Summary
本研究的主要目的是适应针浸泡玻璃化 (cryopreserve) 程序, 以使整个斑马鱼睾丸。另外, 对五种不同斑马鱼菌株的重复性进行了测试。
Abstract
目前科学和生物技术的趋势导致在模型生物体中创造数以千计的新品系, 从而导致有必要采用新的方法来安全地储存遗传资源, 使之超越饲养殖民地的共同做法。本研究的主要目的是适应针浸泡玻璃化 (cryopreserve) 程序, 以使整个斑马鱼睾丸。早期生殖细胞的全睾丸冷冻保存为斑马鱼遗传资源的贮藏提供了可能, 特别是在移植后它们可以成熟为雄性和雌性配子。睾丸被切除, 固定在针刺针上, 平衡在两个低温保护介质中 (含1.5 米甲醇和1.5 米丙烯乙二醇的平衡溶液; 含有3米二甲基亚砜和3米丙二醇的玻璃化溶液)并陷入液态氮。在一系列的三种升温溶液中, 样品得到了升温。这项技术的主要优点是 (1) 在热睾丸消化后缺乏精子, 从而促进下游操作;(2) 超快速冷却, 使组织的最佳接触液氮, 从而最大限度地冷却和减少所需的冷冻保护剂浓度, 从而减少其毒性;(3) 多睾丸同步暴露于冷冻保护剂和液氮;(4) 可重复性表现为在五种不同的斑马鱼菌株中获得50% 以上的生存能力。
Introduction
科学和生物技术方面的新趋势导致创造了数以千计的新的突变体, 如小鼠、果蝇、斑马鱼和其他物种, 它们被用作生物医学和其他科学中的模范有机体1。此外, 随着新技术的开发和使用, 变异线的数量稳步增加2。这就导致了在保持繁殖殖民地的共同做法之外, 安全储存遗传资源的必要性。冷冻保存作为一种保证遗传资源在不确定时间内安全贮存的方法, 具有延长繁殖季节的优势, 绕过了对亲鱼持续维护的需要, 成本更高, 而且劳动效率2。
在过去几年中开发的精子超低温保存协议2,3,4为斑马鱼雄性遗传物质的成功储存提供了机会。然而, 由于其结构复杂, 蛋黄物质大量存在, 鱼的卵或胚胎的超低温保存还是不可能的。最近, 移植的原始生殖细胞 (PGCs) 或精原干细胞 (干细胞) 提供了一个旁路到这个障碍通过发展成功能精子和卵子移植后的5。因此, 干细胞的超低温保存为珍稀珍贵的遗传资源的保护提供了新的前沿。
尽管超低温保存提供了许多优点, 但慢速冻结过程会产生几种可能导致细胞损伤的条件2。其中包括细胞内和胞外冰的形成、脱水、cryoprotectant 毒性等。细胞内的冰会损伤癌细胞, 细胞外的冰可能会导致机械破碎, 而在慢速冷冻过程中细胞的水扩散可能导致脱水6。最近, 玻璃化作为一种防止冰形成的负面影响的技术已被应用于鱼类配子的超低温保存7,8,9。它提供了一种超快速冷却技术, 通过它, 内部和外部介质变成非晶态/玻型状态而不 crystalizing 到冰7,10。成功的玻璃化睾丸和卵巢组织已证明在鸟类和哺乳动物物种10,11,12, 从而打开它的应用在鱼的可能性, 以及。
在本研究中, 我们提出了针浸泡玻璃化的程序, 以保存整个斑马鱼睾丸。我们展示了一种可靠的方法, 以隔离斑马鱼的早期生殖细胞没有污染和冷冻过程, 产生相对较高数量的早期生殖细胞与低存在的其他细胞, 特别是精子。根据我们的知识, 这是第一项研究, 以演示一个详细的可视化协议, 以超快速冷却鱼类性腺组织和斑马鱼生殖细胞。此外, 该方法的重复性表现在五种不同的斑马鱼菌株: AB 野生型, 精灵 (罗伊-/;珍珠层-/), 豹 (leot1/t1), [tg (输精管:: eGFP)] 和肾母细胞肿瘤 [tg (wt1b::eGFP1)] 转基因线。
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Protocol
这里描述的所有方法都已获得匈牙利动物福利法的批准。
1. 试剂制备
- 库存解决方案
- 将1米海藻糖加入0.378 克海藻糖, 放入1毫升的 dH2o 混合均匀, 直到完全溶解。
