ इस K720R अवशेषों की जगह से एक सूमो की कमी उत्परिवर्तन उत्पंन । दो क्षणिक आरबी प्रोटीन के सूमो-विकार का पता लगाने की सुविधा के लिए, एक GFP-SUMO1 निर्माण intracellular सूमो संकेत को बढ़ाने के लिए जोड़ा गया था । अपने जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती आरबी टैग HEK293 कोशिकाओं में सह transfected GFP-SUMO1 के साथ था, नीचे खींच परख और आरबी SUMO1 विकार क्षमता का विश्लेषण के बाद । के रूप में मनाया, K720R उत्परिवर्ती पूरी तरह से सुमो-आरबी के संशोधन को समाप्त कर दिया, और प्रस्तावित विधि को आरबी SUMOylation (चित्रा 4) का पता लगाने की क्षमता को मजबूत बनाने ।

Figure 1
चित्र 1 : प्रवाह cytometry द्वारा सेल साइकिल तुल्यकालन परख के सत्यापन । इस प्रोटोकॉल में बताए गए अनुसार सेल चक्र के G0, अर्ली g1, g1, S, और G2/एम चरणों में HEK293 कक्षों को कल्चरित और सिंक्रनाइज़ किया गया । कक्ष सायकल वितरण प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) द्वारा निर्धारित किए गए थे । प्रतिनिधित्व डेटा FACS परख के मात्रात्मक विश्लेषण का एक उदाहरण से पता चलता है (n = 1) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : आरबी जल्दी G1 चरण में SUMOylated है । इस प्रोटोकॉल में बताए अनुसार कक्ष चक्र के विभिंन चरणों में HEK293 कक्ष सिंक्रनाइज़ किए गए थे । कोशिकाओं को एकत्र किया गया और RIPA बफर में लीजड 20 मिमी N-Ethylmaleimide के साथ पूरक । इनपुट नियंत्रण 4%-20% एसडीएस-पृष्ठ ग्रैडिएंट जेल, स्थानांतरित, और एंटी-SUMO1 और एंटी-Tubulin के साथ blotted, संकेत के रूप में लोड किए गए थे । शेष सेल lysates तो 1:200 के कमजोर पड़ने पर विरोधी आरबी एंटीबॉडी का उपयोग कर immunoprecipitation के अधीन थे । परिणामस्वरूप eluents 4%-20% एसडीएस-पृष्ठ ढाल जेल और immunoblotted विरोधी SUMO1 एंटीबॉडी और विरोधी आरबी एंटीबॉडी का उपयोग करके अलग किया गया । इस प्रयोग को दो बार इसी परिणाम के साथ दोहराया गया. यह आंकड़ा13अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . सुमो का पता लगाने-आरबी Ubc9 फ्यूजन प्रोटीन का संशोधन । (क) Ubc9 फ्यूजन का आरेख-निर्देशित SUMOylation (UFDS) आरबी का construction. (B) UFDS की वजह से आरबी का गठन SUMOylation. HEK293 कोशिकाओं क्षणिक transfected के साथ अपने-टैग UFDS constructs 20 mM N-RIPA के साथ Ethylmaleimide बफर में लीजड थे । प्रत्येक नमूने के कुल lysate नी-NTA agarose मोतियों के साथ मशीन के लिए नीचे अपने टैग आरबी Ubc9 संलयन प्रोटीन या Ubc9 (नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया), क्रमशः खींच रहा था । शुद्ध प्रोटीन 4%-20% एसडीएस-पृष्ठ ढाल जेल और विरोधी SUMO1 और विरोधी अपने एंटीबॉडी के साथ immunoblotted द्वारा अलग किया गया । उनके आरबी: 6XHis आरबी Ubc9 फ्यूजन प्रोटीन टैग; झी-Ubc9:6XHis tagged Ubc9. rb-Ubc9: unभएकै rb-Ubc9; आरबी-Ubc9-एस: SUMOylated आरबी-Ubc9; हाइपर-pRb-Ubc9: हाइपर-phosphorylated आरबी-Ubc9. चित्रा में दर्शाए गए परिणामों में तीन स्वतंत्र परीक्षणों के प्रतिनिधि हैं. यह आंकड़ा13अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . सुमो की कमी K720R उत्परिवर्तन आरबी के SUMOylation को कम कर देता है । HEK293 कोशिकाओं क्षणिक जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती आरबी के साथ सह transfected थे-अपने GFP-SUMO1 के साथ मिलकर constructs । कोशिकाओं को एकत्र किया गया और RIPA बफर में लीजड 20 मिमी N-Ethylmaleimide के साथ पूरक । lysates का एक छोटा सा हिस्सा सीधे इनपुट नियंत्रण के रूप में पश्चिमी दाग से विश्लेषण किया गया था । lysates के बाकी नी-NTA agarose मोतियों के साथ मशीन को नीचे खींचने के लिए अपनी-टैग आरबी प्रोटीन के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित थे, और वे विरोधी के साथ immunoblotted थे SUMO1 और विरोधी अपने एंटीबॉडी । ध्यान दें कि lysine-को आरबी मुन्ना के ७२० में उत्परिवर्तन arginineसहयोगी इस प्रोटीन के सुमो संशोधन समाप्त । प्रयोग एक बार एक समान परिणाम के साथ कि पहले सूचना दी11का आयोजन किया गया था । यह आंकड़ा13अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समाधान घटक टिप्पणियां
RIPA Lysis बफर ५० मिमी Tris, पीएच = ८.०; १५० मिमी NaCl; 1% NP-४०; 1% सोडियम deoxycholate; ०.१% एसडीएस उपयोग करने से पहले तुरंत ethylmaleimide को छेड़ो अवरोधक कॉकटेल और N जोड़ें ।
बफर धो ५० mM णः2PO4 पीएच = ८.०; ३०० मिमी NaCl; 20 एमएम imidazole नीचे खींच परख केवल के लिए प्रयुक्त
रेफरेंस बफर ५० mM णः2PO4 पीएच = ८.०; ३०० मिमी NaCl; २५० मिमी imidazole नीचे खींच परख केवल के लिए प्रयुक्त
6x लोड हो रहा है बफ़र ०.५ M Tris, pH = ६.८; 30% ग्लिसरॉल; 10% एसडीएस; 5% β-mercaptoethanol; ०.१% bromphenol नीला पर स्टोर-20 ° c
10x चल रहे बफर 0.25 मीटर Tris, पीएच ८.६; 1.9 m Glycine; 1% एसडीएस 1x चल बफर बनाने के लिए: मिश्रण १०० एमएल 10x चल बफर के साथ ९०० मिलीलीटर ddH2O
10x स्थानांतरण बफर ०.२५ मीटर Tris, पीएच ८.३, १.९ मीटर Glycine 1x स्थानांतरण बफर बनाने के लिए: २०० मिलीलीटर मेथनॉल और ७०० मिलीलीटर ddH के साथ १०० मिलीलीटर 10x स्थानांतरण बफर मिश्रण2O
10x टीबीएस बफर ddH के 1 एल में2O: २४.०८ g Tris pH ७.४; ८० g NaCl 1x TBST बफर बनाने के लिए: ९०० मिलीलीटर ddH2O और बीच के 1 मिलीलीटर के साथ १०० मिलीलीटर 10x टीबीएस बफर मिश्रण-20
बफ़र ब्लॉक कर रहा है 1x 5% नोनफेट ड्राई मिल्क के साथ TBST उपयोग करने से पहले बफ़र तुरंत तैयार करें
एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर 1x 3% BSA और ०.०२% सोडियम azide के साथ TBST इस बफर 4 डिग्री सेल्सियस से कम 6 महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है

