Summary
Protéines de la famille petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO) sont conjugués aux résidus lysine de protéines cibles pour réglementer divers processus cellulaires. Cet article décrit un protocole pour la détection de la protéine du rétinoblastome (Rb) SUMOylation conditions endogènes et exogènes dans les cellules humaines.
Abstract
Les modifications post-traductionnelles des protéines sont cruciales pour la règlementation propre de transduction de signaux intracellulaires. Parmi ces modifications, petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO) est une protéine d’ubiquitin-comme qui est de façon covalente aux résidus lysine d’une variété de protéines cibles pour réguler les processus cellulaires, tels que la transcription des gènes, la réparation de l’ADN, protéine interaction et la dégradation, transport intracellulaire et transduction du signal. L’approche la plus courante à la détection des protéines SUMOylation est basé sur l’expression et purification de protéines recombinantes marqués chez les bactéries, ce qui permet une réaction in vitro biochimique qui est simple et adapté pour l’adressage mécaniste questions. Toutefois, en raison de la complexité du processus de SUMOylation in vivo, il est plus difficile à détecter et analyser les protéines SUMOylation dans les cellules, surtout lorsque des conditions endogènes. Une étude récente menée par les auteurs de cette étude a révélé que la protéine du rétinoblastome endogène (Rb), un suppresseur de tumeur qui est essentiel à la régulation négative de la progression du cycle cellulaire, est spécifiquement SUMOylated au début de la phase G1. Cet article décrit un protocole pour la détection et l’analyse de SUMOylation Rb conditions endogènes et exogènes dans les cellules humaines. Ce protocole est approprié pour l’étude phénotypique et fonctionnelle du SUMO-modification du Rb, ainsi que plusieurs autres protéines SUMO ciblées, dans les cellules humaines.
Introduction
Le contrôle précis de la progression du cycle cellulaire dans les cellules eucaryotes repose sur un réseau serré de réglementation, qui s’assure que des événements particuliers se déroulent dans une manière ordonnée1,2. Un des principaux acteurs de ce réseau est la protéine du rétinoblastome (Rb), la première tumeur clonés suppresseur1,3. La protéine Rb est considérée comme un régulateur négatif de la progression du cycle cellulaire, en particulier pour le G0/G1 à transition de phase S et la croissance de tumeur4,5. Défaillance de la fonction de Rb soit conduit directement à la malignité intraoculaire plus courante chez les enfants, rétinoblastome, ou contribue au développement de nombreux autres types de cancer,5. En outre, Rb est impliqué dans plusieurs voies cellulaires dont la différenciation cellulaire, remodelage de la chromatine et l’apoptose médiée par les mitochondries3,6,7.
Modifications post-traductionnelles jouent un rôle essentiel dans la régulation de RB fonction8,9. La phosphorylation est une telle modification, et il conduit généralement à l’inactivation de Rb. Dans les cellules quiescentes G0, Rb est actif avec un niveau faible de phosphorylation. Comme les cellules franchiront phase G0/G1, Rb est séquentiellement hyper-phosphorylés par une série de kinases cycline-dépendante de protéine (CDKs) et cyclines, tels que de la cycline E/CDK2 et cycline D/CDK4/6, qui inactivent Rb et éliminer sa capacité à réprimer le cycle cellulaire associés de gene expression4,10. RB peut également être modifié par petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO)11,12,13.
