Summary
L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. En outre, la répétabilité de la méthode dans cinq souches différentes de poisson-zèbre a été testée.
Abstract
Tendances actuelles de la science et de la biotechnologie menant à la création de milliers de nouvelles lignes dans les organismes modèles, ce qui conduirait à la nécessité de nouvelles méthodes pour le stockage sûr des ressources génétiques au-delà des pratiques courantes de garder les colonies reproductrices. L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. Cryoconservation des cellules germinales précoce par les testicules tout NIV offre des possibilités pour le stockage du poisson-zèbre des ressources génétiques, autant après la transplantation, ils peuvent mûrir en gamètes mâles et femelles. Testicules ont été excisées, a effectué le tombé sur une aiguille d’acupuncture, équilibrée dans deux milieux cryoprotecteurs (équilibration solution contenant du méthanol de 1,5 M et 1,5 M propylène glycol ; et solution de vitrification contenant 3 M le diméthylsulfoxyde et 3M propylène glycol) et plongés dans l’azote liquide. Des échantillons ont été réchauffés dans une série de trois solutions de réchauffement de la planète qui en découle. Les principaux avantages de cette technique sont : (1) l’absence de spermatozoïdes après digestion des testicules réchauffés, ce qui facilite les manipulations en aval ; (2) ultra rapide refroidissement permettant l’exposition optimale des tissus à l’azote liquide donc maximiser le refroidissement et la réduction de la concentration requise des cryoprotecteurs, réduisant ainsi leur toxicité ; (3) synchrone exposition des testicules plusieurs cryoprotecteurs et azote liquide ; et répétabilité (4) a démontré en obtenant la viabilité de plus de 50 % dans cinq souches différentes de poisson-zèbre.
Introduction
Nouvelles tendances en sciences et en biotechnologie ont conduit à la création de milliers de nouvelles lignées mutantes de souris, drosophile, poisson-zèbre et autres espèces utilisées comme organismes modèles dans la recherche biomédicale et d’autres sciences1. En outre, comme les nouvelles technologies sont développées et deviennent disponibles, le nombre de lignées mutantes augmente régulièrement2. Cela conduit à la nécessité d’un stockage sûr des ressources génétiques au-delà des pratiques courantes de garder les colonies reproductrices. Comme une méthode qui permet le stockage en toute sécurité des ressources génétiques pour une période de temps indéterminée, cryoconservation offre de nombreux avantages tels que l’extension de la saison de reproduction, contourne la nécessité d’entretien continu des géniteurs, et c’est plus coût - et efficace du travail2.
Protocoles pour la cryoconservation de sperme développée au cours du passé plusieurs années2,3,4 offrent l’occasion pour stockage réussie du poisson-zèbre mâle matériel génétique. Cependant, cryoconservation de œufs ou embryons chez les poissons n’est pas encore possible en raison de leur structure complexe et de grandes quantités de matériel de jaune d’oeuf. Récemment, la pratique de la transplantation de cellules germinales primordiales (PGC) ou de cellules souches spermatogoniales (SSC) offre une voie de contournement à cet obstacle en développant dans sperme fonctionnel et les œufs après transplantation5. Cryoconservation de SSC propose donc une nouvelle frontière pour la conservation des ressources génétiques rares et précieux.
Même si la cryoconservation offre de nombreux avantages, le processus de congélation lente-taux génère plusieurs conditions pouvant entraîner de dommages cellulaires2. Il s’agit de la formation de glace intracellulaires et extracellulaires, déshydratation, toxicité cryoprotecteur et d’autres. Intracellulaire glace endommage les cellules, glace extracellulaire peut conduire à un broyage mécanique des cellules, tandis que la diffusion de l’eau des cellules au cours de la congélation lente-taux peut conduire à la déshydratation,6. Récemment, vitrification comme une technique qui empêche les effets négatifs de la formation de glace a été appliquée à la cryoconservation des gamètes de poisson7,8,9. Il présente une technique de refroidissement ultra rapide, grâce auquel les médias internes et externes transformer en un état amorphe/vitreux sans cristalliser en glace7,10. Vitrification réussie du tissu testiculaire et ovarien a été mis en évidence dans les espèces aviaires et mammifères10,11,12, ouvrant ainsi des possibilités de son application chez les poissons, aussi bien.
