Summary
Det vigtigste formål med denne undersøgelse var at tilpasse nålen nedsænket vitrifikation (NIV) proceduren for at cryopreserve hele zebrafisk testiklerne. Derudover blev repeterbarhed af metoden i fem forskellige zebrafisk stammer testet.
Abstract
Aktuelle tendenser i videnskab og bioteknologi føre til skabelse af tusindvis af nye linjer i modelorganismer dermed fører til nødvendigheden af nye metoder til sikker opbevaring af genetiske ressourcer ud over de fælles praksis at holde avl kolonier. Det vigtigste formål med denne undersøgelse var at tilpasse nålen nedsænket vitrifikation (NIV) proceduren for at cryopreserve hele zebrafisk testiklerne. Kryopræservering af tidlige kønsceller af hele testiklerne NIV tilbyder muligheder for opbevaring af zebrafisk genetiske ressourcer, især da efter transplantation kan de modnes til både mandlige og kvindelige gameter. Testiklerne var skåret ud, fastgjort på en akupunktur nål, ekvilibreres i to cryoprotective media (vitrifikation løsning indeholdende 3 M dimethylsulfoxid og 3 M propylenglycol og ækvilibrering løsning indeholdende 1,5 M methanol og 1,5 M propylenglycol;) og kastet ind i flydende kvælstof. Prøver var varmet i en serie af tre deraf følgende opvarmning løsninger. De vigtigste fordele ved denne teknik er (1) manglen sædceller efter fordøjelsen af varmede testiklerne således lette downstream manipulationer; (2) ultra-hurtig afkøling giver den optimale eksponering af væv til flydende kvælstof derfor maksimere køling og reducere den nødvendige koncentration af cryoprotectants, hvorved deres toksicitet; (3) synkron eksponering af flere testiklerne til cryoprotectants og flydende kvælstof; og (4) repeterbarhed demonstreret ved at opnå rentabilitet over 50% i fem forskellige zebrafisk stammer.
Introduction
Nye tendenser i videnskab og bioteknologi har ført til oprettelsen af tusindvis af nye mutant linjer med mus, Drosophila, zebrafisk og andre arter, der anvendes som modelorganismer i biomedicinske og andre videnskaber1. Desuden, som nye teknologier er udviklet og bliver tilgængelige, antallet af mutant linjer støt stige2. Dette fører til behovet for en sikker opbevaring af genetiske ressourcer ud over de fælles praksis at holde avl kolonier. Som en metode, som giver mulighed for sikker opbevaring af genetiske ressourcer på ubestemt tid, kryopræservering tilbyder mange fordele såsom udvidelse af yngleperioden, omgår behovet for løbende vedligeholdelse af gydebestande, og det er mere omkostninger - og arbejdskraft-effektiv2.
Protokoller for sperm kryopræservering udviklet i løbet af de sidste flere år2,3,4 giver mulighed for vellykket opbevaring zebrafisk male genmateriales. Dog er kryopræservering af æg eller embryoner i fisk endnu ikke muligt på grund af deres komplekse struktur og store mængder af æggeblomme materiale. For nylig, praksis af transplantation af primordiale kønsceller (PGCs) eller spermatogonial stamceller (SSCs) tilbyder en bypass til denne barriere ved at udvikle sig til funktionelle sædceller og æg efter transplantation5. Derfor tilbyder kryopræservering af SSCs en ny grænse i bevaringen af sjældne og værdifulde plantegenetiske ressourcer.
Selvom kryopræservering tilbyder mange fordele, genererer den langsomme sats indefrysning processen flere betingelser, der kan føre til celle skade2. Disse omfatter intracellulære og ekstracellulære is dannelse, dehydrering og kryoprotektant toksicitet. Intracellulære is skader cellerne, ekstracellulære is kan føre til mekanisk knusning af celler, mens vand diffusion fra celler under langsom-sats frysning kan føre til dehydrering6. For nylig, vitrifikation som en teknik, som forhindrer, at de negative virkninger af ice dannelse har været anvendt i kryopræservering af fisk mælke7,8,9. Det præsenterer en ultra-hurtig Køleteknik, hvorigennem de interne og eksterne medier dreje ind i en amorf/glasagtigt tilstand uden crystalizing til ice7,10. Vellykket forglasning af testikelkræft, og æggestokkene væv har været dokumenteret i aviær og pattedyr arter10,11,12, således at åbne muligheder for dens anvendelse i fisk, samt.
