Summary
המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. בנוסף, נבדקה את הדיר של שיטת חמישה זנים שונים דג זברה.
Abstract
המגמות הנוכחיות מדעים וביוטכנולוגיה להוביל יצירה של אלפי קווים חדשים דגם אורגניזמים ובכך מובילים והצורך שיטות חדשות עבור אחסון בטוח של משאבים גנטי מעבר השיטות הנפוצות אצל לשמור. על גידול במושבות. המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. הקפאה קריוגנית תאי נבט בשלב מוקדם על ידי האשכים כל ניב מציע אפשרויות האחסון של דג זברה משאבים גנטי, במיוחד לאחר ההשתלה יכולה פירעונם לתוך גמטות גם זכר וגם נקבה. האשכים היו טוחנות, על מחט אקופונקטורה, equilibrated בתקשורת cryoprotective שני (equilibration לאודנום מתנול 1.5 M ו- 1.5 M פרופילן גליקול; ופתרון ויטריפיקציה המכילה 3 מ' דימתיל סולפוקסיד ו 3 מ' פרופילן גליקול) צלל לתוך חנקן נוזלי. הדגימות היו חימם בסדרה של שלושה פתרונות חימום הסוגר. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם (1) חוסר spermatozoa לאחר העיכול של האשכים ומחוממת למוצא מניפולציות במורד הזרם; (2) אולטרה מהירה קירור המאפשרים את החשיפה האופטימלית של רקמות לחנקן נוזלי ולכן למקסם את הקירור ואת הקטנת הריכוז הנדרש של cryoprotectants, ובכך מקצר את הרעילות שלהם; (3) סינכרונית חשיפת האשכים מספר cryoprotectants, חנקן נוזלי; והפגינו הדיר (4) על-ידי רכישת יכולת הקיום של מעל 50% ב- 5 זנים שונים דג זברה.
Introduction
הרומן מגמות מדעים וביוטכנולוגיה הובילו ליצירתו של אלפי שורות מוטציה חדשה של עכברים, דרוזופילה, דג זברה, מינים אחרים משמשים והאורגניזמים מודל ביורפואי ו- מדעים אחרים1. יתר על כן, כפי טכנולוגיות חדשות שפותחו ולהיות זמין, מספרי הקווים המוטנטים להגדיל בהתמדה2. זה מוביל הצורך אחסון בטוח של משאבים גנטי מעבר השיטות הנפוצות אצל לשמור. על גידול במושבות. כמו שיטה המאפשרת אחסון בטוח של משאבים גנטי לתקופה לא מוגבלת של זמן, הקפאה קריוגנית מציע יתרונות רבים כגון הארכת עונת הרבייה, עוקף את הצורך תחזוקה רציפה של broodstock, זה יותר עלות - ו עבודה יעיל2.
פרוטוקולים עבור זרע הקפאה קריוגנית פיתחה במהלך בעבר מספר שנים2,3,4 מציעים את ההזדמנות לאחסון מוצלחת של חומר גנטי זכר דג זברה. עם זאת, הקפאה קריוגנית של ביציות או עוברים בדגים אינו אפשרי עדיין בשל המבנה המורכב שלהם ואת כמויות גדולות של חומר חלמון. לאחרונה, המנהג של השתלת בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) או בתאי גזע spermatogonial (SSCs) מציע ניתוח מעקפים כדי מחסום זה מתפתח זרע פונקציונלי וביצים לאחר השתלת5. לכן, הקפאה קריוגנית של SSCs מציע אפיק חדש בתחום שימור משאבים גנטי נדיר ורב ערך.