Dans cette étude, nous présentons la procédure de vitrification (NIV) aiguille immergé pour la cryoconservation des testicules tout poisson-zèbre. Nous démontrons une méthode fiable pour l’isolement du poisson-zèbre précoce des cellules germinales sans contamination et un processus de cryoconservation qui produit des quantités relativement élevées de stade précoce des cellules germinales avec une faible présence d’autres cellules, en particulier les spermatozoïdes. Au meilleur de notre connaissance, c’est la première étude à démontrer un protocole détaillé visualisé pour refroidissement ultra rapide du tissu gonadique poisson et poisson-zèbre des cellules germinales. En outre, la répétabilité de la méthode est montrée dans cinq souches différentes de poisson-zèbre : AB type sauvage, casper (roy- / -; nacre- / -), léopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] et lignée transgénique de Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par la loi hongroise du bien-être Animal.
1. préparation du réactif
- Solutions courantes
- Préparer 1 M tréhalose en ajoutant 0,378 g de dihydrate de tréhalose dans 1 mL de dH2O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement.
- Préparer 1 M saccharose en ajoutant 0,342 g de saccharose dans 1 mL de dH2O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement.
- Préparer 1 M HEPES en ajoutant 0,238 g de HEPES à 1 mL de dH2O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement.
- Préparer, collagénase de 20 mg/mL (290 U/mg) en ajoutant 100 mg pour 5 mL de PBS. Bien mélanger jusqu'à ce qu’il se dissout. Filtres stériles par 0,2 µm filtres. Aliquote 50 µL dans 0,2 mL PCR tubes et congeler à - 20 ° C.
- Préparer la trypsine 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) en ajoutant 75 mg pour 5 mL de PBS. Bien mélanger jusqu'à ce qu’il se dissout. Filtres stériles par 0,2 µm filtres. Aliquote 50 µL dans 0,2 mL PCR tubes et congeler à - 20 ° C.
- Préparation de 1 mg/mL DNase I (~ 3000 U/mg) en ajoutant 5 mg pour 5 mL de PBS. Bien mélanger jusqu'à ce qu’il se dissout. Filtres stériles par 0,2 µm filtres. Aliquote 50 µL dans 0,2 mL PCR tubes et congeler à - 20 ° C.
- Préparer le bleu trypan de 0,4 % en ajoutant 40 mg de bleu trypan à 10 mL de PBS. Filtres stériles par 0,2 µm filtres. Aliquote 1 mL dans des tubes de 1,5 mL.
- Préparer 200 mg/L MS-222 (méthane-sulfonate de tricaïne) en ajoutant 200 mg de MS-222 dans 1 L de dH2O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement. En outre, le MS-222 tampon bicarbonate de sodium à un pH neutre de 7.0.
- Solutions pour la vitrification
- Préparer la solution de l’équilibration (ES) : préparer 2 mL de ES en mélangeant 121,5 µL du méthanol (MeOH ; 1,5 M), 220 µL de propylène glycol (PG ; 1,5 M), 200 µL de FBS (10 %), 200 µL de solution-mère tréhalose (0,1 M), 50 µL de solution mère HEPES (25 mM) et 1208.5 µL de L-15 dans un 2 tube de mL.
- Préparer la solution de Vitrification (VS) : préparer 2 mL de VS en mélangeant 439 µL de PG (3 M), 426 µL de diméthylsulfoxyde (moi2SO ; 3M), 200 µL de FBS (10 %), 200 µL de solution mère de tréhalose (0,1 M), 50 µL de HEPES solution mère (25 mM) et 685 µL de L-15 dans un tube de 2 mL.
- Solutions pour le réchauffement de la planète
- Préparer la solution au réchauffement 1 (WS1) : préparer 1,5 mL de WS1 dans un tube 2 mL de mélange 150 µL de FBS (10 %), 450 µL de la solution mère de saccharose (3M) et 900 µL de L-15.
- Préparer la solution au réchauffement 2 (WS2) : préparer 1,5 mL de WS2 dans un tube 2 mL de mélange 150 µL de FBS (10 %), 150 µL de la solution mère de saccharose (1 M) et 1200 µL de L-15.
- Préparer la solution au réchauffement 3 (WS3) : préparer le 1,5 mL de WS2 dans un tube 2 mL de mélange 150 µL FBS (10 %) et 1350 µL de L-15.
- Préparer la solution de digestion : pour chaque échantillon, préparer 500 µL de la solution de digestion en mélangeant 50 µL de la solution mère de collagénase (2 mg/mL), 50 µL de la solution mère de trypsine (1,5 mg/mL), 10 µL de DNase I (20 µg/mL) et 390 µL de L-15 dans un 2 mL de tube.