- 将1米蔗糖加入0.342 克蔗糖, 放入1毫升的 dH 中2o 混合均匀, 直至完全溶解。
- 1米 HEPES 通过添加0.238 克 HEPES 到1毫升的 dH2o 混合好, 直到它完全溶解。
- 通过增加100毫克到5毫升的 PBS, 制备20毫克/毫升胶原酶 (290 U/毫克)。彻底混合, 直到溶解。无菌过滤器通过0.2 µm 过滤器。整除50µL 到0.2 毫升 PCR 管和冷冻20摄氏度。
- 通过增加75毫克到5毫升的 PBS, 制备15毫克/毫升胰蛋白酶 (~ 10000 U/毫克)。彻底混合, 直到溶解。无菌过滤器通过0.2 µm 过滤器。整除50µL 到0.2 毫升 PCR 管和冷冻20摄氏度。
- 通过增加5毫克到5毫升的 PBS, 制备1毫克/毫升 DNase I (~ 3000 U/毫克)。彻底混合, 直到溶解。无菌过滤器通过0.2 µm 过滤器。整除50µL 到0.2 毫升 PCR 管和冷冻20摄氏度。
- 加入40毫克的台盼蓝到10毫升的 PBS, 准备0.4% 台台盼蓝。无菌过滤器通过0.2 µm 过滤器。整除1毫升成1.5 毫升管。
- 200毫克/升 MS-222 (Tricaine 甲烷磺酸), 加入200毫克的 MS-222 到1升的 dH2o 混合均匀, 直到它完全溶解。另外, 用碳酸氢钠将 MS-222 溶液缓冲到中性 pH 值为7.0。
- 玻璃化解决方案
- 准备平衡溶液: 通过混合121.5 µL 甲醇 (甲醇) 制备2毫升 ES; 1.5 米), 220 µL 丙二醇 (PG; 1.5 米), 200 µL 的血清 (10%), 200 µL 的海藻糖溶液 (0.1 米), 50 µL HEPES 库存溶液 (25 毫米) 和1208.5 µL L-15 成2 毫升管。
- 准备玻璃化溶液 (vs): 准备2毫升的 VS 通过混合439µL 的 PG (3 米), 426 µL 二甲基亚砜 (i2因此; 3 M), 200 µL 的血清 (10%), 200 µL 海藻糖溶液 (0.1 M), 50 µL HEPES 库存溶液 (25 毫米) 和685µL L-15 成2毫升管。
- 暖化解决方案
- 准备变暖溶液 1 (WS1): WS1 2 毫升管中的1.5 毫升, 混合150µL 的血清 (10%), 450 µL 蔗糖溶液 (3 米) 和900µL L-15。
- 准备变暖溶液 2 (WS2): WS2 2 毫升管中的1.5 毫升, 混合150µL 的血清 (10%), 150 µL 蔗糖溶液 (1 米) 和1200µL L-15。
- 准备变暖溶液 3 (WS3): 通过混合150µL (10%) 和1350µL L-15, 在2毫升管中制备1.5 毫升 WS2。
- 准备消化液: 为每个样品准备500µL 的消化液混合50µL 胶原酶的溶液 (2 毫克/毫升), 50 µL 胰蛋白酶溶液 (1.5 毫克/毫升), 10 µL 的 DNase I (20 µg/毫升) 和390µL L-15 在2毫升管。
- 获得解剖工具: 剪刀, microscissors, 镊子, 弯镊子, 针灸针。
2. 睾丸收集
- 弄死把鱼放进含有200毫克/升 MS-222 的盘子里 (pH = 7)。在继续解剖之前, 要确保鳃已经停止移动, 并且从那一刻起至少有10分钟通过, 以确保缺氧致死。
- 用纸巾把鱼擦干, 把它放在解剖垫上的背侧。
- 首先切除骨盆和胸鳍, 以便于解剖。
- 水平剪下的鱼腹部的皮肤在胸鳍之间, 并削减皮肤和底层肌肉沿腹部, 直到肛门鳍。
- 打开鱼的体腔, 将左、右体壁固定在带针的解剖垫上。
注: 睾丸位于游泳膀胱两侧的胃肠器官上方 (图 1)。
- 为了防止污染, 不要取出胃肠器官, 而是轻轻地把它们推到一边, 从对方的睾丸中取出。睾丸被连接到身体壁上, 所以要小心地取出它们, 用 microscissors 切开连接的腹膜。
