Summary
Основной целью данного исследования было адаптировать иглы погруженным стеклования (NIV) процедура криоконсервации весь данио рерио яичек. Кроме того был испытан воспроизводимости метода в пяти различных данио рерио штаммов.
Abstract
Нынешние тенденции в науке и биотехнологии привести к созданию тысяч новых линий в модельных организмов, тем самым приводит к необходимости для новых методов для безопасного хранения генетических ресурсов за пределами общей практики ведения селекции колоний. Основной целью данного исследования было адаптировать иглы погруженным стеклования (NIV) процедура криоконсервации весь данио рерио яичек. Криоконсервация ранней стадии зародышевых клеток всего яички Нив предлагает возможности для хранения данио рерио генетических ресурсов, тем более, что после пересадки они могут перерастет как мужчин, так и женские гаметы. Яички были подакцизным, возлагали на акупунктурные иглы, достижение равновесного уровня в двух криозащитных сред (уравновешивания раствор, содержащий метанола 1,5 М и 1,5 М пропиленгликоля; и витрификации раствор, содержащий 3 M диметилсульфоксида и пропиленгликоля 3 M) и окунувшись в жидкий азот. Образцы были нагревают в серии трех последующее потепление решения. Основные преимущества этого метода являются (1) отсутствие сперматозоидов после переваривания утепленные яичек, способствуя тем самым течению манипуляций; (2) ультра-быстрое охлаждение позволяет оптимальной экспозиции тканей для жидкого азота, поэтому максимального охлаждения и снижения требуемой концентрации криопротектора, тем самым снижая их токсичности; (3) синхронное воздействие несколькими яичек криопротекторов и жидкого азота; и (4) повторяемость подтверждается получение жизнеспособности выше 50% в пяти различных данио рерио штаммов.
Introduction
Новые тенденции в науке и биотехнологии привели к созданию тысяч новых мутантов линий мыши, дрозофилы, данио рерио и других видов используется как модельные организмы в биомедицинских и других наук1. Кроме того как новые технологии разрабатываются и становятся доступными, число мутантных линий неуклонно расти2. Это приводит к необходимости для безопасного хранения генетических ресурсов за пределами общей практики ведения селекции колоний. Как метод, который позволяет безопасного хранения генетических ресурсов для неопределенного периода времени, криоконсервация предлагает множество преимуществ, таких, как расширение репродуктивных сезона, обходит необходимость непрерывного поддержания broodstock, и это больше стоимости - и энергосберегающий труда2.
Протоколы для криоконсервации спермы, разработанных в последние несколько лет2,,34 предлагают возможность для успешного хранения, мужчины данио рерио генетического материала. Однако криоконсервация яйцеклетки или эмбрионы в рыбе пока невозможно из-за их сложную структуру и большое количество материала желток. Недавно практика трансплантации первичных зародышевых клеток (PGCs) или сперматогониальные стволовые клетки (SSCs) предлагает обойти этот барьер путем разработки функциональных спермы и яйца после пересадки5. Таким образом криоконсервация SSCs предлагает новые рубежи в сохранении редких и ценных генетических ресурсов.
Хотя криоконсервирования предлагает множество преимуществ, замедлить скорость замораживания процесс генерирует несколько условий, которые могут привести к повреждение клетки2. К ним относятся формирование внутриклеточного и внеклеточного льда, обезвоживание, криопротектора токсичности и другие. Внутриклеточного льда повреждает клетки, внеклеточного льда может привести к механического дробления клеток, в то время как диффузия воды из клеток во время замедлить скорость замораживания может привести к обезвоживанию6. Недавно витрификации как технику, которая предотвращает негативные последствия формирования льда были применены в криоконсервирования рыбы гамет7,8,9. Он представляет сверхбыстрого охлаждения технику через который внутренних и внешних СМИ превращаются в аморфных/стеклообразном состоянии без crystalizing в лед7,10. В птиц и млекопитающих видов10,11,12, тем самым открывая возможности для его применения в рыб, а также свидетельствует успешное витрификации ткани яичек и яичников.