- Obtenir des outils de dissection : ciseaux, microciseaux, pincettes, pinces courbées et aiguilles d’acupuncture.
2. testicules Collection
- Euthanasier le poisson en le plaçant dans un plat contenant 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Avant de poursuivre la dissection, assurez-vous que les branchies ont cessé de passer et qu’au moins 10 minutes se sont écoulées depuis ce moment pour s’assurer de la mort par hypoxie.
- Sécher le poisson par il tapoter sur une serviette en papier et posez-le sur sa face dorsale sur un tapis de dissection.
- Tout d’abord, couper les nageoires pelviennes et pectorales pour la dissection plus facile.
- Horizontalement, découper la peau sur le ventre du poisson entre les nageoires pectorales et couper la peau et des muscles sous-jacents le long du ventre jusqu'à la nageoire anale.
- Ouvrir la cavité du corps du poisson et la broche de la paroi gauche et droite du corps à la natte de dissection avec des aiguilles.
Remarque : Les testicules sont situés au-dessus des organes gastro-intestinaux des deux côtés de la vessie natatoire (Figure 1).
- Pour prévenir la contamination, ne sortez les organes digestifs, mais doucement les pousser d’un côté et retirer le testicule du côté adverse. Testicules sont connectés à la paroi du corps alors enlevez-les soigneusement et couper le péritoine reliant par microciseaux.
- En outre, afin de prévenir la contamination, d’abord stériliser les testicules en les plaçant dans l’éthanol à 70 % pendant 2 s et puis placer les en L-15 sur une plaque à 96 puits sur la glace.
Remarque : S’il le faut, testicules propres de tissu graisseux et grandes les vaisseaux sanguins précisément sous le stéréomicroscope
3. ultra rapide refroidissement du tissu testiculaire
- Aiguilles de marque avec des étiquettes appropriées selon l’échantillon type et préparent l’équilibration (ES) et les solutions de vitrification (VS).
- Transférer les testicules à une plus grande plaque de puits ou plat et pin deux ou trois testicules (ou plus selon la taille de l’aiguille) sur une aiguille d’acupuncture stérile.
- Tout d’abord positionner les testicules sur le dessus de brucelles courbée. Placez la pointe de l’aiguille au milieu du testicule et tirez doucement les testicules vers le haut avec la pince à épiler.
- Après ponction du testicule, doucement tirer vers le haut vers le haut de l’aiguille. Assurez-vous que les testicules sont séparés les uns des autres et qu’ils ne sont pas tomber ou glisser vers le bas.
- Place les aiguilles avec testicules épinglés dans un tube 2 mL remplies avec L-15 jusqu'à la vitrification (à 25 ˚C ; temps de stockage ne doit pas dépasser 1 h).
NOTE : Épinglant les testicules sur l’aiguille devrait faire rapidement afin d’éviter les testicules ne se dessèchent pas.
- Transférer l’aiguille avec testicules dans la solution de l’équilibration et incuber pendant 5 min à 25 ° c.
- Transférer l’aiguille dans la solution de vitrification et incuber pendant 30 s à 25 ° c.
- Retirer l’aiguille de la solution de vitrification, doucement et rapidement absorber le reste de la solution des tissus par une serviette en papier stérile. Soyez prudent afin d’éviter les testicules s’en tenir à la serviette de papier ou de tomber.
- Placer rapidement l’aiguille dans l’azote liquide placé dans une boîte de mousse de polystyrène.
Remarque : Exécutez cette étape rapidement pour éviter l’exposition des tissus à la vapeur de l’azote liquide. Faibles volumes d’azote liquide permet de prévenir la contamination croisée des échantillons. - Maintenir l’aiguille dans l’azote liquide dans une boîte de Styrofoam fermée pendant 5-10 min.
- Refroidir un cryotube ouvert 4,5 mL et son couvercle dans la même boîte.
- Après 5-10 min, transférer chaque aiguille dans un cryotube distincte sous la surface de l’azote liquide et fermer le cryotube.
ATTENTION : Toujours utiliser des vêtements de protection (tels que des gants) quelle fonctionne avec de l’azote liquide comme exposition peut causer de graves engelures. - Placez le cryotube sur une canne de métal et placez-le dans le bac pour cryobank aussi vite que possible. Stocker les échantillons dans un stockage cuve dewar jusqu'à une utilisation ultérieure.