אף-על-פי הקפאה קריוגנית מציע יתרונות רבים, תהליך ההקפאה של קצב איטי מייצר מספר תנאים שעלולות להוביל לנזק תא2. אלה כוללים היווצרות קרח תאיים חוץ-תאית, התייבשות, רעילות cryoprotectant ואחרים. קרח תאיים גורם נזק לתאים, קרח חוץ-תאית עשויה להוביל ריסוק מכני של תאים, תוך פיזור מים מתאי במהלך קצב איטי קפוא עלול להוביל להתייבשות6. לאחרונה הוחל ויטריפיקציה כמו שיטה אשר מונע את ההשפעות השליליות של היווצרות קרח ב הקפאה קריוגנית של דגים גמטות7,8,9. הוא מציג שיטת הקירור אולטרה מהירה שדרכו התקשורת פנימיים וחיצוניים להפוך מצב אמורפי מזוגגות ללא crystalizing לתוך קרח7,10. ויטריפיקציה מוצלחת של רקמת האשכים ואת השחלות העגום מינים העופות בתרבית של10,11,12, ובכך לפתוח אפשרויות היישום שלה בדגים, כמו גם.
במחקר זה, אנו מציגים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) נוהל הקפאה קריוגנית של כל דג זברה האשכים. נדגים שיטה אמינה עבור בידודו של דג זברה בשלב מוקדם בתאי הנבט ללא זיהום, תהליך הקפאה קריוגנית המניבה כמות גבוהה יחסית בתאי הנבט בשלב מוקדם עם נוכחות נמוכה של תאים אחרים, במיוחד spermatozoa. לפי מיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון להדגים פרוטוקול מטמיעים מפורט לקירור אולטרה מהירה של רקמת האשכים דגים דג זברה germline תאים. בנוסף, הדיר של השיטה הוא הפגינו חמישה זנים שונים דג זברה: AB פראי סוג, קספר (רוי- / -; נאקרה- / -), נמר (ליאוt1/t1), "ואסה" [Tg (vas::eGFP)] וקו Wilms הגידול [Tg (wt1b::eGFP 1)] מהונדס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי לחוק לרווחת בעלי חיים הונגרי.
1. מגיב הכנה
- פתרונות מניות
- להכין טרהלוז 1 מ' על-ידי הוספת 0.378 גר' טרהלוז וגופרית והרכבו לתוך 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.
- להכין סוכרוז 1 מ' על-ידי הוספת 0.342 גר' סוכרוז לתוך 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.
- להכין 1 מ' HEPES על-ידי הוספת 0.238 גר' HEPES 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.
- להכין collagenase 20 מ"ג/מ"ל (U 290/mg) על-ידי הוספת 100 מ ג מ ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.
- להכין טריפסין 15 מ"ג/מ"ל (~ 10000 U/mg) על-ידי הוספת 75 מ"ג עד 5 מ"ל ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.
- להכין 1 מ"ג/מ"ל DNase אני (~ 3000 U/mg) על-ידי הוספת 5 מ"ג עד 5 מ"ל ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.
- להכין 0.4% trypan blue על-ידי הוספת 40 מ"ג trypan blue 10 מ"ל ל- PBS. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. 1 מ"ל aliquot לתוך צינורות 1.5 mL.
- להכין 200 mg/L MS-222 (Tricaine מתאן סולפונאט) על-ידי הוספת 200 מ ג של MS-222 לתוך 1 ליטר של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין. בנוסף, MS-222 בופר עם סודיום ביקרבונט כדי pH נייטרלי של 7.0.
- פתרונות עבור ויטריפיקציה
- להכין פתרון Equilibration (ES): להכין 2 מ"ל של ES על ידי ערבוב 121.5 µL של מתנול (MeOH; 1.5 M), 220 µL של פרופילן גליקול (פ"ג; 1.5 M), 200 µL של FBS (10%), 200 µL של טרהלוז מניות פתרון (0.1 M), 50 µL של HEPES מניות פתרון (25 מ מ) ו- µL 1208.5 של L-15 לתוך 2 mL שפופרת.
- להכין ויטריפיקציה פתרון (לעומת): להכין 2 מ ל VS על ידי ערבוב µL 439 של PG (3 מ'), µL 426 של דימתיל סולפוקסיד (לי2; 3 מ'), 200 µL של FBS (10%), 200 µL של פתרון מניות טרהלוז (0.1 M), 50 µL של HEPES במניה פתרון (25 מ מ) ו- 685 µL של L-15 לתוך צינור 2 מ"ל.
