Summary
Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit der Methode in fünf verschiedenen Zebrafisch-Sorten getestet.
Abstract
Aktuelle Trends in Wissenschaft und Biotechnologie führen zur Schaffung von Tausenden von Neubaustrecken in Modellorganismen, wodurch die Notwendigkeit für neue Methoden zur sicheren Aufbewahrung von genetischen Ressourcen über die gemeinsame Praktiken Brutkolonien zu halten. Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Kryokonservierung von Frühphasen-Keimzellen von ganzen Hoden NIV bietet Möglichkeiten für die Lagerung von Zebrafisch genetische Ressourcen, vor allem, da sie nach der Transplantation zu männlichen und weiblichen Gameten heranreifen können. Hoden wurden herausgeschnitten, fixiert auf einer Akupunktur-Nadel, in zwei Cryoprotective Medien (Gleichgewichtherstellung Lösung mit 1,5 M Methanol und Propylen-Glykol 1,5 M; und Verglasung Lösung mit 3 M Dimethyl Sulfoxid und 3 M Propylenglykol) equilibriert, und stürzte sich in flüssigem Stickstoff. Proben wurden in einer Reihe von drei konsequente Erwärmung Lösungen erwärmt. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind (1) das Fehlen von Spermien nach der Verdauung der erwärmte Hoden und erleichtert so die nachgelagerte Manipulationen; (2) Ultra-schnelle Kühlung ermöglicht die optimale Belichtung der Gewebe zu flüssigem Stickstoff, also die Maximierung der Kühlung und reduziert die benötigte Konzentration der Kryoprotektanten, wodurch sich ihre Toxizität; (3) synchron Exposition von mehreren Hoden Kryoprotektanten und flüssigem Stickstoff; und (4) Wiederholbarkeit durch den Erhalt der Lebensfähigkeit von über 50 % in fünf verschiedenen Zebrafisch-Stämme nachgewiesen.
Introduction
Neue Trends in Wissenschaft und Biotechnologie führten zur Schaffung von Tausenden von mutierten Neuanlagen von Mäusen, Drosophila, Zebrafisch und andere Arten als Modellorganismen im Biomedizin und anderen Wissenschaften1verwendet. Darüber, wie neue Technologien entwickelt und zur Verfügung stehen, die Nummern der mutierten Linien ständig steigen2. Dies führt zu der Notwendigkeit für eine sichere Lagerung der genetischen Ressourcen über die gemeinsame Praktiken Brutkolonien zu halten. Als eine Methode, die sichere Lagerung von genetischen Ressourcen für eine unbestimmte Zeit ermöglicht, Kryokonservierung bietet viele Vorteile, wie Erweiterung der Paarungszeit, umgeht die Notwendigkeit für die kontinuierliche Wartung der Brutbeständen, und es mehr Kosten ist - und Arbeit-effiziente2.
Protokolle für die Kryokonservierung von Spermien entwickelte sich während der letzten mehrere Jahre2,3,4 bieten die Möglichkeit für erfolgreiche Speicherung von Zebrafisch männliche Erbgut. Kryokonservierung von Eizellen oder Embryonen in den Fischen ist jedoch noch nicht möglich aufgrund ihrer komplexen Struktur und große Mengen von Eigelb Material. Vor kurzem, die Praxis der Transplantation von primordialen Keimzellen (PGCs) oder spermatogonial Stammzellen (SSCs) bietet einen Bypass um diese Barriere durch die Entwicklung in funktionale Spermien und Eizellen nach Transplantation5. Kryokonservierung von SSCs bietet daher eine neue Grenze in der Erhaltung der seltenen und wertvollen genetischen Ressourcen.