4. procédure de réchauffement
- Réchauffer séparément chaque aiguille. Toutes les solutions au réchauffement devraient être à 25 ° C.
- Détacher le cryotube de la canne métal et plongez-le dans l’azote liquide stocké dans une boîte de mousse de polystyrène.
- Ouvrez le cryotube dans la vapeur de l’azote liquide (à l’aide de la pince) et libérer l’aiguille dans l’azote liquide.
- Transférer l’aiguille très vite dans la première solution de réchauffement de la planète et incuber pendant 1 min (à 25 ° C). Assurez-vous de transférer l’aiguille rapidement afin d’éviter son réchauffement dans l’air pendant le transfert.
- Transférer l’aiguille dans la deuxième solution de réchauffement de la planète et incuber pendant 3 min (à 25 ° C).
- Transférer l’aiguille dans la troisième solution de réchauffement de la planète et incuber pendant 5 min (à 25 ° C).
- Libérer les testicules de l’aiguille en les faisant glisser vers le bas avec des pincettes incurvé. Place chaque testicule chauffé individuellement dans un puits distinct (plaque à 96 puits) rempli de 250 µL de L-15 additionné de 10 % FBS. Assurez-vous que les puits sont étiquetés selon l’échantillon. Maintenir la plaque bien sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons sont réchauffées et jusqu'à ce que la poursuite des travaux.
5. tissu Digestion
- Préparer 500 µL de la solution de dissociation pour chaque échantillon dans des tubes distincts de 2 mL. Les tubes selon le code de l’échantillon de l’étiquette. Incuber la solution préparée dissociation pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter le tissu chauffé dans la solution de digestion et coupez-le en petits morceaux par au moins 30 mouvements de petits ciseaux.
- Incuber le tissu coupé sur une plaque vibrante pendant 90 min à 25 ˚C.
- Arrêter le processus de digestion en ajoutant 400 µL de L-15 et 100 µL de BF (BF 10 % v/v). Brièvement, agiter la solution et incuber pendant 1 min à température ambiante.
- Filtrer la solution obtenue sur 50 µm filtres dans un tube de 1,5 mL. Identifier les tubes en conséquence.
- Centrifuger la solution filtrée à 200 × g pendant 10 min à 25 ˚C.
- Avec précaution, retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 20 µL de L15 additionné de 10 % FBS. Manuellement de secouer le tube jusqu'à dissolution complète de la pastille. Garder la suspension cellulaire sur la glace ou à 4 ° c jusqu'à l’utilisation ultérieure.
6. viabilité évaluation et cellule de comptage
- Mix 5 µL de suspension cellulaire et 5 µL de solution de bleu de trypan 0,4 % dans un tube PCR correctement identifié 0,2 mL. Si des volumes différents sont utilisés, s’assurer que le coefficient de dilution de 1:1 reste.
- Incuber cette suspension pendant 1 à 3 min à température ambiante (25 ° C).
- Vérifier la viabilité de chaque échantillon dans un hémocytomètre sous le microscope.
- Compter le nombre de cellules vivantes (non souillées enregistré par le bleu trypan) dans 15 domaines. Calculer le nombre total de cellules à 20 µm de la suspension cellulaire. La suspension est maintenant prête pour n’importe quelle application en aval.
Remarque : Lors de l’optimisation de la procédure pour les autres espèces avec la plus grande taille, utiliser des fragments de testicules de poids égal. Utilisez les testicules d’un individu pour les groupes expérimentaux afin d’éviter une variabilité individuelle dans les résultats. Dans le cas du poisson-zèbre, nous avons profité du fait que gauche et droite testicule doit contenir un nombre égal (ou très similaire) de cellules germinales13 (voir les résultats de représentant). Le testicule gauche a été gardé comme un contrôle alors que le testicule droit était vitrifié/réchauffé. Pourcentage de viabilité a été calculé le nombre de cellules isolées du testicule vitrifié/réchauffé par rapport au nombre de cellules isolées du testicule fraîche.