SUMO est une protéine d’ubiquitin-comme qui est de façon covalente à une variété de protéines cibles. Il est crucial pour divers processus cellulaires, y compris la régulation du cycle cellulaire, la transcription, la localisation cellulaire des protéines et dégradation, transport et ADN réparation14,15,16, 17 , 18. voie de conjugaison le SUMO se compose de l’enzyme activatrice E1 SUMO dimère SAE1/UBA2, la seule enzyme de conjugaison E2 Ubc9, multiples E3 ligases et protéases spécifiques SUMO. En règle générale, les protéines SUMO naissantes doivent être traitées de clivage protéolytique pour générer la forme mature. Le SUMO mature est activé par l’hétérodimère E1 et ensuite transféré à l’enzyme E2 Ubc9. Enfin, la glycine C-terminale du SUMO est par covalence conjugué à la lysine de la cible d’un substrat, et ce processus est généralement facilité par l’E3 ligases. La protéine SUMO peut être supprimée de la mis à jour le substrat par des protéases spécifiques. Une étude antérieure par les auteurs de cette étude a révélé que la SUMOylation de Rb augmente sa liaison à CDK2, conduisant à la phosphorylation hyper à la phase précoce de la G1, un processus qui est nécessaire pour la progression de cycle cellulaire13. Nous avons aussi démontré que la perte de SUMOylation Rb provoque une prolifération cellulaire réduite. En outre, il a été démontré récemment que la SUMOylation de Rb protège la protéine Rb de proteasome chiffre d’affaires, ce qui augmente le taux de protéine Rb en cellules19. Par conséquent, la SUMOylation joue un rôle important en fonction de la Rb dans divers processus cellulaires. Afin d’étudier les conséquences fonctionnelles et pertinence physiologique de SUMOylation Rb, il est important de développer une méthode efficace pour analyser l’État SUMO de Rb dans les cellules humaines ou les tissus du patient.
SUMOylation est un processus réversible, très dynamique. Ainsi, il est généralement difficile de détecter les protéines SUMO-modifiées dans des conditions totalement endogènes. Cet article présente une méthode pour détecter la SUMOylation endogène de Rb. En outre, il montre comment détecter exogène Rb SUMOylation de Rb sauvage et sa mutation de SUMO-deficient11. En particulier, Jacobs et coll. décrit une méthode pour augmenter la modification de SUMO d’un substrat donné spécifiquement par Ubc9 fusion dirigée SUMOylation (UFD)20. Selon cette méthode, ce protocole décrit comment analyser la SUMOylation forcé de Rb et ses conséquences fonctionnelles. Étant donné que des centaines de substrats SUMO ont été décrits précédemment et plusieurs substrats SUMO présumés ont été identifiés de nombreuses analyses protéomiques, ce protocole peut être appliqué pour analyser la SUMO-la modification de ces protéines dans les cellules humaines.
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Protocol
1. détection de la SUMOylation Rb endogène au début de la Phase G1
- Cell culture et cycle cellulaire synchronisation.
- Cellules HEK293 maintenir en milieu de culture contenant Dulbecco ' s Modified Eagle moyenne (DMEM) additionné de 1 % Strep-Pen et 10 % bovin sérum fœtal (SVF) à 37 ° C et 5 % de CO 2 dans un incubateur.
- Synchroniser les cellules HEK293 lors de la phase G0.
- Comte les cellules HEK293 utilisant un hémocytomètre et semences ~1.5 x 10 7 cellules dans un 15 cm plat avec 25 ml de milieu de croissance pendant 24 h avant le traitement. Après avoir atteint une confluence d’aspirat de 70-80 %, le moyen et le lavage des cellules deux fois avec 5 mL préchauffé solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter 25 mL DMEM contenant 1 % pénicilline-streptomycine et incuber les cellules à 37 ° C pendant 72 h. laver les cellules de la plaque à l’aide de 3 mL de PBS glacée. Les cellules de transfert dans un nouveau tube de 5 mL.
- Sous réserve une petite partie des cellules à l’analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux (étape 1.2), recueillant la majorité restante des cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min à température ambiante et puis les stocker dans un congélateur ultra basse température jusqu'à l’analyse de Rb SUMOylation.
- Pour obtenir la phase G1 cellules, à la fin du processus de synchronisation G0, retirer le DMEM et ajouter milieu dos frais, permettant ainsi les cellules HEK293 à réintégrer le cycle cellulaire. Ensuite, recueillir les cellules à différentes phases G1 (début G1 : 30 min ; G1 : 2 h) pour le cycle cellulaire analyse et autre SUMO dosage.
- Synchroniser les cellules HEK293 lors de la phase de S à l’aide de la méthode de double-thymidine bloc.
Cellules
- cellules HEK293 poussent à une confluence de 50 % et de lavage avec du PBS préchauffée. Ajoutez ensuite additionné de croissance avec la thymidine 2,5 mM pour 18 h (premier bloc).
- Enlever le milieu de la thymidine contenant et laver les cellules deux fois avec du PBS préchauffée. Ajouter le milieu de croissance fraîche pendant 14 h libérer les cellules.