I denne undersøgelse præsenterer vi nål nedsænket vitrifikation (NIV) proceduren for kryopræservering af hele zebrafisk testiklerne. Vi demonstrere en pålidelig metode til isolering af zebrafisk debuterende kønsceller uden forurening og en kryopræservering proces, der giver relativt store mængder af tidlige kønsceller med en lav forekomst af andre celler, især sædcellerne. Til bedste af vores viden er dette den første undersøgelse at vise en detaljeret visualiseret protokol for ultra-hurtig nedkøling af fisk gonadale væv og zebrafisk kønscelleoverførsel celler. Derudover repeterbarhed af metoden er demonstreret i fem forskellige zebrafisk stammer: AB vildtype, casper (roy- / -; nacre- / -), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] og Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene linje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af den ungarske animalsk velfærd lov.
1. reagens
- Stamopløsninger
- Forbered 1 M trehalose ved at tilføje 0.378 g af trehalose dihydrat i 1 mL af dH2O. Bland godt, indtil den er opløst helt.
- Forbered 1 M saccharose ved at tilføje 0.342 g saccharose i 1 mL af dH2O. Bland godt, indtil den er opløst helt.
- Forbered 1 M HEPES ved at tilføje 0.238 g af HEPES til 1 mL af dH2O. Bland godt, indtil den er opløst helt.
- Forbered 20 mg/mL collagenase (290 U/mg) ved at tilføje 100 mg til 5 mL PBS. Blandes grundigt indtil den er opløst. Sterile filtreres gennem 0,2 µm filtre. Alikvot 50 µL til 0,2 mL PCR rør og fryse ved - 20 ° C.
- Forberede 15 mg/mL trypsin (~ 10000 U/mg) ved at tilføje 75 mg 5 mL PBS. Blandes grundigt indtil den er opløst. Sterile filtreres gennem 0,2 µm filtre. Alikvot 50 µL til 0,2 mL PCR rør og fryse ved - 20 ° C.
- Forberede 1 mg/mL DNase jeg (~ 3000 U/mg) ved at tilføje 5 mg 5 mL PBS. Blandes grundigt indtil den er opløst. Sterile filtreres gennem 0,2 µm filtre. Alikvot 50 µL til 0,2 mL PCR rør og fryse ved - 20 ° C.
- Forbered 0,4% trypan blå ved at tilføje 40 mg af trypan blå 10 ml PBS. Sterile filtreres gennem 0,2 µm filtre. Alikvot 1 mL i 1,5 mL rør.
- Forberede 200 mg/L MS-222 (Tricaine metan sulfonat) ved at tilføje 200 mg af MS-222 til 1 L med dH2O. Mix godt indtil den er opløst helt. Derudover MS-222 bufferopløsning med natriumbikarbonat til en neutral pH-værdi 7.0.
- Løsninger til forglasning
- Forberede ækvilibrering løsning (ES): forberede 2 mL ES ved at blande 121,5 µL af methanol (MeOH; 1,5 M), 220 µL af propylenglykol (PG; 1,5 M), 200 µL af FBS (10%), 200 µL af trehalose stamopløsning (0,1 M), 50 µL af HEPES stamopløsning (25 mM) og 1208.5 µL af L-15 i en 2 mL tube.
- Forberede vitrifikation løsning (VS): forberede 2 mL af VS ved at blande 439 µL af PG (3 M), 426 µL af dimethylsulfoxid (mig2så; 3 M), 200 µL af FBS (10%), 200 µL af trehalose stamopløsning (0,1 M), 50 µL af HEPES lagerfører løsning (25 mM) og 685 µL af L-15 i en 2 mL tube.
- Løsninger til opvarmning
- Forberede opvarmning løsning 1 (WS1): forberede 1,5 mL WS1 i et 2 mL rør ved at blande 150 µL af FBS (10%), 450 µL af saccharose stamopløsning (3 M) og 900 µL af L-15.
- Forberede opvarmning løsning 2 (WS2): forberede 1,5 mL WS2 i et 2 mL rør ved at blande 150 µL af FBS (10%), 150 µL af saccharose stamopløsning (1 M) og 1200 µL af L-15.