- 此外, 为了防止污染, 首先对睾丸进行消毒, 将其放入70% 乙醇中2秒, 然后将它们放在冰上的 96 L-15 上。
注: 如有必要, 从脂肪组织和大血管中精确清除睾丸显微镜
3. 睾丸组织的超快速冷却
- 根据样品类型, 用适当的标签标记针头, 并准备平衡 (ES) 和玻璃化溶液 (VS)。
- 将睾丸转移到更大的井板或盘子上, 并将两到三个睾丸 (或更多取决于针的大小) 放在无菌针刺针上。
- 首先将睾丸放在弯镊子的顶端。把针的点放在睾丸中间, 小心地用镊子把睾丸向上拉。
- 刺穿睾丸后, 轻轻地将其向上拉向针的顶端。确保睾丸分离, 并没有脱落或下滑。
- 将针与固定的睾丸放置在2毫升的 L-15 管中, 直到玻璃化 (25 ˚C; 贮存时间不应超过1小时)。
注: 将睾丸固定在针上应迅速进行, 以防止睾丸干燥。
- 将针与睾丸转移到平衡溶液中, 在25˚C 孵育5分钟。
- 将针头转移到玻璃化溶液中, 在25˚C 孵化三十年代。
- 从玻璃化溶液中取出针头, 用无菌纸巾迅速地从组织中吸收剩余的溶液。小心, 避免睾丸粘在纸巾上或脱落。
- 快速将针头放进发泡胶盒中的液氮中。
注意: 快速做到这一步, 以避免暴露组织到液氮蒸气。使用少量的液氮来防止样品的交叉污染。 - 在封闭的发泡胶盒中, 将针放在液氮中 5-10 分钟。
- 预冷打开了4.5 毫升 cryotube 和它的帽子在同一个盒子里。
- 5-10 分钟后, 将每根针转移到液氮表面下的单独 cryotube, 并关闭 cryotube。
注意: 当接触液氮时, 经常使用防护服 (如绝缘手套), 因为暴露会导致严重冻伤。 - 将 cryotube 放在金属手杖上, 并尽可能快地将其放在精子银行罐中。将样品储存在罐中储存的杜瓦瓶中, 直到进一步使用。
4. 升温程序
- 每根针分别加热。所有变暖的解决方案应该在摄氏25摄氏度。
- 将 cryotube 从金属藤中分离出来, 并将其浸入发泡胶盒中的液氮中。
- 打开 cryotube 在液氮蒸气 (使用钳) 和释放针进入液氮。
- 将针头快速转移到第一个变暖溶液中, 孵育1分钟 (摄氏25摄氏度)。一定要迅速转移针, 以防止其在空气中的变暖在转移。
- 将针头转移到第二个变暖溶液中, 孵育3分钟 (摄氏25摄氏度)。
- 将针头转移到第三种变暖溶液中, 孵育5分钟 (摄氏25摄氏度)。
- 用弯曲的镊子向下滑动, 从针头中释放睾丸。将每个温暖的睾丸单独放置到一个单独的井 (96 井板块) 填充250µL L-15 补充10% 的血清。确保井被标记根据样品。把井板放在冰上, 直到所有样品都加热, 直到进一步工作。
5. 组织消化
- 在分离的2毫升管中为每个样品准备500µL 的离解溶液。根据样品的代码给管子贴上标签。在室温下孵育5分钟制备的离解溶液。
- 将温热的组织加入消化液中, 并将其切成小块, 至少30小剪刀的运动。
- 在25˚C 的震动板上孵育90分钟的切口组织。
- 通过添加400µL 的 L-15 和100µL 的血清 (10% 的血清 v/v) 来停止消化过程。在室温下, 简单地摇动溶液, 孵育1分钟。
- 通过50µm 过滤器将获得的溶液过滤成1.5 毫升管。相应地给管子贴上标签。
- 离心过滤溶液在200×g 10 分钟在25˚C。
- 小心取出上清液和并用重悬在20µL 的 L15 补充10% 的血清。手动摇动管, 直到颗粒完全溶解。保持细胞悬浮在冰或4˚C, 直到进一步使用。
6. 生存能力评估和细胞计数
- 将5µL 的细胞悬浮液和5µL 0.4% 台盼蓝溶液混合在适当标记的0.2 毫升 PCR 管中。如果使用不同的卷, 请确保1:1 的稀释率保持不变。
- 在室温下孵化1至3分钟的悬浮液 (25 摄氏度)。