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Representative Results
En moyenne, le nombre de cellules germinales de stade précoce isolé d’un testicule unique de poisson-zèbre fraîche variait entre 40 000 et 200 000 cellules selon la taille du poisson. Lorsque digérer les testicules zebrafish frais dans toutes les 5 souches, les cellules germinales début n’étaient pas les seules cellules présentes dans les suspensions cellulaires (Figure 2). À côté du stade précoce des cellules germinales, nombreux spermatozoïdes ont été trouvés aussi bien. En revanche, il n’y a beaucoup moins de spermatozoïdes après digestion des testicules cryopréservés. Il a indiqué que les spermatozoïdes ne survivent pas à ce protocole de refroidissement ultra rapid, et qu’ils sont probables éliminé durant le processus de digestion, ce qui produit une suspension beaucoup plus propre des cellules germinales précoce.
Il n’y a aucune différence significative du nombre de cellules germinales précoce entre les testicules gauche et droit (1 ± 0,5 × 105 vs 1,1 ± 0,7 × 105) d’une seule personne témoigne de digérer les testicules frais de trois mâles de poisson-zèbre AB (ANOVA à ; F (1,4) = 0,04, p = 0,85). Dans toutes les lignes de poissons zèbres utilisés dans cette étude, le protocole actuel de refroidissement ultra rapid a donné des taux de viabilité moyenne supérieure à 50 % (tableau 1).
| Type sauvage AB | Casper | Léopard | Vasa transgéniques | Tumeur de Wilms transgénique | ||
| Nombre de cellules vivantes (× 10,4) | Testicule fraîche | 14.5 ± 3,9 | 9,5 ± 2,3 | 12,7 ± 2,4 | 14,5 ± 5.6 | 4,8 ± 1,8 |
| Testicule vitrifié | 8.7 ± 2,8 | 7.2 ± 3.0 | 8,8 ± 1,7 | 7.6 ± 3,7 | 2.4 ± 0,7 | |
| Viabilité (%) | 58 ± 9 | ± 72 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | ± 53 13 |
Table 1. Nombre de cellules vivantes et les pourcentages de viabilité (moyenne ± écart-type) de poisson-zèbre fraîche ou vitrifié/réchauffé testicule. Les résultats sont présentés pour les cinq lignes de poisson-zèbre testés : AB type sauvage, casper (roy- / -; nacre- / -), léopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] et lignée transgénique de Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].
La figure 1. Disséqués poisson-zèbre adulte montrant la position des différentes structures anatomiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Cellules des suspensions préparées à partir de tissu testiculaire zebrafish fraîches et vitrifiés/réchauffé de cinq lignes de poisson-zèbre testés (type sauvage AB, casper (roy- / -; nacre- / -), léopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] et lignée transgénique de Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)]) photographié au microscope à contraste de phase. Barre d’échelle : 40 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure refroidissement ultra rapide mis au point pour les espèces aviaires et mammifères10,11,12 pour la cryoconservation des testicules de poisson (poisson zèbre comme un modèle de organisme). La plupart des études antérieures au sujet de la cryoconservation des ressources génétiques zebrafish portaient principalement sur la cryoconservation du sperme de poisson-zèbre2,3,4. Cependant, protocoles pour la cryoconservation des ovocytes matures et des embryons n’ont pas été développés encore, même si certaines études récentes démontrent que cryopréservation d’ovocytes précoce est plausible14,15. Dans cette étude, nous avons démontré cryopreservation réussie des spermatogonies de poisson-zèbre qui offre de nouvelles possibilités pour le stockage de précieuses ressources génétiques, en particulier puisque après la transplantation, ils peuvent mûrir en gamètes mâles et femelles5 .
Au meilleur de notre connaissance, c’est la première étude portant sur le refroidissement ultra rapide des tissus de poisson-zèbre par la méthode NIV. Des études similaires inclus vitrification des testicules de poisson-zèbre 0,25 mL pailles en plastique16 et vitrification du poisson-zèbre ovaires dans des conteneurs métalliques fermés14. Le principal avantage de NIV par rapport aux deux conteneurs mentionnés est l’exposition directe des testicules à l’azote liquide avec volumes minimes des cryoprotecteurs qui est attachés à eux, donc maximiser le taux de refroidissement10. L’augmentation des taux de refroidissement réduit la concentration requise des cryoprotecteurs, réduisant ainsi leur toxicité. En outre, tous les morceaux de tissus peuvent être exposés à des cryoprotecteurs et azote liquide de façon synchrone. Toutefois, l’exposition directe à l’azote liquide peut avoir un inconvénient en ce qui concerne la contamination croisée. Il est possible que les bactéries ou les virus sont présents dans l’azote liquide et que l’exposition directe de tissus peut conduire à la contamination. Par conséquent, nous suggérons de s’abstenir de réutiliser l’azote liquide dans le cadre de NIV et de se défaire de l’azote liquide utilisé après refroidissement. Récipients métalliques offrent des avantages a proposé à cet égard14, mais ils ont été personnalisés fait et ne sont pas facilement accessibles à tous les laboratoires.