- Forberede opvarmning løsning 3 (WS3): Forbered 1,5 mL WS2 i et 2 mL rør ved at blande 150 µL FBS (10%) og 1350 µL af L-15.
- Forbereder fordøjelsen løsning: til hver prøve forberede 500 µL af opløsningen fordøjelsen ved at blande 50 µL af collagenase stamopløsning (2 mg/mL), 50 µL af trypsin stamopløsning (1,5 mg/mL), 10 µL af DNase jeg (20 µg/mL) og 390 µL af L-15 i et 2 mL tube.
- Få dissektion værktøjer: saks, microscissors, pincetter, buet pincet og Akupunktur nåle.
2. testiklerne samling
- Aflive fisken ved at placere det i en skål, der indeholder 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Før du fortsætter med dissektion, Sørg for at gællerne har stoppet i bevægelse og at mindst 10 min. er gået siden øjeblikket at sikre død af iltmangel.
- Tør fisken af klappede det på et stykke køkkenrulle og læg den på sin dorsale side på en dissekere mat.
- For det første afskåret bækken og brystfinner finnerne for lettere dissektion.
- Vandret snip huden på maven af fisk mellem brystfinner og skære huden og underliggende muskler langs bugen indtil gatfinnen.
- Åbne kroppen hulrum af fisk og fastgøre den venstre og højre kroppen væggen til dissektion måtten med nåle.
Bemærk: Testiklerne er placeret over de gastrointestinale organer på begge sider af svømme blæren (figur 1).
- For at undgå kontaminering, ikke tegne den gastrointestinale organer, men forsigtigt skubbe dem til side og fjerne testiklerne fra den modsatte side. Testiklerne er forbundet til kroppen væggen så fjerne dem omhyggeligt og skær forbinder bughinden af microscissors.
- Derudover for at undgå kontaminering, for det første sterilisere testiklerne ved at sætte dem i 70% ethanol til 2 s, og derefter sted dem i L-15 på en 96-brønd plade på is.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, ren testiklerne fra fedtvæv og store blod fartøjer netop under stereomikroskopet
3. ultra-hurtig nedkøling af testikelvævet
- Mark nåle med passende etiketter afhængigt af prøven Skriv og forberede ækvilibrering (ES) og vitrifikation løsninger (VS).
- Overføre testiklerne til en større godt plade eller parabol og pin to til tre testikler (eller mere afhængig af størrelsen på nålen) på en steril akupunktur nål.
- For det første position testis oven på buet pincet. Placer nålen i testiklerne og træk forsigtigt testiklerne opad med pincet.
- Efter punktering testiklerne, forsigtigt trække det opad mod toppen af nålen. Sørg for testiklerne er adskilt fra hinanden og at de ikke falde ned eller glide ned.
- Sted nåle med fastgjorte testiklerne i et 2 mL rør fyldt med L-15 indtil vitrifikation (på 25 ˚C; fillagring tid bør ikke overstige 1 h).
Bemærk: Pinning testiklerne på nålen skal ske hurtigt for at forhindre, at testiklerne udtørring.
- Overføre nålen med testiklerne til ækvilibrering løsning og Inkuber i 5 min. ved 25˚C.
- Overføre nålen i vitrifikation løsning og Inkuber i 30 s ved 25˚C.
- Fjern nålen fra forglasning løsning, hurtigt og forsigtigt absorbere de resterende løsning fra vævet af et sterilt stykke køkkenrulle. Forsigtig undgå testiklerne stikning til et stykke køkkenrulle eller falde ned.
- Hurtigt Placer nålen i flydende nitrogen placeret i en Styrofoam boks.
Bemærk: Gør dette trin for hurtigt at undgå eksponering af væv til flydende kvælstof dampe. Brug små mængder af flydende kvælstof til at undgå krydskontaminering af prøver. - Hold nålen i flydende kvælstof i en lukket Styrofoam boks for 5-10 min.
- Precool en åbnede 4,5 mL cryotube og dens cap i samme boks.
- Efter 5-10 min, overføre hver nål ind i en separat cryotube under overfladen af flydende kvælstof og lukke cryotube.