तालिका 1: समाधान और बफ़र्स ।

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Discussion

इस पत्र का वर्णन एक प्रोटोकॉल का पता लगाने और मानव कोशिकाओं में आरबी के अंतर्जात SUMOylation विश्लेषण । इस विधि के रूप में विशेष रूप से वैश्विक सूमो के किसी भी बारी के बिना अंतर्जात आरबी प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित है संबंधित संकेत है, यह पूरी तरह से प्राकृतिक शारीरिक परिस्थितियों में आरबी सूमो संशोधन की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है ।

इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि: 1) हालांकि सूमो में चार isoforms शामिल है (SUMO1-4, एक अलग जीन द्वारा इनकोडिंग) ubiquitination की तुलना में, सभी सूमो प्रजातियों बहुत कम प्रचुर मात्रा में हैं; 2) सबसे सूमो लक्ष्य प्रोटीन के लिए, केवल एक दिया प्रोटीन का एक छोटा सा हिस्सा स्थिर राज्य में SUMOylated है, जो सूमो विकार और deconjugation में शामिल एंजाइमों के बीच लगातार प्रतिस्पर्धा का परिणाम है14,21; और 3) सूमो लक्ष्य SUMOylation और deSUMOylation के तेजी से चक्र से गुजरना कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, हाल ही में इस वर्तमान पत्र के लेखकों द्वारा प्राप्त डेटा प्रदर्शित करता है कि आरबी SUMO1 केवल समय की जल्दी G1 चरण में एक बहुत ही छोटी खिड़की के लिए मौजूद है, जो गर्भाधान कि SUMOylation एक प्रतिवर्ती है, अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया के साथ संगत है13 . इन सभी तथ्यों को सीधे एक दिए गए प्रोटीन के अंतर्जात SUMOylation का पता लगाने के लिए यह चुनौतीपूर्ण बनाते हैं । इस प्रकार, सफलतापूर्वक इस का पता लगाने के लिए, यह महत्वपूर्ण है जिसके तहत इस संशोधन होता है सटीक परिस्थितियों की पहचान । उदाहरण के लिए, इस प्रस्तावित प्रोटोकॉल में, सेल साइकिल तुल्यकालन के समय आरबी SUMOylation का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है । एक अनुकूलित प्रयोगात्मक प्रक्रिया भी एक दिया प्रोटीन की कम स्तर सूमो संशोधित प्रजातियों के सफल पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, उचित sonication या पासिंग के माध्यम से सुई जीनोमिक डीएनए के कारण चिपचिपा और चिपचिपा घटकों के गठन को रोकने सकता है, इस प्रकार उचित sonication कुल प्रोटीन निष्कर्षण की सुविधा कर सकते हैं । इसके अलावा, लक्ष्य प्रोटीन के लिए उच्च संबंध के साथ एक अच्छा मोनोक्लोनल एंटीबॉडी मात्रा और immunoprecipitation की विशिष्टता में सुधार के लिए सहायक हो सकता है । संक्षेप में, प्रस्तावित विधि आगे की खोज के लिए महत्वपूर्ण है जो के तहत शारीरिक स्थितियों अंतर्जात आरबी SUMOylated है, जो निंनलिखित के आधार पर विचार-कार्यात्मक परख है ।