Obwohl Kryokonservierung viele Vorteile bietet, erzeugt die langsame Geschwindigkeit Gefrierprozess mehrere Bedingungen, die zu Zelle Schaden2führen können. Dazu gehören intrazelluläre und extrazelluläre Eisbildung, Dehydrierung und Kryoprotektivum Toxizität. Intrazelluläre Eis schädigt die Zellen, extrazelluläre Eis führen zu mechanischen Zerkleinerung von Zellen, während die Diffusion von Wasser aus den Zellen während langsamen Rate Einfrieren zu Dehydrierung6führen kann. Vor kurzem wurde Verglasung als eine Technik, die verhindert, die negativen Auswirkungen der Eisbildung dass in der Konservierung von Fisch Gameten7,8,9angewendet. Es stellt einen ultra-schnellen Kühltechnik, durch die die internen und externen Medien in eine amorphe/Glaszustand verwandeln, ohne kristallisieren in Eis7,10. Erfolgreiche Verglasung der Hoden und Eierstöcke Gewebe hat Vogelgrippe und Säugetier Arten10,11,12, in Fisch, sowie Möglichkeiten für seine Anwendung womit belegt.
In dieser Studie stellen wir die Nadel eingetaucht Verglasung (NIV) Verfahren für die Kryokonservierung der gesamten Zebrafisch Hoden. Wir zeigen eine zuverlässige Methode für die Isolierung von Zebrafisch Frühphasen-Keimzellen ohne Verunreinigungen und eine Kryokonservierung Prozess, der relativ hohe Mengen an Frühphasen-Keimzellen mit einer geringen Präsenz von anderen Zellen, vor allem Spermien ergibt. Nach bestem Wissen und gewissen ist dies die erste Studie, die ein detailliertes visualisiertes Protokoll für ultra-schnelle Kühlung von Fisch Gonaden Gewebe und Zebrafisch Keimbahnzellen zu demonstrieren. Reproduzierbarkeit der Methode zeigt sich darüber hinaus in fünf verschiedenen Zebrafisch-Stämme: AB Wildtyp, Casper (Roy- / -; Perlmutt- / -), Leopard (Leot1/t1), Wasa [Tg (vas::eGFP)] und Wilms Tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene Linie.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den ungarischen Tierschutzgesetz genehmigt.
(1) Reagenz Vorbereitung
- Stammlösungen
- Bereiten Sie 1 M Trehalose durch Zugabe von 0,378 g Trehalose Dihydrat in 1 mL der dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.
- Bereiten Sie 1 M Saccharose durch Zugabe von 0,342 g Saccharose in 1 mL der dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.
- Bereiten Sie 1 M HEPES durch Zugabe von 0,238 g HEPES zu 1 mL von dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.
- Bereiten Sie 20 mg/mL Kollagenase (290 U/mg vor) durch Zugabe von 100 mg bis 5 mL PBS. Mischen Sie gründlich, bis es sich auflöst. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 50 µL in 0,2 mL PCR-Röhren und frieren bei - 20 ° C.
- Vorbereiten von 15 mg/mL Trypsin (~ 10000 U/mg) durch Zugabe von 75 mg auf 5 mL PBS. Mischen Sie gründlich, bis es sich auflöst. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 50 µL in 0,2 mL PCR-Röhren und frieren bei - 20 ° C.
- Bereiten Sie 1 mg/mL DNase ich (~ 3000 U/mg) durch Zugabe von 5 mg bis 5 mL PBS. Mischen Sie gründlich, bis es sich auflöst. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 50 µL in 0,2 mL PCR-Röhren und frieren bei - 20 ° C.
- Bereiten Sie 0,4 % Trypan blau 10 mL PBS 40 mg Trypan Blau hinzu. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 1 mL in 1,5 mL Röhrchen.
- Vorbereiten von 200 mg/L MS-222 (Tricaine Methan Sulfonate) durch Zugabe von 200 mg von MS-222 in 1 L dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst. Darüber hinaus die MS-222 Pufferlösung mit Natriumbicarbonat zu einem neutralen pH-Wert von 7,0.
- Lösungen für Verglasung
- Bereiten Sie Gleichgewichtherstellung Lösung (ES): bereiten Sie 2 mL ES durch Mischen 121,5 µL von Methanol (MeOH; 1,5 M), 220 µL von Propylenglykol (PG, 1,5 M), 200 µL des FBS (10 %), 200 µL Trehalose-Stammlösung (0,1 M), 50 µL der Stammlösung HEPES (25 mM) und 1208.5 µL des L-15 in ein 2 mL-Tube.