- Jeter le milieu avec une pipette et ajouter le milieu additionné de thymidine 2,5 mM pour encore 18 h (second bloc) avant de procéder à une analyse du cycle cellulaire et Rb SUMOylation.
- La synchronisation pour le G2/M, plaque ~1.5 × 10 7 HEK293 cellules à un plat de 15 cm avec 25 mL de milieu de croissance pendant 24 h. Ajoutez ensuite le nocodazole au milieu jusqu'à l’obtention d’une concentration finale de 400 ng/mL. Enfin, incuber les cellules pendant 16 h avant d’effectuer l’analyse du cycle cellulaire et Rb SUMOylation.
- Analyse du cycle cellulaire par cytométrie.
- Remettre en suspension les HEK293 synchronisée dans du PBS et fixer ensuite la suspension de cellules à l’aide de glacee éthanol à 70 % pendant 2 h à 4 ° C. Notez que pour minimiser la cellule mise en cluster, la suspension cellulaire, ajouter quelques gouttes à l’éthanol glacé de 100 % pour obtenir une concentration finale de éthanol à 70 % tout en douceur Vortex.
- Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g, puis soigneusement éliminer le surnageant et laver les cellules deux fois avec du PBS. Répétez l’étape de centrifugation.
- Ajouter 500 µL PBS contenant 50 µg/mL nucleic acid tacher l’iodure de propidium, 0,1 % Triton X-100 et 1 µg/mL RNase A aux cellules et bien mélanger. Incuber les cellules pendant 15 min à 37 ° C.
- Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu'à l’analyse par cytométrie.
- Immunoprécipitation de protéine Rb endogène.
- Prepare la HEK293 lysats de cellules.
- Lyse les cellules HEK293 synchronisées doucement, re-suspension eux dans 1 mL de tampon de lyse dosage (RIPA) glacee radio-immunoprécipitation (tableau 1) fraîchement ajouté 20 mM N-éthylmaléimide, un inhibiteur de l’isopeptidase qui pourrait bloquer les protéases SUMO et stabiliser SUMO conjugués.
- Encore homogénéiser les cellules sur la glace selon Dounce homogénéisation, sonication ou simplement au travers de 10 fois à travers une aiguille 21 G, attachée sur une seringue de 2 mL. Puis, incuber les cellules sur la glace pendant 5 min.
Remarque : Le dodécylsulfate de sodium détergent anionique (SDS) dans la mémoire tampon RIPA est crucial pour la détermination ultérieure de la Rb-SUMO, car il pourrait éliminer le signal SUMO imprécis qui est dérivé de l’interaction non covalentes entre la protéine Rb et d’autres non-Rb SUMO-espèce.
- Centrifuger les lysats cellulaires à 18 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. transférer les surnageants dans de nouveaux tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 mL.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les protéines peuvent être stockées à-80 ° C pendant au moins 6 mois. - Pour préparer le contrôle d’entrée de chaque échantillon la tache occidentale plus tard, enregistrer une petite partie du liquide surnageant décrite ci-dessus dans un nouveau tube et les conserver à -80 ° C.
- Pour le cas ci-dessus, ajouter 1 µg d’immunoglobulines non spécifiques souris G (IgG) de la même espèce et isotype comme l’anticorps monoclonal de Rb et 20 µL du lisier de 50 % protéine A/G-Sépharose. Puis, incuber pendant 1 heure à 4 ° C, avec une légère rotation.
- Centrifuger les échantillons à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C. soigneusement recueillir le surnageant sans déranger les perles et de les transférer dans de nouveaux tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 mL. Pour chaque échantillon, ajouter 5 µL Rb l’anticorps primaire et 40 µL de 50 % de protéine A/G-Sépharose lisier. Puis, incuber une nuit à 4 ° C, avec une légère rotation.
- Recueillir les perles par centrifugation à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et retirer délicatement le surnageant de pipetage. Notez que pour éviter la perte de la perle, ne pas aspirer le perles sec.
- Laver les billes quatre fois avec 1 mL de tampon RIPA. Chaque fois, les tubes bien mélanger en rotation à 4 ° C pendant 15 min. collecter les perles par centrifugation à faible vitesse à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et le jeter les surnageants.