В этом исследовании мы представляем иглы погруженным стеклования (NIV) процедура криоконсервации всего данио рерио яичек. Мы демонстрируем надежный метод для изоляции данио рерио ранней стадии зародыша клетки без загрязнения и криоконсервацию процесс, который дает сравнительно высокое количество ранней стадии зародыша клетки с низким присутствием других клеток, особенно сперматозоидов. В меру наших знаний это первое исследование продемонстрировать подробный визуализированных протокол для ультра-быстрого охлаждения рыбы гонадной материи и данио рерио микрофлорой клеток. Кроме того, воспроизводимости метода демонстрируется в пяти различных данио рерио штаммов: AB дикого типа, Каспер (Рой- / -; перламутр- / -), леопард (Леоt1/t1), Васа [тг (vas::eGFP)] и трансгенные линии Вильмс опухоли [тг (wt1b::eGFP 1)].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены венгерский закон благосостояния животных.
1. Реагент подготовка
- Акций решения
- Подготовка 1 M Трегалоза, добавив 0,378 g Трегалоза дигидрат в 1 мл dH2O. Mix хорошо до тех пор, пока он растворяется полностью.
- Подготовка 1 М сахарозы, добавив 0,342 г сахарозы в 1 мл dH2O. Mix хорошо до тех пор, пока он растворяется полностью.
- Подготовка 1 М HEPES путем добавления 0,238 g HEPES 1 мл dH2O. Mix хорошо до тех пор, пока он растворяется полностью.
- Подготовьте коллагеназы 20 мг/мл (290 U/мг), добавив 100 мг в 5 мл ФСБ. Тщательно перемешивайте до тех пор, пока она растворяется. Стерильные фильтр через фильтры 0,2 мкм. Аликвота 50 мкл в 0.2 мл ПЦР пробирок и замерзает при - 20 ° C.
- Подготовка 15 мг/мл трипсина (~ 10000 U/мг), добавив 75 мг в 5 мл ФСБ. Тщательно перемешивайте до тех пор, пока она растворяется. Стерильные фильтр через фильтры 0,2 мкм. Аликвота 50 мкл в 0.2 мл ПЦР пробирок и замерзает при - 20 ° C.
- Подготовка 1 мг/мл DNase I (~ 3000 U/мг), добавив 5 мг в 5 мл ФСБ. Тщательно перемешивайте до тех пор, пока она растворяется. Стерильные фильтр через фильтры 0,2 мкм. Аликвота 50 мкл в 0.2 мл ПЦР пробирок и замерзает при - 20 ° C.
- Подготовьте 0,4% Трипановый синий, добавив 40 мг Трипановый синий 10 мл ФСБ. Стерильные фильтр через фильтры 0,2 мкм. Аликвота 1 мл в 1,5 мл пробирок.
- Подготовка 200 мг/Л MS-222 (Tricaine метан сульфонат), добавив MS-222 200 мг в 1 Л dH2O. Mix хорошо до тех пор, пока он растворяется полностью. Кроме того буферного раствора MS-222 с бикарбонатом натрия с нейтральным pH 7.0.
- Решения для витрификации
- Приготовляют раствор уравновешивания (ES): подготовка 2 мл ES путем смешивания 121,5 мкл метанола (метанола; 1,5 М), 220 мкл пропиленгликоля (PG; 1,5 М), 200 мкл FBS (10%), 200 мкл раствора Трегалоза штока (0,1 М), 50 мкл HEPES раствор (25 мм) и 1208.5 мкл L-15 в 2 мл.
- Приготовляют раствор стеклования (VS): подготовка 2 мл VS путем смешивания 439 мкл PG (3 M), 426 мкл диметилсульфоксида (мне2так; 3 M), 200 мкл FBS (10%), 200 мкл раствора Трегалоза штока (0,1 М), 50 мкл HEPES складе решение (25 мм) и 685 мкл L-15 в 2-мл пробирку.
- Решения для утепления
- Подготовить потепления решение 1 (WS1): подготовить 1,5 мл WS1 в 2-мл пробирку, смешивая 150 мкл FBS (10%), 450 мкл раствора сахарозы штока (3 М) и 900 мкл L-15.
- Подготовить потепление решения 2 (WS2): подготовить 1,5 мл WS2 в 2-мл пробирку, смешивая 150 мкл FBS (10%), 150 мкл раствора сахарозы штока (1 М) и 1200 мкл L-15.