- Bereiten Vitrification Lösung (VS): 2 mL VS durch das Mischen von 439 µL PG (3 M), 426 µL Dimethyl Sulfoxid vorbereiten (mir2SO; 3 M), 200 µL des FBS (10 %), 200 µL der Stammlösung Trehalose (0,1 M), 50 µL HEPES Lager-Lösung (25 mM) und 685 µL des L-15 in eine 2 mL-Tube.
- Lösungen für die Erwärmung
- Bereiten Sie wärmende Lösung 1 (WS1): bereiten Sie 1,5 mL WS1 in einer 2 mL-Tube durch Mischen 150 µL des FBS (10 %), 450 µL der Stammlösung Saccharose (3 M) und 900 µL des L-15.
- Bereiten Sie wärmende Lösung 2 (WS2): bereiten Sie 1,5 mL WS2 in einer 2 mL-Tube durch Mischen 150 µL des FBS (10 %), 150 µL der Stammlösung Saccharose (1 M) und 1200 µL des L-15.
- Bereiten Sie wärmende Lösung 3 (WS3): bereiten Sie 1,5 mL WS2 in einer 2 mL-Tube durch Mischen 150 µL EB (10 %) und 1350 µL des L-15.
- Aufschlusslösung vorzubereiten: für jede Probe vorbereitet 500 µL der Verdauung-Lösung durch das Mischen von 50 µL der Stammlösung Kollagenase (2 mg/mL), 50 µL der Stammlösung Trypsin (1,5 mg/mL), 10 µL der DNase I (20 µg/mL) und 390 µL des L-15 in einer 2 mL tube.
- Dissektion Werkzeuge erhalten: Schere, Microscissors, Pinzetten, gebogenen Pinzette und Akupunkturnadeln.
2. Hoden Sammlung
- Die Fische einzuschläfern, indem man es in eine Schale mit 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Stellen Sie bevor Sie fortfahren mit der Dissektion sicher, dass die Kiemen haben aufgehört sich zu bewegen und, dass mindestens 10 min vergangen seit diesem Moment Tod durch Hypoxie zu gewährleisten.
- Trocknen Sie die Fische durch klopfen sie auf einem Papiertuch und legen Sie es auf der dorsalen Seite auf einen sezierenden Mat.
- Erstens die Becken- und Brust Flossen für einfacher Dissektion abgeschnitten.
- Horizontal schnippeln Sie die Haut auf dem Bauch des Fisches zwischen den Brustflossen und schneiden Sie die Haut und die darunter liegenden Muskeln entlang der Bauch bis die Afterflosse.
- Öffnen Sie die Körperhöhle des Fisches und Heften Sie den linken und rechten Körperwand auf die Dissektion Matte mit Nadeln.
Hinweis: Hoden befinden sich über den Magen-Darm-Organe auf beiden Seiten der Schwimmblase (Abbildung 1).
- Um Verunreinigungen zu vermeiden, nicht nehmen die Magen-Darm-Organe, aber sanft zur Seite schieben und Entfernen des Hodens von der gegnerischen Seite. Hoden mit der Körperwand verbunden sind so sorgfältig zu entfernen und das verbindende Peritoneum durch Microscissors geschnitten.
- Zusätzlich, um Verunreinigungen zu vermeiden, erstens sterilisieren die Hoden, indem man sie in 70 % igem Ethanol für 2 s, und legen Sie dann Sie in L-15 auf einer 96-Well-Platte auf dem Eis.
Hinweis: Wenn es notwendig ist, Blutgefäße saubere Hoden von Fettgewebe und große genau unter dem Stereomikroskop
(3) Ultra-schnelle Abkühlung des Testikular-Gewebes
- Mark Nadeln mit entsprechenden Etiketten je nach Probe geben und bereiten die Gleichgewichtherstellung (ES) und Verglasung Lösungen (VS).