- 检查显微镜下 hemocytometer 中每个样品的可行性。
- 在15个字段中计算活细胞数 (无瑕由台盼蓝)。计算细胞悬浮液中20µm 的细胞总数。暂停现已准备好进行任何下游应用。
注意: 当对其他体型较大的物种进行优化时, 使用同样重量的睾丸碎片。为所有实验组使用睾丸, 以避免结果中的个体变异。在斑马鱼的情况下, 我们利用的事实, 左和右睾丸应包含相同 (或非常相似) 的生殖细胞数量13 (见代表性结果)。左睾丸保持作为一个控制, 而右睾丸是玻璃化/温暖。与新鲜睾丸分离出的细胞数量相比, 计算出的细胞数量与玻璃化/暖化睾丸分离的单元数相对应。
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Representative Results
平均来说, 从一个新鲜的斑马鱼睾丸中分离出来的早期生殖细胞的数量在4万到20万个细胞之间变化, 这取决于鱼的大小。在所有5株中消化新鲜的斑马鱼睾丸时, 早期生殖细胞并不是细胞悬浮液中唯一存在的细胞 (图 2)。在早期生殖细胞旁边, 也发现了许多精子。另一方面, 在冷冻后的睾丸中, 精子的消化少得多。这表明精子在超快速冷却协议中无法存活, 而且在消化过程中最有可能被淘汰, 从而产生了更清洁的早期生殖细胞悬浮。
通过消化 1.1 AB 型斑马鱼的新鲜睾丸 (单向方差分析法) 对单个个体的左、右睾丸早期生殖细胞数量没有显著差异 (1 0.5 x 105 vs 0.7 @ 10 x 5三);F(14) = 0.04, p = 0.85)。在本研究中使用的所有斑马鱼线中, 目前超快速冷却协议产生的平均生存率高于 50% (表 1)。
| AB 野生型 | 卡斯帕 | 豹 | 转基因 | 肾母细胞肿瘤转基因 | ||
| 活单元格数 (×104) | 新鲜睾丸 | 14.5 @ 3。9 | 9.5 @ 2。3 | 12.7 @ 2。4 | 14.5 @ 5。6 | 4.8 @ 1。8 |
| 陶瓷睾丸 | 8.7 @ 2。8 | 7.2 @ 3。0 | 8.8 @ 1。7 | 7.6 @ 3。7 | 2.4 @ 0。7 | |
| 生存能力 (%) | 58 @ 9 | 72 @ 13 | 69 @ 1 | 50 @ 6 | 53 @ 13 |
表 1.从新鲜或陶化/加热斑马鱼睾丸获得的活细胞数量和生存率百分比 (平均 @ SD)。结果为五测试斑马鱼线: AB 野生类型, 精灵 (罗伊-/;珍珠层-/), 豹 (leot1/t1), [tg (输精管:: eGFP)] 和肾母细胞肿瘤 [tg (wt1b::eGFP1)] 转基因线。
图 1。解剖成年斑马鱼展示各种解剖结构的位置。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2。从五条经过测试的斑马鱼线 (AB 野生型, 精灵 (罗伊-/) 的新鲜和陶化/加热斑马鱼睾丸组织制备的细胞悬浮液;珍珠层-), 豹 (leot1/t1), [tg (输精管:: eGFP)] 和肾母细胞肿瘤 [tg (wt1b::eGFP1)] 转基因线) 成像的相对比显微镜。刻度条:40 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本研究的主要目的是适应为禽类和哺乳动物物种开发的针浸入式超快速冷却程序10,11,12冷冻鱼睾丸 (斑马鱼作为模型有机体)。以往关于斑马鱼遗传资源超低温保存的研究主要集中在斑马鱼精子的超低温保存上2,3,4。然而, 成熟卵母细胞和胚胎的冷冻保存协议尚未开发, 尽管最近的一些研究表明, 早期卵母细胞的超低温保存是可行的14,15。在这项研究中, 我们证明了斑马鱼细胞的成功冷冻保存, 这为储存宝贵的遗传资源提供了新的可能性, 特别是自从移植后, 他们可以成熟为男性和女性配子5.