- Приготовляют раствор потепления 3 (WS3): подготовка 1,5 мл WS2 в 2-мл пробирку путем смешивания 150 мкл FBS (10%) и 1350 мкл L-15.
- Приготовляют раствор пищеварения: для каждого образца подготовить 500 мкл раствора пищеварение, смешивая 50 мкл коллагеназы Стоковый раствор (2 мг/мл), 50 мкл Стоковый раствор трипсина (1,5 мг/мл), 10 мкл DNase I (20 мкг/мл) и 390 мкл L-15 в 2 мл трубки.
- Получение рассечение инструменты: ножницы, microscissors, пинцеты, изогнутый пинцет и иглы для акупунктуры.
2. яички коллекция
- Усыпить рыбы, поместив его в блюдо содержит 200 мг/Л MS-222 (рН = 7). Прежде чем продолжить рассечение, убедитесь, что жабры перестали двигаться, и что по крайней мере 10 минут прошло с того момента для обеспечения смерти гипоксии.
- Высушите рыбы, погладив на бумажное полотенце и положите его на спинной стороне на рассечения мат.
- Во-первых, отрежьте таза и грудные плавники для легче рассечение.
- По горизонтали резать кожу на животе рыб между грудными плавниками и вырезать кожу и основные мышцы вдоль живота до анального плавника.
- Откройте полости тела рыб и ПИН-код левой и правой стенки тела на вскрытие ковер с иглы.
Примечание: Яичек расположены выше желудочно-кишечных органов по обе стороны плавательный пузырь (рис. 1).
- Для предотвращения загрязнения, не вынимают органы желудочно-кишечного тракта, но мягко подтолкнуть их в одну сторону и удалять яички от противоположной стороны. Яички подключены к стене тело так тщательно удалить их и сократить смежные брюшины microscissors.
- Кроме того, во избежание загрязнения, во-первых, стерилизовать семенников, поместив их в этанол 70% для 2 s, а затем место их в L-15 на 96-луночных тарелку на льду.
Примечание: Если это необходимо, чистые яички из жировой ткани и крупные кровеносные сосуды точно под стереомикроскопом
3. Ультра-быстрое охлаждение яичек ткани
- Марк иглы с соответствующие этикетки в зависимости от образца типа и подготовить уравновешивания (ES) и витрификации решения (VS).
- Передать яички крупных хорошо тарелку или блюдо и pin два-три яичек (или больше в зависимости от размера иглы) на стерильные акупунктурные иглы.
- Во-первых позиции яички поверх изогнутые пинцетом. Поместите точку иглу в середине яички и осторожно потяните яички вверх с помощью пинцета.
- После прокола яички, осторожно потяните его вверх к верхней части иглы. Убедитесь, что яички отделены друг от друга и что они не падают или скольжения вниз.
- Место иглы с закрепленного яичек в 2-мл пробирку заполнены с L-15 до стеклования (при 25 ° c; время хранения не должен превышать 1 ч).
Примечание: Закрепление яички на иглы должно быть сделано быстро, чтобы предотвратить яички от высыхания.
- Передача иглой с яичек в раствор уравновешивания и инкубировать в течение 5 мин в 25˚C.
- Передача иглы в раствор стеклования и Инкубируйте 30 s на 25˚C.
- Удалите иглу из решения витрификации, быстро и аккуратно поглощают оставшийся раствор из ткани, стерильной салфеткой. Используйте осторожно, чтобы избежать яички прилипания к бумажным полотенцем или падать.
- Быстро место иглы в жидкий азот, помещены в коробки из пенопласта.
Примечание: Сделайте этот шаг быстро, чтобы избежать воздействия ткани пара жидкого азота. Использование низких объемов жидкого азота для предотвращения перекрестного загрязнения образцов. - Храните иглу в жидком азоте в закрытой пенополистирола коробки для 5-10 мин.
- Precool открыл 4,5 мл cryotube и его крышка в том же окне.
- После 5-10 мин передачи каждой иглы в отдельном cryotube под поверхностью жидкого азота и закрыть cryotube.