- Après avoir enlevé les surnageants du lavage final, remettre en suspension les perles dans 30 µL 1 x tampon de chargement électrophorèse (SDS-PAGE) de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (tableau 1) et bien mélanger.
- Incuber les tubes à 100 ° C, dans une chaleur bloquent pour 10 min. centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 1 min granuler les perles. Soigneusement recueillir le surnageant sans déranger les perles et de les transférer aux tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 mL.
- Analyser les échantillons de 4-20 % dégradé SDS-PAGE de gel et Western blot ou stockez-les à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Prepare la HEK293 lysats de cellules.
2. Analyse de 6XHis-tag de SUMOylation de Rb exogène dans les cellules humaines
- Cell culture et transfection.
- Graines ~ 6 × 10 6 HEK293 cellules dans un 10 cm plat et incuber pendant 24 h dans un milieu de croissance dans des conditions de culture cellulaire normale d’acquérir confluentes à 75-85 %. Avant la transfection, enlevez le milieu de croissance et ajouter 6 mL de sérum réduit préchauffée milieu (voir Table des matières) et puis replacez la vaisselle dans l’incubateur.
- Essai de SUMOylation constitutive pour le Rb, ajouter 15 µg de chacun des émetteurs 6XHis Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT et plasmides Ubc9-C93S dans 500 µL de milieu de sérum réduit en tubes de 1,5 mL de micro-centrifuge, respectivement.
- Pour analyser la conjugaison-SUMO de type sauvage Rb et son mutant de SUMOylation défectueux, mélanger 10 µg de chaque plasmide de Rb-WT ou Rb-K720R 6XHis-tag avec GFP-SUMO1 (10 µg) dans 500 µL réduit moyen de sérum dans 1,5 mL micro-centrifugeuse tubes de 13.
- Pendant ce temps, dans une éprouvette, mélanger 50 µL de réactif de transfection (voir Table des matières) dans 500 µL réduit moyen de sérum et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Entièrement combinent les deux tubes distincts décrits ci-dessus et incuber à température ambiante pendant 15 min. ajouter la transfection des complexes de réactif/plasmide dans les cellules et continuer à la culture pour 8 h-5 % CO 2 et 37 ° C.
- Remplacer le moyen de sérum réduit avec le milieu de croissance et incuber les cellules dans des conditions de culture normale pendant 48 h après la transfection.
- Nickel déroulant affinité de la protéine Rb-le tag 6XHis.
- Lyser les cellules HEK293 transfectées et extraire les protéines totales, comme le décrit la Section 1.3.1.
- Centrifuger les lysats cellulaires à 18 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. soigneusement collecter les surnageants et transférez-la sur tubes propres.
Remarque : La protéine peut être figée à ce point pendant plus de 6 mois à -80 ° C. - Pour préparer le contrôle d’entrée de chaque échantillon la tache occidentale plus tard, sauver une petite partie des surnageants décrites ci-dessus pour un nouveau tube et conserver à -80 ° C.
- Lavage 25 µL de 50 % de nickel nitrilotriacétique acides perles de gel d’agarose (Ni-NTA) avec un tampon RIPA deux fois dans un tube à centrifuger-micro 1,5 mL pour chaque échantillon. Collecter les perles par centrifugation à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C.
- Ajouter 1 M imidazole à chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de 10 mM. Puis, ajoutez chaque échantillon dans le tube contenant les billes de gel d’agarose préparés Ni-NTA.
- Incuber les perles et les lysats pendant 2 h à 4 ° C, avec une légère rotation. Tourner les talons à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et retirer délicatement les surnageants de pipetage. Pour éviter la perte de la perle, ne pas aspirer le perles sec.
- Laver les billes avec 1 mL de tampon de lavage contenant imidazole de 20 mM (tableau 1). Chaque fois, les tubes bien mélanger en rotation à 4 ° C pendant 15 min. collecter les perles de la filature à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et jeter les surnageants.
- Après le lavage final, ajouter 30 µL d’élution tampon imidazole contenant de 250 mM (tableau 1) pour chaque échantillon et balayer pour mélanger. Puis, incuber pendant 20 min à 4 ° C pour éluer les protéines.