Forsigtig: Brug altid Beskyttelsesbeklædning (f.eks isoleret handsker) Hvornår arbejder med flydende kvælstof, som eksponering kan føre til svære forfrysninger. - Placere cryotube på en metal stok og placere den i cryobank canister så hurtigt som muligt. Opbevare prøverne i en dunk opbevaring dewar indtil videre anvendelse.
4. opvarmning Procedure
- Varm hver nål separat. Alle opvarmning løsninger bør være på 25 ° C.
- Frigør cryotube fra metal sukkerrør og styrte den i flydende nitrogen opbevares i en Styrofoam boks.
- Åbn cryotube i flydende nitrogen damp (med pincet) og frigive nålen ind i den flydende kvælstof.
- Overføre nålen meget hurtigt i den første løsning ved opvarmning og inkuberes i 1 min. (ved 25 ° C). Sørg for at overføre nål hurtigt for at forhindre dens opvarmning i luften under overførslen.
- Overføre nålen ind i den anden opvarmning løsning og Inkuber i 3 min. (ved 25 ° C).
- Overføre nålen ind i den tredje løsning ved opvarmning og Inkuber i 5 min (ved 25 ° C).
- Frigive testiklerne fra nålen ved at skubbe dem nedad med buet pincet. Sted hver varmede testis individuelt i en separat brønd (96-brønd plade) fyldt med 250 µL af L-15 suppleret med 10% FBS. Sørg for, at brøndene er mærket efter prøven. Holde godt pladen på is indtil alle prøver er varmet og indtil videre arbejde.
5. Vævscentre fordøjelsen
- Forberede hver prøve i separate 2 mL rør 500 µL af opløsningen dissociation. Label rør ifølge koden for prøven. Inkuber rede dissociation løsning for 5 min ved stuetemperatur.
- Tilføje den varmede væv oploesningen fordøjelse og skær den i små stykker af mindst 30 bevægelser lille saks.
- Inkuber cut vævet på en rystende plade i 90 min. på 25 ˚C.
- Stop fordøjelsesprocessen ved at tilføje 400 µL af L-15 og 100 µL af FBS (10% FBS v/v). Kort ryste løsningen og inkuberes i 1 min. ved stuetemperatur.
- Opnåede Opløsningen filtreres gennem 50 µm filtre i en 1,5 mL tube. Label rørene i overensstemmelse hermed.
- Der centrifugeres den filtrerede opløsning på 200 × g i 10 min. ved 25 ˚C.
- Forsigtigt fjerne supernatanten og resuspenderes i 20 µL af L15 suppleret med 10% FBS. Manuelt ryste røret indtil pelleten er helt opløst. Holde cellesuspension på is eller på 4 ˚C indtil videre brug.
6. bæredygtighed evaluering og celle optælling
- Mix 5 µL af cellesuspension og 5 µL af 0,4% trypan blå opløsning i en behørigt mærket 0,2 mL PCR rør. Hvis der bruges forskellige mængder, Sørg for, at fortyndingsforholdet ved 1:1.
- Inkuber denne suspension for 1 til 3 min. ved stuetemperatur (25 ° C).
- Kontrollere levedygtigheden af hver prøve i en hemocytometer under mikroskop.
- Tæl antallet af levende celler (unstained af trypan blå) i 15 felter. Beregn det samlede antal celler i 20 µm i cellesuspension. Suspensionen er nu klar til enhver downstream anvendelse.
Bemærk: Når du optimerer proceduren for andre arter med større kropsstørrelse, bruge testis fragmenter af lige så stor vægt. Bruge testiklerne fra et individ til alle eksperimentelle grupper for at undgå individuelle variation i resultaterne. For zebrafisk, tog vi fordel af faktum, at venstre og højre testikel bør indeholde et lig (eller meget lignende) antal kønsceller13 (Se repræsentant resultater). Den venstre testikel blev holdt som et kontrolelement, mens højre testikel var forglasset/varmet. Spireprocenten blev beregnet antal celler isoleret fra forglasset/varmet testiklerne i forhold til antallet af celler isoleret fra den friske testis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I gennemsnit antallet af nyuddannede kønsceller isoleret fra en enkelt frisk zebrafisk testis varierede mellem 40.000 og 200.000 celler afhængigt af størrelsen på fisken. Når fordøje frisk zebrafisk testiklerne i alle 5 stammer, var tidlig kønsceller ikke de eneste celler findes i celle suspensioner (figur 2). Ved siden af kønsceller debuterende fandtes talrige sædcellerne så godt. På den anden side var der langt mindre sædcellerne efter fordøjelsen af kryopræserverede testiklerne. Dette tydede at sædcellerne ikke overlever denne ultra-hurtig afkøling protokol, og at de er mest sandsynligt elimineret i løbet af fordøjelsesprocessen, hvilket giver en meget renere suspension af tidlige kønsceller.