Предупреждение: Всегда используйте защитную одежду (например, изолированные перчатки) при работе с жидким азотом, как воздействие может привести к серьезным обморожения. - Место cryotube на метал тростник и поместите его в криобанке канистру как можно быстрее. Хранить образцы в канистры для хранения Дьюар до дальнейшего использования.
4. потепление процедуры
- Тепло в каждой иглы отдельно. Все потепления решения должны быть при 25 ° C.
- Отсоедините cryotube от металла тростника и окунуться в жидкий азот, хранящиеся в ящик из пенопласта.
- Открыть cryotube в жидком азоте пара (с помощью щипцов) и отпустите иглы в жидкий азот.
- Передача игла очень быстро в первый раствор потепления и инкубировать в течение 1 мин (при 25 ° C). Убедитесь, что для передачи иглы быстро, чтобы предотвратить его потепления в воздухе во время передачи.
- Передача иглы в втором потепления раствор и Инкубируйте 3 мин (при 25 ° C).
- Передача иглы в третьем потепления раствор и инкубировать в течение 5 мин (при 25 ° C).
- Отпустите яички от иглы, сдвинув их вниз с Изогнутый пинцет. Место каждого утепленные яички индивидуально в отдельную скважину (96-луночных Латы) заполнены с 250 мкл L-15 дополнена 10% FBS. Убедитесь, что колодцы обозначены по образцу. Храните хорошо пластины на льду до тех пор, пока все образцы утепляются и до дальнейшей работы.
5. ткани пищеварение
- Подготовка 500 мкл раствора диссоциации для каждого образца в отдельный 2 мл пробирок. Метки трубы согласно код образца. Инкубируйте подготовленные диссоциации решение для 5 мин при комнатной температуре.
- Добавить утепленные ткани в раствор пищеварение и нарезать на мелкие кусочки, по крайней мере 30 движений малых ножницами.
- Инкубируйте отрезока ткани на тряску тарелку 90 мин в 25 градусов.
- Остановить процесс пищеварения, добавив 400 мкл L-15 и 100 мкл FBS (FBS 10% v/v). Коротко встряхнуть решение и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Отфильтровать полученный раствор через 50 мкм фильтры в 1,5 мл трубку. Этикетке трубки соответственно.
- Центрифуга для отфильтрованных решение на 200 г × 10 мин на 25 градусов.
- Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 20 мкл L15 дополнена 10% FBS. Вручную встряхните трубки до полного растворения гранул. Держите суспензию клеток на льду или на 4 ° c до дальнейшего использования.
6. жизнеспособность оценки и подсчета клеток
- Смешайте 5 мкл суспензии клеток и 5 мкл раствора Трипановый синий 0,4% в соответствующей маркировкой 0.2 мл ПЦР-пробирку. Если используются разные тома, убедитесь, что коэффициент разрежения останков 1:1.
- Инкубируйте этого подвеска для 1-3 мин при комнатной температуре (25 ° C).
- Проверьте жизнеспособность каждого образца в Горяева под микроскопом.
- Подсчитать количество живых клеток (незапятнанное Трипановый синий) в 15 областях. Рассчитайте общее количество клеток в 20 мкм суспензию клеток. Подвеска теперь готов для любого приложения, ниже по течению.
Примечание: При оптимизации процедуры для других видов с размером тела, используйте яички фрагменты равный вес. Использование яички от одного лица для всех экспериментальных групп для того, чтобы избежать Индивидуальная изменчивость в результатах. В случае данио рерио, мы воспользовались тот факт, что левый и правый яички должны содержать равных (или очень похожие) количество клетки семенозачатка13 (см. Результаты представитель). Левого яичка был сохранен как элемент управления, хотя право яички стеклообразное/утепленные. Жизнеспособность процент было рассчитано количество клеток, изолированных от стеклообразное/утепленные яички, по сравнению с количество клеток, изолированных от свежих яички.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В среднем количество ранней стадии зародышевые клетки изолированы от одного свежие данио рерио яичка колебался от 40 000 до 200 000 ячеек в зависимости от размера рыбы. Когда переваривания свежие данио рерио яичек в все 5 штаммов, ранние половые клетки были не только клетки присутствуют в клеточных суспензий (рис. 2). Рядом с ранней стадии зародышевых клеток а также были найдены многочисленные сперматозоидов. С другой стороны там были гораздо меньше сперматозоидов после переваривания криоконсервированных яичек. Это свидетельствует, что сперматозоиды не выжить этой сверхбыстрого охлаждения протокол, и что они являются скорее ликвидированы во время процесса пищеварения, который дает гораздо чище подвеска ранней стадии зародышевых клеток.