- Mélanger chaque échantillon avec tampon de charge 6 × SDS-PAGE (tableau 1). Puis, incuber les tubes à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 10 min.
- Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 1 min granuler les perles. Soigneusement recueillir le surnageant sans déranger les perles et transférer les échantillons pour tubes de centrifugeuse-micro 1,5 ml. Les échantillons peuvent être analysés par Western blot ou conservés à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.
3. Western Blot
- charger l’immunoprécipitation ou tirer vers le bas des échantillons prélevés dans les étapes précédentes sur gel SDS-PAGE dégradé de 4 à 20 %. Procéder à l’électrophorèse à 120 V pendant 90 min séparer les protéines.
- Transfert des protéines du gel sur une membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF) en electroblotting à 300 mA pendant 90 min à 4 ° C à l’aide de la méthode de transfert du réservoir. Bloquer la membrane en PVDF dans un tampon de bloc contenant 5 % de lait écrémé (tableau 1) pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber la membrane avec l’anticorps primaire dans un tampon de dilution d’anticorps contenant 3 % d’albumine sérique bovine (BSA) (tableau 1) pour la nuit à 4 ° C. Pour les anticorps primaires, utilisez une travail concentration de 0,5 µg/mL (anticorps anti-SUMO1), ou une dilution de 1 : 2000 (anticorps anti-Rb et anti-tubuline) ou 1:5,000 (anti-GFP et anticorps anti-His).
- Laver la membrane 3 x 10 min chaque fois à l’aide de 1 x tampon tris salin avec tampon de Tween (TBST) (tableau 1). Incuber la membrane avec des espèces spécifiques anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort HRP 1:5,000 dilué dans un tampon de bloc contenant 5 % de lait (tableau 1). Laver la membrane 3 x 10 min chaque fois à l’aide de la mémoire tampon x TBST 1.
- Incuber la membrane avec la chimiluminescence améliorée (ECL), solution de travail. Couvrir la membrane d’une pellicule plastique et l’exposer à la radiographie en fonction sur la force de signal.
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Representative Results
Pour détecter endogène Rb SUMOylation au cours de la progression du cycle cellulaire, cette étude a tout d’abord synchronisé cellules HEK293 à cinq stades différents du cycle cellulaire (G0, début G1, G1, S et G2/M) tel que décrit dans la section protocole du présent document. La qualité de synchronisation a été confirmée à l’aide de la tache d’acide nucléique avec l’iodure de propidium suivie d’analyse en cytométrie en flux (Figure 1). Ensuite, les cellules ont été recueillies et lysées par dénaturation tampon RIPA. L’inhibiteur de protéases SUMO, N-éthylmaléimide, a été ajouté à une concentration finale de 20 mM pour préserver le signal natif de SUMO pendant les expériences. Immunoprécipitation des espèces dans des conditions de bloquer les interactions non covalentes imprécise et la tache occidentale suivante à l’aide d’un anticorps anti-SUMO1 dénaturantes Rb endogène, la présence du signal SUMO a été détectée plus précisément à la début phase G1 (Figure 2). Bien que la SUMOylation globale a été améliorée à la phase S/G2/M, à la point de la SUMOylation Rb du temps, il n’avait pas changé (Figure 2, panneau de saisie). Cette constatation suggère que la SUMOylation de Rb n’est pas simplement la conséquence de l’activité mondiale modifiée de conjugaison de SUMO. Ainsi, ces résultats montrent que la protéine immunoprécipitation et Western blot analyse décrite dans cet article permettent la détection de SUMOylation de la protéine Rb endogène.