Der ikke var nogen væsentlige forskelle i antallet af nyuddannede kønsceller mellem venstre og højre testiklerne (1 ± 0,5 × 105 vs 1.1 ± 0,7 × 105) af et enkelt individ overskudsbaserede fordøje frisk testiklerne af tre AB zebrafisk hanner (en-vejs ANOVA ; F (1,4) = 0,04, p = 0,85). I alle zebrafisk linjer, som bruges i denne undersøgelse, givet de aktuelle ultra-hurtig afkøling protokol gennemsnitlige rentabilitet priser højere end 50% (tabel 1).
| AB vildtype | Casper | Leopard | Vasa transgene | Wilms tumor transgene | ||
| Antallet af levende celler (× 104) | Frisk testis | 14,5 ± 3,9 | 9,5 ± 2.3 | 12,7 ± 2.4 | 14,5 ± 5,6 | 4,8 ± 1.8 |
| Forglasset testis | 8.7 ± 2,8 | 7.2 ± 3.0 | 8.8 ± 1,7 | 7.6 ± 3,7 | 2.4 ± 0,7 | |
| Levedygtighed (%) | 58 ± 9 | 72 ± 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | 53 ± 13 |
Bord 1. Antallet af levende celler og levedygtighed procenter (mener ± SD) fremstillet af friske eller forglasset/varmet zebrafisk testis. Resultaterne præsenteres for de fem afprøvede zebrafisk linjer: AB vildtype, casper (roy- / -; nacre- / -), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] og Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene linje.
Figur 1. Dissekeret voksen zebrafisk viser placeringen af forskellige anatomiske strukturer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Celler suspensioner tilberedt af friske og forglasset/varmet zebrafisk testikelvævet fra fem afprøvede zebrafisk linjer (AB vilde type, casper (roy- / -; nacre- / -), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] og Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene linje) afbildet med fasekonstrastmikroskopi. Skalalinjen: 40 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vigtigste formål med denne undersøgelse var at tilpasse nålen nedsænket ultra-hurtig afkøling procedure udviklet for aviær og pattedyr arter10,11,12 til kryopræservering af fisk testis (zebrafisk som model organisme). De fleste af de tidligere undersøgelser vedrørende kryopræservering af zebrafisk genetiske ressourcer var primært fokuseret på kryopræservering af zebrafisk sperm2,3,4. Dog protokoller for kryopræservering af modne oocytter og embryoner er ikke udviklet endnu, selv om nogle nyere undersøgelser viser, at kryopræservering af tidlige oocyter er plausible14,15. I denne undersøgelse vist vi vellykkede kryopræservering af zebrafisk spermatogonia, som giver helt nye muligheder for opbevaring af værdifulde plantegenetiske ressourcer, især da efter transplantation kan de modnes til både mandlige og kvindelige mælke5 .
Til bedste af vores viden er dette den første undersøgelse der beskæftiger sig med ultra-hurtig nedkøling af zebrafisk væv af metoden NIV. Lignende undersøgelser omfattede forglasning af zebrafisk testiklerne i 0,25 mL plastik sugerør16 og forglasning af zebrafisk æggestokkene i lukkede metalbeholdere14. Den største fordel af NIV i forhold til de to nævnte beholdere er den direkte eksponering af testiklerne til flydende kvælstof med minimale mængder af cryoprotectants er knyttet til dem, derfor maksimere den afkøling hastighed10. Stigningen i afkøling sats reducerer den nødvendige koncentration af cryoprotectants, hvorved deres toksicitet. Desuden, alle væv stykker kan blive udsat for cryoprotectants og flydende kvælstof synkront. Dog kan direkte eksponering til flydende nitrogen har en ulempe for krydskontaminering. Det er muligt, at bakterier eller vira er til stede i den flydende kvælstof og at direkte væv eksponering kan føre til forurening. Vi foreslår derfor, at undlade at genbruge flydende nitrogen, når der udføres NIV og kassere den brugte flydende kvælstof efter afkøling. Foreslået metalbeholdere tilbud fordele i denne henseende14, men de var brugerdefineret gjort og er ikke let tilgængelige for alle laboratorier.