Без значимых различий в количестве ранней стадии зародышевых клеток между левым и правым семенников (1 ± 0.5 × 105 против 1.1 ± 0,7 × 105) одного человека свидетельствует переваривания свежие яичек три мужчины данио рерио AB (односторонний дисперсионный анализ ; F (1,4) = 0,04, p = 0,85). Во всех линиях данио рерио, используемые в данном исследовании текущий сверхбыстрого охлаждения протокол дали средний жизнеспособности ставки выше, чем 50% (таблица 1).
| AB дикого типа | Каспер | Леопард | Васа трансгенных | Опухоль Вильмса трансгенных | ||
| Количество живых клеток (4× 10) | Свежий яичка | 14.5 ± 3,9 | 9,5 ± 2.3 | 12,7 ± 2,4 | 14.5 ± 5,6 | 4,8 ± 1,8 |
| Керамические яичка | 8.7 ± 2,8 | 7,2 ± 3.0 | 8.8 ± 1,7 | 7.6 ± 3.7 | 2.4 ± 0,7 | |
| Жизнеспособность (%) | 58 ± 9 | 72 ± 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | 53 ± 13 |
Таблица 1. Количество живых клеток и жизнеспособности проценты (средний ± SD) полученные из свежих или керамические/утепленные данио рерио яичка. Результаты представлены для пяти проверенных данио рерио линий: AB дикого типа, Каспер (Рой- / -; перламутр- / -), леопард (Леоt1/t1), Васа [тг (vas::eGFP)] и трансгенные линии Вильмс опухоли [тг (wt1b::eGFP 1)].
Рисунок 1. Расчлененный взрослых рыбок данио, демонстрируя позицию различных анатомических структур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Клетки суспензий, приготовленный из свежих и керамические/утепленные данио рерио яичка ткани из пяти проверенных данио рерио линий (AB дикого типа, Каспер (Рой- / -; перламутр- / -), леопард (Леоt1/t1), Васа [тг (vas::eGFP)] и Вильмс опухоли [тг (wt1b::eGFP 1)] трансгенные линии) образы с фазово контрастной микроскопии. Линейки: 40 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основной целью данного исследования было адаптировать иглы погруженным сверхбыстрого охлаждения процедуры, разработанные для птиц и млекопитающих видов10,11,12 – замораживание рыбы яички (у рыбок данио как модель организм). Большинство предыдущих исследований относительно криоконсервирования данио рерио генетических ресурсов были главным образом сосредоточены на криоконсервации у рыбок данио спермы2,3,4. Однако не были разработаны протоколы для криоконсервирования зрелых яйцеклеток и эмбрионов, пока, даже несмотря на то, что некоторые недавние исследования показывают, что криоконсервация яйцеклеток ранней стадии является правдоподобным14,15. В этом исследовании мы продемонстрировали успешные криоконсервирования данио рерио сперматогонии, которая предлагает новые возможности для хранения ценных генетических ресурсов, тем более, что после пересадки они могут перерастет как мужчин, так и женские гаметы5 .
Насколько нам известно это первый исследования, касающегося с ультра-быстрое охлаждение данио рерио ткани методом Нив. Подобные исследования включали витрификации данио рерио яичек в 0,25 мл пластиковые соломинки16 и витрификации данио рерио яичников в закрытых металлических контейнерах14. Основным преимуществом Нив, по сравнению с двух упомянутых контейнеров является прямого воздействия яичек в жидкий азот с минимальными объемами криопротекторов, присоединяемый к ним, поэтому максимального охлаждения скорость10. Увеличение скорости охлаждения уменьшает требуемой концентрации криопротектора, тем самым снижая их токсичности. Кроме того все кусочки ткани могут быть подвержены криопротекторов и жидкий азот синхронно. Однако прямого воздействия жидкого азота может иметь один недостаток в том, что касается загрязнения. Вполне возможно, что бактерии или вирусы присутствуют в жидком азоте и что прямые ткани воздействие может привести к загрязнению. Таким образом мы хотели бы предложить воздерживаться от повторного использования жидкого азота при проведении Нив и отбросить используется жидкий азот после охлаждения. В этой связи предлагаемые металлические контейнеры предлагают преимущества14, однако они были пользовательские сделал и не являются легко доступными для всех лабораторий.