- פתרונות חימום
- להכין פתרון חימום 1 (WS1): להכין 1.5 מ של WS1 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב µL 150 של FBS (10%), 450 µL של פתרון מניות סוכרוז (3 מ'), 900 µL של L-15.
- להכין פתרון חימום 2 (WS2): להכין 1.5 מ של WS2 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב µL 150 של FBS (10%), 150 µL של סוכרוז מניות פתרון (1 מ') ו- 1200 µL של L-15.
- להכין פתרון התחממות כדור הארץ 3 (WS3): להכין 1.5 מ של WS2 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב 150 µL FBS (10%) ו- 1350 µL של L-15.
- להכין פתרון עיכול: עבור כל דגימה להכין µL 500 של הפתרון לעיכול על ידי ערבוב 50 µL של collagenase מניות פתרון (2 מ"ג/מ"ל), 50 µL של פתרון מניות טריפסין (1.5 mg/mL), µL 10 של DNase (20 µg/mL) ואני µL 390 של L-15 ב mL 2 צינור.
- להשיג כלי חיתוך: מספריים, microscissors, פינצטה, פינצטה מעוקל, דיקור מחטים.
2. האשכים אוסף
- המתת חסד הדג על-ידי הצבתו לתוך תבשיל המכיל 200 mg/L MS-222 (ה-pH = 7). לפני שתמשיך עם הקרע, ודא כי הגג יש הפסיק לזוז, זה לפחות 10 דקות חלפו מאז הרגע כדי להבטיח מוות על-ידי היפוקסיה.
- יבש את הדג על ידי לכם בערגה על מגבת נייר ומניחים אותו על צדו הגבי על מזרון ויבתר.
- קודם כל לחתוך את הסנפירים האגן, החזה עבור ניתוח קל יותר.
- אופקית לגזור את העור על בטנו של הדג בין במינימום וחותכים את העור והשרירים הבסיסית לאורך הבטן עד הפרק אנאלי.
- פתח לתוך חלל הגוף של הדג, להצמיד לקיר הגוף ימינה ושמאלה על המזרן הקרע עם מחטים.
הערה: האשכים נמצאים מעל אברי מערכת העיכול משני הצדדים של שחייה שלפוחית השתן (איור 1).
- כדי למנוע זיהום, לא להוציא את האיברים במערכת העיכול, אבל בעדינות לדחוף אותם לצד אחד ולהסיר בזרמה מן הצד היריב. האשכים מחוברים לקיר הגוף אז להסיר אותם בקפידה, קיצוץ של הצפק חיבור microscissors.
- בנוסף, על מנת למנוע זיהום, ראשית לעקר את האשכים על ידי לשים אותם 70% אתנול עבור s 2, ולאחר מכן מקם אותם בתוך L-15 על צלחת 96-ובכן על קרח.
הערה: אם זה הכרחי, נקי האשכים של רקמות שומן וגדולים דם כלי בדיוק מתחת stereomicroscope
3. אולטרה צינון מהיר של רקמת האשכים
- מארק מחטים עם תוויות המתאים בהתאם הדגימה הקלד ולהכין את equilibration (ES) והפתרונות ויטריפיקציה (לעומת).
- העבר את האשכים צלחת גדולה יותר טוב או תבשיל, הסיכה שלושה האשכים (או יותר בהתאם לגודל של המחט) על מחט אקופונקטורה סטרילי.
- ראשית הצב בזרמה על פינצטה מעוקל. מקם את נקודת של המחט באמצע בזרמה, משוך בזהירות בזרמה כלפי מעלה עם הפינצטה.
- לאחר ניקב בזרמה, משוך אותו בעדינות כלפי מעלה לכיוון החלק העליון של המחט. ודא האשכים מופרדים אחד מהשני, כי הם לא ליפול או מחליק במורד.
- המקום מלא המחטים עם האשכים מוצמדים צינור 2 מ"ל עם L-15 עד ויטריפיקציה (ב 25 הלעפה תרוטרפמט; אחסון זמן לא יעלה על 1 h).
הערה: הצמדה האשכים המחט צריך להיעשות במהירות כדי למנוע את האשכים ממנו להתייבש.