Ved sammenligning af ultra-hurtig nedkøling til slow-sats frysning, er en afgørende fordel ved ultra-hurtig nedkøling mangel på sædceller efter fordøjelsen. Langsom sats frysebehandlingsmetoder demonstreret i nogle karpefisk fiskearter at lignende protokoller give sammenlignelige levedygtighed både tidlige kimceller og sædcellerne17 resulterer i høje sædcellerne numrene efter fordøjelse af de befrugtede væv. Vores resultater i zebrafisk (nuværende undersøgelse), fælles karper og guldfisk (ikke-offentliggjorte resultater) viser, at der er meget få sædceller efter fordøjelse af de varmede væv, og at de ikke overlever denne procedure og få fordøjet, hvilket forenkler nedstrøms programmer da ingen yderligere berigelse procedurer er nødvendige.
Der er flere kritiske trin inden for denne protokol. Først er at forhindre enhver forurening under isolering proces, da det kan føre til et fald i antallet af celler fremstillet og kan hindre enhver downstream applikationer. En af de afgørende skridt er excision af testiklerne hvor bakteriel forurening kan opstå fra beskadigede tarme (derfor det er bedst ikke at såre eller helt fjerne tarmene) eller fra huden hvis den samme dissektion værktøjet for at skære huden og fjerne den testiklerne. For det andet, passe når fastgørelse testiklerne til akupunktur nål, da det er muligt, at testiklerne falder ned eller glide ned. Vi tester i øjeblikket, forskellige metoder til at forhindre testiklerne i at glide under vitrifikation procedure (flydende kvælstof temperaturer). Tredje være opmærksom perioden af eksponering for cryoprotectants. Eksponering af testiklerne (og dermed celler) til høj kryoprotektant koncentrationer (især i opløsningen vitrifikation) for kan længe føre til celledød skyldes kryoprotektant toksicitet. Også passe, når kaster nåle ind i flydende kvælstof; aftørre overskydende af VS, da det kan påvirke køling processen og styrte nålene hurtigt for at undgå udsættelse for flydende nitrogen dampe. Endelig overføres testiklerne fra flydende kvælstof til opvarmning medierne hurtigt for at undgå for tidlig opvarmning i luften under overførslen.
I den nuværende papir præsenterer vi proceduren for kryopræservering af testikler fra fem zebrafisk stammer ved at bruge MeOH, PG og mig2så som gennemsyrer cryoprotectants. Metoden giver pålidelige resultater for alle testede zebrafisk stammer med en celle levedygtighed af over 50%. Det er muligt at anvende denne metode med ændringer til andre arter. For det første, hver kryopræservering protokol er artsspecifikke, og forskellige cryoprotectants giver forskellig virkningsgrader i forskellige arter (dvs. ethylenglycol givet den højeste rentabilitet i acipenserids18 mens mig2så givet det højeste rentabilitet i laksefisk19 og karpefisk17). Endvidere bør der lægges vægt på koncentrationerne anvendes samt. Den nuværende undersøgelse og undersøgelse på ørred Salmo trutta æggestokkene15 viser, at de bedste resultater opnås ved hjælp af den samme koncentration af to cryoprotectants, men dette kan variere i andre arter. Endelig zebrafisk testiklerne er meget små, og det er endda muligt at fastgøre flere testikler på en nål. Når du arbejder med arter med større testikler, er størrelsen af testikel stykker, der anvendes en meget vigtig faktor. Vi foreslår for at øge eksponering gange for større væv stykker under hensyntagen til konto kryoprotektant toksicitet og effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af den nationale forskning, udvikling og Innovation Office af Ungarn (grant 116912 til ÁH), COST-kontoret (fødevarer og landbrug COST Action FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum Scholarship program (tilskud til ZM) og nye Ungarske nationale Excellence Predoctoral Fellowship (tilskud til EK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K.
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