根据我们的知识, 这是第一个研究在处理斑马鱼组织的超快速冷却的方法。类似的研究包括在0.25 毫升的塑料吸管中对斑马鱼睾丸进行玻璃化,16和封闭金属容器中的斑马鱼卵巢的玻璃化14。与上述两个容器相比, 冷冻保护剂的主要优势是将睾丸直接暴露于液态氮中, 并将最小体积的微带附着在它们身上, 从而使冷却速率最大化10。冷却速率的增加降低了冷冻保护剂的浓度, 从而降低了其毒性。此外, 所有的组织片都可以同时暴露在冷冻保护剂和液氮中。然而, 直接接触液态氮在交叉污染方面可能有一个缺点。细菌或病毒可能存在于液氮中, 而直接组织暴露可能导致污染。因此, 我们建议不要再使用液态氮, 在进行的时候, 并在冷却后丢弃所用的液氮。建议的金属容器在这方面提供了好处14, 但它们是定制的, 并且不容易被所有实验室使用。
超快速冷却与慢速冷冻相比, 超快速冷却的一个关键优点是消化后精子的缺失。慢速冷冻方法在一些鱼缸鱼类中表明, 类似的协议能产生可比的早期生殖细胞和精子的生存能力17导致高精子数在消化后的冷冻组织.我们的结果在斑马鱼 (目前的研究), 鲤鱼和金鱼 (未公布的结果) 表明, 有很少的精子消化后, 温暖的组织, 他们没有生存这个过程, 并得到消化简化下游应用程序, 因为不需要额外的浓缩程序。
在此协议中有几个关键步骤。第一个方法是防止隔离过程中的任何污染, 因为它可能导致获得的细胞数量减少, 并可能阻碍任何下游应用。其中一个关键步骤是切除睾丸, 其中细菌污染可能发生从受损的内脏 (因此最好不要伤害或完全清除肠道) 或从皮肤, 如果使用相同的解剖工具, 以切割皮肤和删除睾丸.其次, 在将睾丸钉在针刺针上时要小心, 因为睾丸可能脱落或滑倒。目前, 我们正在测试不同的方法, 以防止睾丸在玻璃化过程中滑动 (液氮温度)。第三, 注意暴露于冷冻保护剂的时期。暴露睾丸 (从而细胞) 高 cryoprotectant 浓度 (特别是在玻璃化溶液) 太长可能导致细胞死亡, 由于 cryoprotectant 毒性。同时, 在将针头扎进液氮时要小心;擦除过量的 VS, 因为它可能会影响冷却过程, 并迅速投入针头, 以避免接触液态氮蒸气。最后, 迅速将睾丸从液氮转移到变暖介质中, 以避免迁移过程中空气的过早升温。
本文采用甲醇、PG 和 i2等方法对五株斑马鱼的睾丸进行冷冻保存, 冷冻保护剂渗透。该方法为所有经过测试的斑马鱼菌株提供了可靠的结果, 其细胞存活率为50% 以上。也可以使用此方法对其他物种进行修改。首先, 每个超低温保存协议都是物种特异的, 不同的冷冻保护剂在不同的物种中产生不同的效率(即乙二醇在acipenserids 18 中取得了最高的生存能力, 而我2 因此在鲑鱼19和鲤科鱼类17 中取得了最高的生存能力。此外, 还应注意使用的浓度。本研究和对棕鳟鲑鲑卵巢15的研究表明, 最好的结果是使用相同浓度的两个冷冻保护剂, 但这可能会有所不同, 在其他物种。最后, 斑马鱼的睾丸是非常小的, 甚至有可能在一个针针几个睾丸。当与较大的睾丸的物种, 使用睾丸块的大小是一个非常重要的因素。我们建议增加更大的组织块的曝光时间考虑到 cryoprotectant 毒性和效率。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了匈牙利国家研究、发展和创新办公室 (赠款116912至ÁH)、成本办公室 (粮食和农业成本行动 FA1205: AQUAGAMETE)、Stipendium Hungaricum 奖学金方案 (赠款给各部) 和新匈牙利国家优秀 Predoctoral 奖学金 (授予克朗)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
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