- Übertragen Sie die Hoden auf eine größere well-Platte oder Schüssel und Stift zwei bis drei Hoden (oder mehr je nach Größe der Nadel) auf eine sterile Akupunkturnadel.
- Positionieren Sie zunächst den Hoden auf gebogenen Pinzette. Legen Sie die Spitze der Nadel in der Mitte der Hoden und ziehen Sie vorsichtig die Hoden nach oben mit der Pinzette.
- Ziehen Sie nach der Punktion des Hodens es vorsichtig nach oben in Richtung der Spitze der Nadel. Stellen Sie sicher die Hoden voneinander getrennt sind und dass sie nicht herunterfallen oder Abrutschen.
- Ort der Nadeln mit angehefteten Hoden in einem 2 mL Röhrchen gefüllt mit L-15 bis Verglasung (bei 25 ° c; Lagerzeit sollte nicht mehr als 1 h).
Hinweis: Fixieren die Hoden auf der Nadel sollte erfolgen schnell, um den Hoden Austrocknen verhindert wird.
- Übertragen Sie die Nadel mit Hoden in die Gleichgewichtherstellung Lösung und 5 min bei 25˚C inkubieren.
- Übertragen Sie die Nadel in die Verglasung-Lösung und inkubieren Sie für 30 s bei 25˚C.
- Entfernen Sie die Nadel aus der Vitrifikation Lösung, nehmen Sie schnell und schonend die restliche Lösung aus dem Gewebe von einem sterilen Papiertuch auf. Seien Sie vorsichtig, um den Hoden festhalten an das Papiertuch oder Herunterfallen zu vermeiden.
- Legen Sie die Nadel schnell in flüssigen Stickstoff in einer Styropor-Box gelegt.
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt schnell zu des Gewebes um die Flüssigstickstoff-Dampf zu vermeiden. Verwenden Sie geringe Mengen an flüssigem Stickstoff, um Cross-Kontamination der Proben zu vermeiden. - Halten Sie die Nadel in flüssigem Stickstoff in eine geschlossene Styropor-Box für 5-10 min.
- PreCool, eine geöffnete 4,5 mL Cryotube und seine Mütze in der gleichen Box.
- Übertragen Sie nach ca. 5-10 min jede Nadel in eine separate Cryotube unter der Oberfläche des flüssigen Stickstoffes und schließen Sie die Cryotube.
Achtung: Verwenden Sie immer Schutzkleidung (z. B. isolierte Handschuhe) beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff Exposition kann zu schweren Erfrierungen führen. - Legen Sie die Cryotube auf dem Metall Rohrstock und legen Sie sie so schnell wie möglich in der Kryobank Kanister. Speichern Sie die Proben in einem Kanister Speicher Dewar bis zur weiteren Verwendung.
4. Erwärmung Verfahren
- Jede Nadel separat zu wärmen. Alle Erwärmung Lösungen sollte bei 25 ° C.
- Lösen Sie die Cryotube aus dem Metall Rohrstock und Tauchen Sie es in flüssigen Stickstoff in einer Styropor-Box gespeichert.
- Öffnen Sie die Cryotube im flüssigen Stickstoff Dampf (mit Pinzette) und lassen Sie die Nadel in den flüssigen Stickstoff.
- Übertragen Sie die Nadel sehr schnell in die erste wärmende Lösung und inkubieren Sie für 1 min (bei 25 ° C). Achten Sie darauf, die Nadel schnell, um zu verhindern, dass die Erwärmung in der Luft während der Übertragung zu übertragen.
- Übertragen Sie die Nadel in die zweite Erwärmung Lösung und inkubieren Sie für 3 min (bei 25 ° C).
- Übertragen Sie die Nadel in die dritte wärmende Lösung und inkubieren Sie für 5 Minuten (bei 25 ° C).
- Lassen Sie die Hoden von der Nadel, indem Sie sie nach unten mit gebogenen Pinzette. Ort jeder erwärmte Hoden einzeln in einen separaten Brunnen (96-Well-Platte) mit 250 µL L-15 ergänzt mit 10 gefüllt % FBS. Stellen Sie sicher, dass der Brunnen nach der Probe beschriftet sind. Halten Sie die well-Platte auf Eis, bis alle Proben erwärmt werden und bis zum weiteren arbeiten.