एक दिया प्रोटीन के सूमो संकेत बढ़ाना, यह आम है इस प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से अंय सूमो-संबंधित प्रोटीन (आमतौर पर Ubc9 और सूमो प्रोटीन) कोशिकाओं में व्यक्त । हालांकि एक साधारण पश्चिमी एंटीबॉडी सब्सट्रेट के खिलाफ एक का उपयोग कर सबसे आसान तरीका है उच्च आणविक भार, इस प्रोटीन का SUMOylated रूप मिल रहा है, हम इस विधि के साथ सूमो आरबी संकेत का पता लगाने में विफल रहा है । इस प्रकार, इस पत्र केवल एक विधि पर ध्यान केंद्रित सूमो का पता लगाने के लिए, उपजी exogenous आरबी प्रोटीन का संशोधन । इसके अलावा, इस विधि को कैसे कृत्रिम रूप से बढ़ाने के लिए या विकार आरबी के सुमो को खत्म करने का वर्णन किया । एकमात्र E2 ligase के रूप में, Ubc9 विशेष लक्ष्य22को सीधे सुमो हस्तांतरण पाया गया है । इस प्रकार, आरबी के सी टर्मिनल से इनकार करने से, Ubc9 काफी सुमो-आरबी के संशोधन को बढ़ावा देता है । इस विधि का उपयोग कर, इस पत्र के लेखकों को सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है कि आरबी के SUMOylation पर्याप्त अपनी बाध्यकारी वृद्धि से अपनी फास्फारिलीकरण पदोंनत करने के लिए13CDK2 । इसके अलावा, आरबी SUMOylation के नुकसान के कार्यात्मक परिणामों का अध्ययन करने के लिए, लेखक एक सूमो की कमी आरबी निर्माण उत्पंन, के रूप में पहले11की सूचना दी । इस वर्तमान पत्र में प्रस्तावित विधि का उपयोग करते हुए, यह दिखाया गया है कि सूमो-आरबी सामांय कोशिका चक्र प्रगति और सेल प्रसार13के लिए आवश्यक है ।

SUMO1 के अलावा, SUMO2 और SUMO3 भी प्रोटीन SUMOylation14,17में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । SUMO2 और SUMO3 अक्सर SUMO2/3 के रूप में संदर्भित कर रहे है क्योंकि वे बारीकी से संबंधित है और शेयर ९७% पहचान । SUMO1 शेयर SUMO2/3 के साथ एक ५०% समानता । यह व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है कि SUMO1 सामांय कोशिका शारीरिक कार्यों और रखरखाव के लिए जिंमेदार है, जबकि सुमो-2/मुख्य रूप से सेल तनाव प्रतिक्रियाओं में शामिल है15,17,23, 24. यह देखते हुए कि आरबी भी अज्ञात समारोह12के साथ SUMO2/3 द्वारा SUMOylated जा सकता है, इस अध्ययन में प्रस्तावित विधि का पता लगाने और आरबी के इस संशोधन के विश्लेषण के लिए अभी भी उपयुक्त है । आरबी के अलावा, यहां वर्णित तरीकों व्यापक रूप से पता लगाने और लक्ष्य प्रोटीन की एक किस्म के SUMOylation के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को शंघाई के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (ग्रांट no. १४४११९६१८००) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान सं. ८१३००८०५) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM  Thermo Fisher Scientific 31985070
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 26140079
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
Thymidine Sigma T9250
Nocodazole Sigma M1404
propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566
Triton X-100  AMRESCO 694
RNase A  Thermo Fisher Scientific EN0531
N-Ethylmaleimide Sigma E3876 
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) AMRESCO M107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40) AMRESCO M158
protease inhibitor Roche 5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-2025
Rb antibody Cell Signaling Technology #9309
Protein A/G-Sepharose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003
Lipofectamine-2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads Qiagen 30230
Imidazole Sigma I0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel BIO-RAD 4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane Millipore IPVH00010
Tween-20 AMRESCO M147
Tubulin antibody Abmart M30109
SUMO1 antibody Thermo Fisher Scientific 33-2044
GFP antibody Abmart M20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories 715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) Kit Thermo Fisher Scientific 32106

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References

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आणविक जीवविज्ञान अंक १२९ Retinoblastoma प्रोटीन (आरबी) पद-अनुवाद संशोधन (PTM) लघु ubiquitin-संबंधित संशोधक (सुमो) कोशिका चक्र HKE293 कोशिकाओं
<em>Vivo में</em> मानव कोशिकाओं में आरबी प्रोटीन SUMOylation का पता लगाने और विश्लेषण
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Meng, F., Li, X., Ren, H., Qian, J.… More

Meng, F., Li, X., Ren, H., Qian, J. In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells. J. Vis. Exp. (129), e56096, doi:10.3791/56096 (2017).

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