- להעביר את המחט עם האשכים אל הפתרון equilibration, תקופת דגירה של 5 דקות ב- 25˚C.
- להעביר את המחט לתוך הפתרון ויטריפיקציה ואת תקופת דגירה של 30 s ב 25˚C.
- הסר את המחט מהפתרון ויטריפיקציה, במהירות ובעדינות סופגים את הפתרון הנותרים של הרקמה על ידי מגבת נייר סטרילי. . בזהירות כדי למנוע את האשכים נדבקות מגבת הנייר או ליפול.
- במהירות למקם את המחט לתוך חנקן נוזלי ממוקמים בתוך קופסת קלקר.
הערה: לבצע שלב זה במהירות כדי למנוע חשיפה של רקמות לאדים חנקן נוזלי. השתמש כמויות נמוכות של חנקן נוזלי למניעת זיהום צולב של דגימות. - שמור את המחט חנקן נוזלי בתוך קופסת קלקר סגורה למשך 5-10 דקות.
- Precool של cryotube מ ל 4.5 שנפתחו והכובע שלו באותה תיבת.
- לאחר 5-10 דקות, להעביר כל המחט לתוך cryotube נפרדים מתחת לפני השטח של חנקן נוזלי וסגור את cryotube.
התראה: השתמש תמיד ביגוד מגן (כגון כפפות מבודדות) כאשר עובד עם חנקן נוזלי, כמו חשיפה יכולה להוביל כווית קור חמורה. - מניחים את cryotube על מקל מתכת ומניחים אותו בתוך המיכל cryobank מהר ככל האפשר. לאחסן את הדגימות לאחסון מיכל דיואר עד שימוש נוסף.
4. תהליך התחממות כדור הארץ
- חמים כל המחט בנפרד. כל הפתרונות התחממות כדור הארץ צריך להיות ב 25 º C.
- לנתק את cryotube של המקל מתכת, טיבלו זה חנקן נוזלי המאוחסנים בתוך קופסת קלקר.
- לפתוח את cryotube האדים חנקן נוזלי (באמצעות מלקחיים) ולשחרר את המחט לתוך החנקן הנוזלי.
- להעביר את המחט מהר מאוד לתוך הפתרון התחממות כדור הארץ הראשונה, תקופת דגירה של 1 דקה (25 ° C). הקפד להעביר את המחט במהירות כדי למנוע את ההתחממות באוויר במהלך העברת.
- להעביר את המחט לתוך הפתרון ההתחממות השניה, תקופת דגירה של 3 דקה (25 ° C).
- להעביר את המחט לתוך הפתרון התחממות כדור הארץ השלישי, תקופת דגירה של 5 דקות (ב- 25 ° C).
- שחרר את האשכים מן המחט על-ידי הזזה אותם כלפי מטה עם פינצטה מעוקל. המקום לכל testis ומחוממת בנפרד לבאר נפרד (96-ובכן צלחת) מלא עם 250 µL של L-15 בתוספת 10% FBS. ודא כי הבארות מסומנות על פי המדגם. לקחת את הצלחת היטב על הקרח עד כל דוגמאות מחוממות, ועד עבודה נוספת.
5. רקמות עיכול
- היכונו µL 500 של הפתרון דיסוציאציה כל דגימה נפרדת mL 2 צינורות. תווית הצינורות על פי הקוד של המדגם. דגירה הפתרון דיסוציאציה מוכן עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- בוזקים את הרקמה ומחוממת הפתרון עיכול, לחתוך אותו לחתיכות קטנות על ידי לפחות 30 תנועות מספריים קטנים.
- דגירה הרקמה שנגזרו על צלחת חזק במשך 90 דקות ב 25 הלעפה תרוטרפמט.
- להפסיק את תהליך העיכול על-ידי הוספת 400 µL של µL L-15 ו- 100 של FBS (10% FBS וי/v). בקצרה לנער את הפתרון, תקופת דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר.
- לסנן את הפתרון שהושג דרך 50 מיקרומטר מסננים לתוך צינור 1.5 מ. תווית הצינורות בהתאם.
- Centrifuge הפתרון המסוננות ב 200 g × 10 דקות ב 25 הלעפה תרוטרפמט.
- בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 20 µL של L15 בתוספת 10% FBS. יש לנער את הצינור באופן ידני עד התפרקה לחלוטין בגדר. לשמור התליה תא על קרח או הלעפה תרוטרפמט 4 עד להמשך השימוש.
6. הכדאיות הערכה וספירת תא
- µL מיקס 5 של הבולם תא, µL 5 של 0.4% פתרון trypan blue בצינור PCR mL 0.2 שכותרתו כראוי. אם אמצעי אחסון שונים משמשים, ודא כי היחס דילול שרידי 1:1.
- דגירה ההשעייה 1 עד 3 דקות בטמפרטורת החדר (25 ° C).
- בדוק את הכדאיות של כל מדגם hemocytometer מתחת למיקרוסקופ.
- לספור את מספר תאים חיים (מוכתם על ידי trypan blue) בשדות 15. לחשב את המספר הכולל של תאים ב- 20 מיקרומטר של התליה תא. ההשעיה מוכן כעת עבור כל יישום במורד הזרם.
הערה: כאשר ייעול ההליך עבור מינים אחרים עם גודל הגוף גדול יותר, השתמש testis שברי משקל שווה. השתמש האשכים מאדם אחד עבור כל קבוצות ניסוי על מנת להימנע השתנות בודדים בתוצאות. במקרה של דג זברה, ניצלנו את העובדה כי שמאלה, testis נכון צריך להכיל מספר זהה (או דומה) בתאי הנבט13 (ראה את התוצאות נציג). בזרמה שמאל נשמר כפקד בזמן בזרמה נכון היה vitrified/מחמם. הכדאיות אחוז מחושב מספר התאים מבודד בזרמה vitrified/חימם לעומת מספר התאים מבודד בזרמה טריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בממוצע, המספר בתאי הנבט בשלב מוקדם מבודד מבחן יחיד דג זברה טריים מגוונות בין תאים 40,000 ו- 200,000 בהתאם לגודל הדג. כאשר מעכל האשכים דג זברה טריים בכל 5 זנים, בתאי הנבט המוקדמות היו לא התאים רק נוכח המתלים תא (איור 2). ליד תאי נבט בשלב מוקדם, spermatozoa רבים נמצאו גם כן. מצד שני, היו הרבה פחות spermatozoa לאחר עיכול של האשכים cryopreserved. זה יצוין כי spermatozoa אינם שורדים פרוטוקול זה קירור מהיר במיוחד, כי הם ככל הנראה מסולקת במהלך תהליך העיכול, אשר מניב השעיה שואב הרבה תאי נבט בשלב מוקדם.
היו אין הבדלים משמעותיים במספר בתאי הנבט בשלב מוקדם בין שמאל וימין האשכים (1 ± 0.5 × 105 לעומת 1.1 ± 0.7 × 105) אדם יחיד הפגינו על ידי האשכים טריים של AB שלושה דג זברה זכרים (חד-כיווני אנובה ; F (1, 4) = 0.04, p = 0.85). כל דג זברה שורות השתמשו במחקר זה, בפרוטוקול הנוכחי קירור אולטרה מהירה הניב הכדאיות ממוצע המחירים גבוהים יותר מ- 50% (טבלה 1).
| אלב פראי סוג | קספר | נמר | "ואסה" מהונדס | גידול Wilms מהונדס | ||
| מספר תאים חיים (× 104) | Testis טריים | 14.5 ± 3.9 | 9.5 ± 2.3 | 12.7 ± 2.4 | 14.5 ± 5.6 | 4.8 ± 1.8 |
| Vitrified testis | 8.7 ± 2.8 | 7.2 ± 3.0 | 8.8 ± 1.7 | 7.6 ± 3.7 | 2.4 ± 0.7 | |
| הכדאיות (%) | 58 ± 9 | 72 ± 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | 53 ± 13 |
טבלה 1- מספר תאים חיים ואחוזי הכדאיות (אומר ± SD) המתקבל דג זברה טריים או vitrified/חימם testis. התוצאות מוצגות עבור קווי בדוקות דג זברה חמש: AB פראי סוג, קספר (רוי- / -; נאקרה- / -), נמר (ליאוt1/t1), "ואסה" [Tg (vas::eGFP)] וקו Wilms הגידול [Tg (wt1b::eGFP 1)] מהונדס.