Pour détecter la SUMOylation forcée de la protéine Rb, cette étude générée un SUMOylated Rb constitutive construire en fusionnant Ubc9, la ligase SUMO E2 seule, à son C-terminal permettant une efficace et sélectif SUMOylation de Rb (Figure 3A). La mutation de la perte de fonction de Ubc9, C93S, est également fusionnée au C-terminal de Rb pour servir un contrôle (Figure 3A). Afin de renforcer davantage la spécificité du signal SUMO-Rb, Ubc9 non-fusion seul a été construit ainsi. Tous les quatre des plasmides His marqués ont été transfectés dans les cellules HEK293 pendant 48 h avant ils sont lysées dans un tampon RIPA additionné de 20 mM N-éthylmaléimide. Toutes les protéines ont ensuite été soumis à une traction vers le bas dosage, comme décrit dans la section protocole du présent document. Les protéines de Rb éluées ont été analysés par Western blot. Le Ubc9 fusion dirigée que sumoylation de Rb a été détectée à l’aide d’un anticorps anti-SUMO1 (Figure 3B, panneau de SUMO1), tandis que la mutation défectueuse Ubc9, C93S, n’a pas pu produire ce signal. Notez que la SUMO très efficace-modification causée par conduit de Ubc9-fusion à une bande de poids moléculaire plus élevée qui pourrait même être directement détecté à l’aide de l’anticorps de Rb, et il correspond au signal SUMO (Figure 3B, panneau de Rb). En outre, Ubc9 seul n’a pas causé une conjugaison de SUMO, confirmant encore la SUMOylation Rb spécifique (Figure 3B).
Parce que SUMO1 est conjugué à la lysine 720 de la protéine Rb11, pour analyser la SUMOylation Rb, cette étude a permis une mutation SUMO déficients en remplaçant ce résidu lysine par une arginine (K720R). Afin de faciliter la détection de SUMO-conjugaison des deux protéines Rb transitoirement exprimées, une construction de GFP-SUMO1 a été ajoutée pour améliorer le signal intracellulaire de SUMO. Son étiquette de type sauvage ou mutant Rb a été conjointement transfecté dans des cellules HEK293 avec GFP-SUMO1, suivi par menu déroulant test et analyse de la capacité de conjugaison Rb-SUMO1. Tel qu’observé, le mutant K720R aboli totalement la SUMO-modification du Rb, renforcer la capacité de la méthode proposée pour détecter la SUMOylation Rb (Figure 4).
Figure 1 : Validation de l’essai de synchronisation du cycle cellulaire par cytométrie. Les cellules HEK293 étaient cultivés et synchronisées à la G0, G1 au début, les phases G1, S et G2/M du cycle cellulaire comme décrit dans le présent protocole. Cycle cellulaire distributions ont été déterminées par cellule activée par fluorescence triant (FACS). Les données représentées illustre un exemple de l’analyse quantitative de l’essai de FACS (n = 1). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Rb est SUMOylated au début de la phase G1. Les cellules HEK293 ont été synchronisées à différentes phases du cycle cellulaire, tel que décrit dans le présent protocole. Les cellules ont été recueillies et lysées dans un tampon RIPA additionné de 20 mM N-éthylmaléimide. Les contrôles d’entrée ont été chargés sur un gel de gradient de SDS-PAGE 4-20 %, transférés et effacés avec anti-SUMO1 et anti-tubulin, comme il est indiqué. Les lysats de cellules restantes ont ensuite été soumis à l’immunoprécipitation utilisant des anticorps anti-Rb à une dilution de 1 : 200. Les éluants résultantes ont été séparés par gradient gel de SDS-PAGE 4-20 % et immunoblotted à l’aide d’anticorps anti-SUMO1 et anticorps anti-Rb. Cette expérience a été répétée deux fois avec le même résultat. Ce chiffre a été modifié avec la permission de13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Détection de la SUMO-modification de la protéine de fusion Rb-Ubc9. (A) schéma des constructions de SUMOylation (UFD) dirigée fusion Ubc9 de Rb. (B) Constitutive SUMOylation