Lors de la comparaison de refroidissement ultra rapide à lent-taux de gel, un avantage crucial de refroidissement ultra rapide est l’absence de spermatozoïdes après digestion. Chez certaines espèces de cyprinidés, méthodes de congélation lente-taux a démontré que des protocoles comparables rendement comparable viabilité de cellules germinales précoce et spermatozoïdes17 résultant du nombre élevé de spermatozoïdes après digestion de le cryoconservés tissus. Nos résultats dans le poisson-zèbre (étude), carpe et le carassin (résultats non publiés) indiquent qu’il y a très peu de spermatozoïdes après digestion des tissus réchauffés et qu’ils ne pas survivre à cette procédure et obtenir digérées qui simplifie en aval applications puisqu’aucune procédure d’enrichissement supplémentaires n’est nécessaires.
Il y a plusieurs étapes critiques au sein de ce protocole. La première consiste à éviter toute contamination au cours du processus d’isolation car elle peut conduire à une diminution du nombre de cellules obtenues et peut faire obstacle à toutes les applications en aval. Une des étapes essentielles est l’excision des testicules où la contamination bactérienne peut se produire d’endommagé les tripes (c’est pourquoi il est préférable de ne pas se blesser ou de supprimer complètement les intestins) ou de la peau si vous utilisez le même outil de dissection pour couper la peau et enlever les testicules. Deuxièmement, attention en épinglant les testicules à l’aiguille d’acupuncture car il est possible que les testicules de tomber ou glissent vers le bas. Actuellement, nous testons les différentes méthodes pour empêcher les testicules de glisser au cours de la procédure de la vitrification (température de l’azote liquide). Troisièmement, faire attention à la période d’exposition à des cryoprotecteurs. Une exposition des testicules (et donc de cellules) à de fortes concentrations de substances cryoprotectrices (en particulier dans la solution de vitrification) pour trop longtemps peut entraîner la mort cellulaire en raison de la toxicité de substances cryoprotectrices. En outre, attention en plongeant les aiguilles dans l’azote liquide ; Essuyez l’excédent de VS car il peut affecter le processus de refroidissement et plonger les aiguilles rapidement afin d’éviter l’exposition à la vapeur d’azote liquide. Enfin, transférer les testicules de l’azote liquide dans les réchauffement de la planète médias rapidement afin d’éviter un réchauffement prématuré dans l’air pendant le transfert.
Dans le présent document, nous présentons la procédure pour la cryoconservation des testicules de cinq souches de poissons zèbres en utilisant MeOH, PG et moi2donc comme imprégnant cryoprotecteurs. La méthode donne des résultats fiables pour toutes les souches testées de poisson-zèbre avec une viabilité cellulaire de plus de 50 %. Il est possible d’utiliser cette méthode avec des modifications pour d’autres espèces, aussi bien. Tout d’abord, chaque protocole de cryoconservation est spécifique à l’espèce et cryoprotecteurs différents produisent des efficacités différentes chez les différentes espèces (p. ex. éthylène glycol ont donné la plus haute viabilité Acipenséridés18 tout en Me2donc a donné la plus haute viabilité en salmonidés19 et cyprinidés17). En outre, il faudrait aux concentrations utilisées aussi bien. La présente étude et l’étude menée sur la truite Salmo trutta ovaires15 montrent que les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant la même concentration de deux cryoprotectants, mais cela peut varier chez d’autres espèces. Enfin, zebrafish testicules sont très petites, et il est même possible d’épingler les testicules plusieurs sur une aiguille. Lorsque vous travaillez avec des espèces avec des testicules plus grandes, la taille des testicules pièces qui servent est un facteur très important. Nous suggérons d’augmenter le temps d’exposition pour les plus grands morceaux de tissu, tenant à l’efficacité et la toxicité de substances cryoprotectrices compte.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par la National de la recherche-développement et Innovation Office de Hongrie (subvention 116912 à ÁH), le Bureau de coût (l’alimentation et l’Agriculture coût Action FA1205 : AQUAGAMETE), le Programme de bourses Hungaricum Stipendium (subvention à ZM) et le nouveau Hungarian National Excellence pré-doctoral Fellowship (subvention EK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
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