איור 1. דג זברה בוגרת ביתור הממחיש את המיקום של מבנים אנטומיים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. תאים המתלים מקריסטלים של רקמת האשכים דג זברה טריים וחיממתי vitrified/דג זברה שנבדקו חמש שורות (AB פראי סוג, קספר (רוי- / -; נאקרה- / -), נמר (ליאוt1/t1), "ואסה" [Tg (vas::eGFP)] וקו Wilms הגידול [Tg (wt1b::eGFP 1)] הטרנסגניים) עם תמונה עם ניגודיות שלב מיקרוסקופ. סרגל קנה מידה: 40 µm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה העיקרית של מחקר זה היתה להתאים את המחט שקוע אולטרה מהירה הליך קירור שפותח עבור מינים העופות בתרבית של10,11,12 הקפאה קריוגנית של דגים testis (דג זברה כמודל האורגניזם). רוב המחקרים הקודמים לגבי הקפאה קריוגנית של משאבים גנטי דג זברה התמקדו בעיקר הקפאה קריוגנית של דג זברה זרע2,3,4. עם זאת, פרוטוקולים עבור הקפאה קריוגנית oocytes בוגר, העוברים לא פותחו עדיין, אף-על-פי מחקרים אחרונים מדגימים את הקפאה קריוגנית של oocytes בשלב מוקדם זה מתקבל על הדעת14,15. במחקר זה אנו הפגינו הקפאה קריוגנית מוצלחת של דג זברה spermatogonia אשר מציעה אפשרויות חדשות עבור האחסון של משאבים גנטי יקרים, במיוחד לאחר ההשתלה יכולה פירעונם לתוך גמטות גם זכר וגם נקבה5 .
למיטב ידיעתנו, זה הראשון במחקר העוסקת הקירור אולטרה מהירה של דג זברה רקמות בשיטת ניב. מחקרים דומים כלולים ויטריפיקציה של דג זברה האשכים 0.25 mL קשים מפלסטיק16 ו ויטריפיקציה דג זברה השחלות מיכלי מתכת סגורות14. היתרון העיקרי של ניב לעומת שני המיכלים שהוזכרו הוא חשיפה ישירה של האשכים חנקן נוזלי עם כמויות מינימליות של cryoprotectants להיות מחוברים אליהם, לכן למקסם את קצב הקירור10. העלייה בקצב קירור מפחית את הריכוז הנדרש של cryoprotectants, ובכך מקצר את הרעילות שלהם. יתר על כן, כל החלקים רקמות ניתן לחשוף cryoprotectants, חנקן נוזלי באופן סינכרוני. עם זאת, חשיפה ישירה חנקן נוזלי ייתכן חיסרון אחד לגבי זיהום צולב. זה אפשרי כי חיידקים או וירוסים קיימים החנקן הנוזלי, כי החשיפה רקמות ישיר עלול לגרום לזיהום. לכן, אנחנו מציעים להימנע מכל שימוש חוזר חנקן נוזלי כאשר עורכים ניב, כדי למחוק את החנקן הנוזלי בשימוש לאחר קירור. הציע יתרונות להציע מיכלי מתכת בהקשר זה14, אולם הם היו מותאמות אישית שנעשו, אינם נגישים בקלות כל המעבדות.
בעת השוואה בין צינון אולטרה מהיר לקצב איטי-קפוא, יתרון מכריע אחד של צינון אולטרה מהיר הוא היעדר spermatozoa לאחר עיכול. שיטות הקפאה בקצב איטי הפגינו במינים מסוימים דגי קיפריניד פרוטוקולים דומה תשואות דומות הכדאיות של תאי הנבט בשלב מוקדם והן spermatozoa17 וכתוצאה מכך spermatozoa גבוהה מספרים לאחר עיכול cryopreserved רקמות. התוצאות שלנו דג זברה (המחקר הנוכחי), קרפיון, דגי זהב (שלא פורסמו תוצאות) עולה כי יש מעט מאוד spermatozoa לאחר עיכול של רקמות ומחוממת כי הם לא לשרוד הליך זה ולקבל מעוכל אשר מפשט במורד הנהר יישומים מאז ותכניסו העשרה נוספים נדרשים.
ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול זה. הראשונה היא כדי למנוע כל זיהום במהלך תהליך בידוד מאז היא עלולה להוביל לירידה במספר התאים שהושג, עשוי לעכב את כל היישומים במורד הזרם. אחד הצעדים מכריע הוא כריתה של האשכים איפה זיהום בקטריאלי שעלולים להתרחש מפני נזק אומץ (לכן מומלץ לא לפצוע או להסיר לחלוטין את המעיים) או מן העור, אם באמצעות הכלי חיתוך באותו חיתוך העור, הסרת האשכים. שנית, יש להיזהר בעת הצמדת האשכים דיקור סיני מאז זה אפשרי כי האשכים ליפול או להחליק. נכון לעכשיו, אנחנו בודקים בשיטות שונות כדי למנוע את האשכים הזזה במהלך ההליך ויטריפיקציה (טמפרטורות חנקן נוזלי). שלישית, שים לב התקופה של חשיפה cryoprotectants. חשיפה של האשכים (ובכך גם תאים) ריכוזי cryoprotectant גבוהה (במיוחד בפתרון ויטריפיקציה) עבור זמן רב מדי עלולה לגרום למוות תא בשל רעילות cryoprotectant. כמו כן, תזהר כשאתה צולל את המחטים לתוך חנקן נוזלי; נגב את עודפי של VS כיוון שהוא עשוי להשפיע על תהליך הקירור לצלול את המחטים במהירות כדי להימנע מחשיפה אדי חנקן נוזלי. לבסוף, להעביר את האשכים מ חנקן נוזלי לתוך כלי התקשורת התחממות כדור הארץ במהירות על מנת למנוע התחממות מוקדמת באוויר במהלך ההעברה.
המאמר הנוכחי אנו מציגים את ההליך עבור הקפאה קריוגנית של האשכים של חמישה זנים דג זברה באמצעות MeOH, PG לי2אז כמו המגובש cryoprotectants. השיטה מניבה תוצאות אמינות עבור כל דג זברה שנבדקו זנים עם הכדאיות התא של מעל 50%. . זה ניתן להשתמש בשיטה זו עם שינויים עבור מינים אחרים, כמו גם. ראשית, כל פרוטוקול הקפאה קריוגנית מינים ספציפיים, והוא שונה cryoprotectants תשואות שונות היעילות מינים שונים (כלומר אתילן גליקול הניב הכדאיות הגבוהה ביותר acipenserids18 בזמן שאני2אז הניב את הכדאיות הגבוהה סלמונאיים:19 ו cyprinids17). יתר על כן יש לתת תשומת לב ריכוזי להשתמש גם. את המחקר הנוכחי ואת המחקר שנערך על חום טרוטה Salmo trutta השחלות15 מדגימים התוצאות הטובות ביותר מתקבלים באמצעות ריכוז זהה של שני cryoprotectants, אולם זו עשויה להשתנות במינים אחרים. לבסוף, דג זברה האשכים הם קטנים מאוד, זה אפילו אפשרי להפיל את האשכים מספר על מחט אחת. בעת עבודה עם מינים עם האשכים גדולים יותר, הגודל של יצירות האשכים אשר משמשים הוא גורם חשוב מאד. אנו מציעים כדי להגדיל את זמני חשיפה גדולה יותר חתיכות רקמה לתוך חשבון רעילות cryoprotectant ויעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הלאומית למחקר, פיתוח חדשנות Office הונגריה (גרנט 116912 כדי ÁH), המשרד עלות (מזון, חקלאות עלות פעולה FA1205: AQUAGAMETE), התכנית מלגת Hungaricum Stipendium (מענק ZM) והמעבד החדש ההונגרית הלאומית Predoctoral הצטיינות (מענק EK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K.
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