(5) Gewebe Verdauung
- Bereiten Sie 500 µL der Dissoziation-Lösung für jede Probe in separaten 2-mL-Tuben. Beschriften Sie die Rohre nach dem Code der Probe. Inkubieren Sie die vorbereiteten Dissoziation Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie das erwärmte Gewebe in der Aufschlusslösung und durch mindestens 30 Bewegungen der kleinen Schere in kleine Stücke schneiden.
- Inkubieren Sie die geschnittenen Gewebe auf einem schütteln Teller für 90 min bei 25 ° c.
- Beenden Sie den Verdauungsprozess durch Zugabe von 400 µL L-15 und 100 µL der FBS (10 % FBS V/V). Kurz schütteln Sie die Lösung und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Filtern Sie die erhaltene Lösung durch 50 µm Filter in einem 1,5 mL-Tube. Beschriften Sie die Rohre entsprechend.
- Zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung bei 200 × g für 10 min bei 25 ° c.
- Nehmen Sie den Überstand vorsichtig und Aufschwemmen der Pellets in 20 µL L15 ergänzt mit 10 % FBS. Manuell schütteln Sie das Rohr, bis die Tablette vollständig aufgelöst ist. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis oder bei 4 ° c bis zur weiteren Verwendung.
6. Wirtschaftlichkeit Bewertung und Zellzählung
- Mix 5 µL Zellsuspension und 5 µL 0,4 % Trypan blau-Lösung in einem entsprechend gekennzeichneten 0,2 mL PCR-Rohr. Wenn unterschiedliche Volumina verwendet werden, stellen Sie sicher, dass das Verdünnungsverhältnis von 1:1 bleibt.
- Inkubieren Sie diese Aussetzung für 1 bis 3 min bei Raumtemperatur (25 ° C).
- Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit jeder Probe in einem Hemocytometer unter die Lupe genommen.
- Die Anzahl der lebenden Zellen (unbefleckt von Trypan blau) in 15 Feldern. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Zellsuspension 20 µm. Die Suspension ist jetzt für alle nachgelagerten Anwendungen bereit.
Hinweis: Verwenden Sie bei der Optimierung von Verfahren für andere Arten mit größeren Körpergröße Hoden Fragmente von gleichem Gewicht. Verwenden Sie Hoden von einem Individuum für alle experimentellen Gruppen um individuelle Variabilität in den Ergebnissen zu vermeiden. Im Falle der Zebrafisch, wir nutzten die Tatsache, dass links und rechts Hoden sollte eine gleiche (oder ähnliche) Anzahl von Keimzellen13 enthalten (siehe die Vertreter-Ergebnisse). Der linke Hoden wurde als Kontrolle gehalten, während der Rechte Hoden verglast/erwärmt wurde. Lebensfähigkeit Prozentsatz wurde berechnet die Anzahl der Zellen isoliert im Vergleich zu der Anzahl der Zellen isoliert von den frischen Hoden Hoden verglast/erwärmt.
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Representative Results
Im Durchschnitt der Zahl der Frühphasen-Keimzellen isoliert von einem einzigen frischen Zebrafisch Hoden variiert zwischen 40.000 und 200.000 Zellen abhängig von der Größe des Fisches. Als frische Zebrafisch Hoden in allen 5 Stämme zu verdauen, waren frühen Keimzellen nicht die einzigen Zellen in der Zellsuspensionen (Abbildung 2). Neben dem Frühstadium Keimzellen fanden sich zahlreiche Spermien sowie. Auf der anderen Seite gab es weit weniger Spermien nach der Verdauung von kryokonservierten Hoden. Darauf hingewiesen, dass Spermien dieses ultra-schnelle kühle Protokoll nicht überleben, und, dass sie am ehesten während der Verdauung, was eine viel sauberere Aussetzung der Frühphasen-Keimzellen ergibt beseitigt.
Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Frühphasen-Keimzellen zwischen linken und rechten Hoden (1 ± 0,5 × 105 Vs 1.1 ± 0,7 × 105) eines einzelnen nachgewiesen durch frische Hoden von drei AB Zebrafisch Männchen (One-Way ANOVA zu verdauen ; F (1,4) = 0,04, p = 0,85). In allen Zebrafisch-Linien in dieser Studie verwendeten ergab die aktuelle Ultra-schnelle kühle Protokoll durchschnittliche Rentabilität Preise höher als 50 % (Tabelle 1).
| AB Wildtyp | Casper | Leopard | Vasa transgenen | Wilms-Tumor transgenen | ||
| Anzahl von lebenden Zellen (10 ×4) | Frische Hoden | 14.5 ± 3,9 | 9,5 ± 2,3 | 12,7 ± 2.4 | 14.5 ± 5,6 | 4,8 ± 1,8 |
| Verglaste Hoden | 8.7 ± 2,8 | 7.2 ± 3.0 | 8.8 ± 1,7 | 7.6 ± 3,7 | 2.4 ± 0,7 | |
| Tragfähigkeit (%) | 58 ± 9 | 72 ± 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | 53 ± 13 |
Tabelle 1. Anzahl der lebenden Zellen und Lebensfähigkeit Prozentsätze (Mittelwert ± SD) frisch oder verglaste/erwärmt Zebrafisch Hoden entnommen. Ergebnisse werden für die fünf getesteten Zebrafisch-Linien: AB Wildtyp, Casper (Roy- / -; Perlmutt- / -), Leopard (Leot1/t1), Wasa [Tg (vas::eGFP)] und Wilms Tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene Linie.
Abbildung 1. Seziert Erwachsenen Zebrafisch zeigt die Position der verschiedenen anatomischen Strukturen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Zellen sperren, zubereitet aus frischen und verglaste/erwärmt Zebrafisch Hodengewebe aus fünf getesteten Zebrafisch-Linien (AB Wildtyp, Casper (Roy- / -; Perlmutt- / -), Leopard (Leot1/t1), Wasa [Tg (vas::eGFP)] und Wilms Tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene Linie) mit Phasenkontrast-Mikroskopie abgebildet. Maßstabsleiste: 40 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das Hauptziel dieser Studie war Anpassung die Nadel ultra-schnelles Kühlungs Verfahren entwickelt für Vögel und Säugetiere Arten10,11,12 , die Kryokonservierung von Fisch Hoden (Zebrafisch als Modell eingetaucht Organismus). Die meisten der bisherigen Studien zur Kryokonservierung von Zebrafisch genetischer Ressourcen konzentrierten sich in erster Linie auf Kryokonservierung von Zebrafisch Sperma2,3,4. Protokolle für die Kryokonservierung von reifen Eizellen und Embryonen wurden nicht entwickelt jedoch, obwohl einige neuen Studien, dass Kryokonservierung von Eizellen Frühstadium zeigen ist plausibel14,15. In dieser Studie haben wir erfolgreiche Kryokonservierung von Zebrafisch Spermatogonien bietet neue Möglichkeiten für die Lagerung von wertvollen genetischen Ressourcen, vor allem, da sie nach der Transplantation in männlichen und weiblichen Gameten5 Reifen können bewiesen. .