de Rb causée par l’UFD. Les cellules HEK293 transfectées de manière transitoire avec son étiquette UFDS constructions ont été lysées dans un tampon RIPA par N-éthylmaléimide de 20 mM. Le total de lysat de chaque échantillon est incubé avec des perles d’agarose Ni-NTA à tirer vers le bas les protéines de fusion de son étiquette Rb-Ubc9 ou Ubc9 (utilisé comme contrôle négatif), respectivement. Les protéines purifiées sont séparés par gradient gel de SDS-PAGE 4-20 % et immunoblotted avec des anticorps anti-His et anti-SUMO1. Sa-Rb : 6XHis tag Rb-Ubc9 protéines de fusion ; Sa-Ubc9 : 6XHis tag Ubc9 seulement. RB-Ubc9 : non modifiées Rb-Ubc9 ; RB-Ubc9-S: SUMOylated Rb-Ubc9 ; Hyper-pRb-Ubc9 : hyper-Rb-Ubc9 phosphorylée. Les résultats affichés dans la figure sont représentatifs des trois essais indépendants. Ce chiffre a été modifié avec la permission de13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . La mutation de SUMO-deficient K720R réduit la SUMOylation de Rb. Les cellules HEK293 ont été transitoirement co transfectées avec les constructions Rb-His type sauvage ou mutant avec GFP-SUMO1. Les cellules ont été recueillies et lysées dans un tampon RIPA additionné de 20 mM N-éthylmaléimide. Une petite partie des lysats a été analysée directement par Western blot sous le contrôle d’entrée. Le reste des lysats sont incubées avec des perles d’agarose Ni-NTA à tirer vers le bas les protéines de son étiquette Rb tel que décrit dans le présent protocole, et ils ont été immunoblotted avec des anticorps anti-His et anti-SUMO1. Notez que la mutation de lysine-à-arginine à 720 de Rb totallié abolit la modification de SUMO de cette protéine. L’expérience a été réalisée une fois avec un résultat semblable à celui signalé auparavant11. Ce chiffre a été modifié avec la permission de13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Solution | Composants | Commentaires |
| Tampon de lyse RIPA | 50 mM Tris, pH = 8,0 ; 150 mM NaCl ; 1 % NP-40 ; désoxycholate de sodium 1 % ; 0,1 SDS % | Ajouter inhibiteur de la protéase cocktail et N-éthylmaléimide immédiatement avant l’emploi. |
| Tampon de lavage | 50 mM NaH2PO4 de pH = 8,0 ; 300 mM NaCl ; imidazole de 20 mM | Utilisé pour tirer vers le bas dosage uniquement |
| Tampon d’élution | 50 mM NaH2PO4 de pH = 8,0 ; 300 mM NaCl ; imidazole 250 mM | Utilisé pour tirer vers le bas dosage uniquement |
| 6 x tampon de chargement | 0,5 M Tris, pH = 6,8 ; 30 % de glycérol ; SDS DE 10 % ; 5 % de β-mercaptoéthanol ; 0,1 % bromophénol bleu | Conserver à-20 ° C |
| 10 x tampon | 0,25 M Tris, pH 8,6 ; 1,9 Glycine M ; 1 % SDS | Faire 1 x Running Buffer : Mélanger 100 ml 10 x Running Buffer avec 900 mL FD2O |
| 10 x tampon de transfert | 0,25 M Tris, pH 8,3, 1,9 M Glycine | Faire 1 x tampon de transfert : Mélanger 100 mL 10 x transfert tampon avec 200 ml de méthanol et 700 mL FD2O |
| Tampon de 10 x TBS | Dans 1 L de ddH2O: 24,08 g Tris pH 7,4 ; 80 g de NaCl | Faire 1 x TBST tampon : Mélanger 100 mL 10 x TBS tampon avec 900 mL FD2O et 1 mL de Tween-20 |
| Tampon de blocage | 1 x TBST avec 5 % de lait sec | Préparer le tampon immédiatement avant utilisation |
| Tampon de Dilution des anticorps | 1 x TBST avec 3 % BSA et 0,02 % d’azide de sodium | Ce tampon peut être stocké à 4 ° C pendant au moins 6 mois |
Tableau 1 : Les Solutions et tampons.
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Discussion
Cet article décrit un protocole visant à détecter et analyser la SUMOylation endogène de Rb dans les cellules humaines. Comme cette méthode est spécifiquement axée sur la protéine Rb endogène sans aucune modification du signal global de SUMO, c’est un outil important pour enquêter sur les modification de Rb-SUMO dans des circonstances tout à fait naturelles physiologiques.