При сравнении, ультра-быстрое охлаждение замедлить скорость замораживания, одно критическое преимущество ультра-быстрое охлаждение является отсутствие сперматозоидов после переваривания. В некоторых видов Карповые рыбы демонстрируются замедлить скорость замораживания методы, аналогичные протоколы дают сопоставимые жизнеспособности клетки семенозачатка ранней стадии и сперматозоиды17 что приводит к высоким сперматозоидов цифры после переваривания криоконсервированных ткани. Наши результаты в данио рерио (настоящее исследование), карп и Золотая рыбка (неопубликованные результаты) показывают, что существует очень мало сперматозоидов после переваривания утепленные тканей, и что они не пережить эту процедуру и получить усваивается организмом, который упрощает вниз по течению приложения, поскольку требуется без дополнительного обогащения процедур.
Есть несколько важных шагов в рамках настоящего Протокола. Первый заключается в том, чтобы предотвратить любые загрязнения во время процесса изоляции, так как это может привести к уменьшению числа клеток, полученных и может препятствовать любой нисходящие приложения. Одним из важнейших шагов является иссечение яичках, где бактериального загрязнения может произойти от повреждения кишки (поэтому лучше не травмировать или полностью удалить кишечника) или на коже, если используется один и тот же инструмент диссекции для резки кожи и удаления яички. Во-вторых заботиться, когда закрепление яичек на акупунктурные иглы, поскольку вполне возможно, что яички упасть или слайд вниз. В настоящее время мы тестируем различные методы для предотвращения яички от скольжения во время процедуры стеклования (температура жидкого азота). В-третьих Обратите внимание на период воздействия криопротекторов. Воздействие яичек (и, таким образом, клетки) до высоких криопротектора концентраций (особенно в решении стеклования) для слишком долго может привести к гибели клеток вследствие криопротектора токсичности. Кроме того заботиться, когда погружения иглы в жидкий азот; вытрите избыток VS, так как это может повлиять на процесс охлаждения и быстро окунуться иглы для избежания воздействия пара жидкого азота. И наконец семенников из жидкого азота в потепление СМИ быстро перенесите во избежание преждевременной потепления в воздухе во время передачи.
В настоящем документе мы представляем процедура криоконсервация семенников из пяти штаммов данио рерио с помощью метанола, PG и мне2так как пронизывает криопротекторов. Метод дает надежные результаты для всех протестированных данио рерио штаммы с жизнеспособность клеток из выше 50%. Можно использовать этот метод с изменениями для других видов, а также. Во-первых, каждый протокол криоконсервирования конкретные виды, и различных криопротекторов дают различные эффективности различных видов (т.е. этиленгликоля принесли высокой жизнеспособности в acipenserids18 а мне2так принесли высокой жизнеспособности в лососевых19 и карповые17). Кроме того следует уделять внимание концентрации, а также используется. Настоящее исследование и исследование, проведенное на форель Salmo trutta яичников15 продемонстрировать, что наилучшие результаты получаются с помощью такой же концентрации двух криопротекторов, однако это может варьироваться в других видов. И наконец данио рерио яичек очень малы, и это возможно даже закрепить несколько яичек на одной игле. При работе с видов с больших яичек, размер яичка кусков, которые используются является очень важным фактором. Мы предлагаем для увеличения времени экспозиции для больших частей ткани, принимая во внимание криопротектора токсичности и эффективности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано национальных исследований, разработок и инноваций управление Венгрии (Грант 116912 в ÁH), стоимость управления (продовольствие и сельское хозяйство стоимость действий FA1205: AQUAGAMETE), обладательница Хунгарикум стипендий (Грант для ZM) и новый Венгерский национальный Excellence лектор стипендий (Грант EK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