Pour atteindre cet objectif, il est important de garder à l’esprit que : 1) bien que SUMO comprend quatre isoformes (SUMO1-4, chacun codées par des gènes différents) en comparaison de l’ubiquitination, toutes les espèces SUMO sont beaucoup moins abondants ; 2) pour la plupart des protéines cibles SUMO, seule une petite partie d’une protéine donnée est SUMOylated à l’état stable, qui est le résultat de la compétition constante entre les enzymes impliquées dans la conjugaison de SUMO et deconjugation14,21; et 3) objectifs SUMO peuvent subir des cycles rapides de SUMOylation et deSUMOylation. Par exemple, des données récentes obtenues par les auteurs du présent document actuel démontrent que Rb-SUMO1 n’existe que pour une très courte fenêtre de temps dans la phase précoce de la G1, qui concorde avec la conception que la SUMOylation est un processus réversible, très dynamique13 . Tous ces faits rendent difficile à détecter directement la SUMOylation endogène d’une protéine donnée. Ainsi, pour détecter avec succès, il est essentiel d’identifier les conditions exactes dans lesquelles cette modification a été apportée. Par exemple, dans le présent protocole proposé, le moment de la synchronisation du cycle cellulaire est crucial pour la détection de SUMOylation Rb. Une procédure expérimentale optimisée est aussi importante pour la détection efficace de l’espèce à basse altitude de SUMO-modification d’une protéine donnée. Par exemple, sonication appropriée ou par le biais de croisement aiguilles pourraient prévenir la formation de composants collants et visqueux en raison de l’ADN génomique, ainsi sonication appropriée peut faciliter l’extraction de protéines totales. En outre, un bon anticorps monoclonal avec une haute affinité pour la protéine cible pourrait être utile pour améliorer la quantité et la spécificité d’immunoprécipitation. En résumé, la méthode proposée est importante pour explorer davantage les conditions physiologiques dans lesquelles Rb endogène est SUMOylated, qui est le principe du test fonctionnel suivant axée sur la surexpression.
Pour amplifier le signal SUMO d’une protéine donnée, il est courant de co-overexpress cette protéine, mais aussi des autres protéines SUMO-associés (généralement les protéines Ubc9 et SUMO) dans les cellules. Bien qu’un simple Western blot utilisant un anticorps contre le substrat est la meilleure façon de trouver le poids moléculaire plus élevé, la forme de SUMOylated de cette protéine, nous n’avons pas détecter le signal de SUMO-Rb avec cette méthode. Ainsi, cet article uniquement focalisée sur une méthode pour détecter la SUMO-modification de la protéine précipitée de la Rb exogène. En outre, cette méthode décrit comment artificiellement améliorer ou éliminer la conjugaison-SUMO de Rb. Comme la ligase E2 seule, Ubc9 s’est avéré de transférer directement les SUMO sur des cibles spécifiques,22. Ainsi, par la fusion à la borne C du Rb, Ubc9 favorise nettement la SUMO-modification du Rb. à l’aide de cette méthode, les auteurs de cette étude a démontré avec succès que la SUMOylation de Rb promu suffisamment sa propre phosphorylation en augmentant sa liaison CDK213. En outre, afin d’étudier les conséquences fonctionnelles de la perte de SUMOylation Rb, les auteurs a généré une construction de SUMO-deficient Rb, comme indiqué précédemment11. À l’aide de la méthode proposée dans ce document, il a été démontré que SUMO-Rb est nécessaire à la normale du cycle cellulaire la progression et les cellule prolifération13.
En plus de SUMO1, SUMO2 et SUMO3 jouent aussi un rôle important en protéines SUMOylation14,17. Sumo2 et SUMO3 sont souvent dénommés SUMO2/3 car ils sont étroitement liés et partagent l’identité de 97 %. SUMO1 partage un 50 % de similarité avec SUMO2/3. Il est largement admis que SUMO1 est responsable des fonctions physiologiques des cellules normales et d’entretien, alors que SUMO-2/3 est principalement impliqué dans les réponses de stress cellulaire15,17,23, 24. étant donné que Rb pourrait également être SUMOylated par SUMO2/3 avec fonction inconnue12, la méthode proposée dans la présente étude est toujours appropriée pour la détection et l’analyse de cette modification de Rb. En plus de la Rb, les méthodes décrites ici peuvent être largement appliquées à la détection et l’analyse fonctionnelle de la SUMOylation d’une variété de protéines cibles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par des subventions de la Science et la technologie Commission de Shanghai (concession no 14411961800) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant no 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