Nach bestem Wissen und gewissen ist dies die erste Studie Umgang mit der ultra-schnelle Kühlung von Zebrafisch-Gewebe durch die NIV-Methode. Ähnliche Studien inklusive Verglasung der Zebrafisch Hoden in 0,25 mL Kunststoff Strohhalme16 und Verglasung der Zebrafisch Eierstöcke in geschlossenen Metallbehälter14. Der Hauptvorteil der NIV im Vergleich zu den beiden genannten Behältern ist die direkte Exposition der Hoden zu flüssigem Stickstoff mit minimalen Mengen an Kryoprotektanten angefügt wird, also die Maximierung der abkühlenden Rate10. Die Zunahme der Abkühlgeschwindigkeit verringert die benötigte Konzentration der Kryoprotektanten, wodurch sich ihre Toxizität. Darüber hinaus können alle Gewebe Stücke Kryoprotektanten und flüssigem Stickstoff synchron ausgesetzt werden. Direkten Kontakt mit flüssigem Stickstoff haben jedoch einen Nachteil im Hinblick auf Cross-Kontamination. Es ist möglich, dass Bakterien oder Viren in flüssigem Stickstoff vorhanden sind und, dass direkte Gewebe Exposition kann zu Verunreinigungen führen. Wir empfehlen daher, zu unterlassen, Wiederverwendung von flüssigem Stickstoff, bei der Durchführung von NIV und den verwendeten flüssigen Stickstoff nach dem Abkühlen zu verwerfen. Metall-Container bieten Vorteile in diesem Zusammenhang vorgeschlagen14, jedoch waren sie benutzerdefinierte gemacht und sind nicht leicht zugänglich für alle Laboratorien.
Beim Vergleich von Ultra-schnelle Abkühlung zu verlangsamen-Rate Einfrieren ist ein entscheidender Vorteil der ultra-schnelle Abkühlung das Fehlen von Spermien nach der Verdauung. Langsam-Rate einfrierende Methoden bewiesen in einige Weißfische Fischarten, dass ähnliche Protokolle vergleichbar Lebensfähigkeit der Frühphasen-Keimzellen und Spermien17 was zu hohen Spermien Zahlen nach der Verdauung von der kryokonservierten Ausbeute Gewebe. Unsere Ergebnisse im Zebrafisch (Untersuchung), Karpfen und Goldfische (unveröffentlichte Ergebnisse) zufolge gibt es sehr wenige Spermien nach der Verdauung der erwärmten Gewebe und, dass sie nicht diese Prozedur überleben und verdaut die flussabwärts vereinfacht Anwendungen, da keine zusätzliche Bereicherung Verfahren benötigt werden.
Es gibt mehrere wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls. Die erste ist um jegliche Kontamination bei der Isolierung verhindern, da es zu einem Rückgang der Anzahl der Zellen gewonnen führen und alle nachgelagerten Anwendungen behindern kann. Einer der entscheidenden Schritte ist Exzision der Hoden wo bakterielle Kontamination Auftreten von Eingeweide beschädigt (daher ist es am besten nicht zu verletzen oder den Darm vollständig zu entfernen) oder von der Haut, wenn die gleichen Dissektion Werkzeug zum Schneiden der Haut und entfernen die Hoden. Zweitens, Vorsicht beim Hoden, die Akupunkturnadel fixieren, da es möglich ist, dass die Hoden fallen oder rutschen. Derzeit testen wir verschiedene Methoden, um verhindern, dass die Hoden gleiten während des Verfahrens der Verglasung (flüssiger Stickstoff Temperaturen). Drittens: Achten Sie auf die Dauer der Exposition gegenüber den Kryoprotektanten. Exposition der Hoden (und damit Zellen) zu hohen Kryoprotektivum (vor allem in der Verglasung-Lösung) für kann zu lange zum Zelltod durch Kryoprotektivum Toxizität führen. Auch kümmern Sie, wenn die Nadeln in flüssigem Stickstoff zu stürzen; Wischen Sie den Überschuss an VS da kann es des Kühlprozesses beeinflussen und die Nadeln schnell zu stürzen, um Kontakt mit flüssigem Stickstoff Dampf zu vermeiden. Zu guter Letzt übertragen Sie die Hoden von flüssigem Stickstoff in die wärmenden Medien schnell zur Vermeidung vorzeitiger Erwärmung in der Luft während der Übertragung.
In der vorliegenden Arbeit präsentieren wir das Verfahren der Kryokonservierung von Hoden aus fünf Zebrafisch-Stämme mit MeOH, PG und mir2SO als Kryoprotektanten durchdringt. Die Methode liefert zuverlässige Ergebnisse für alle getesteten Zebrafisch-Stämme mit einer Zellenentwicklungsfähigkeit von über 50 %. Es ist möglich, diese Methode mit Modifikationen für andere Arten sowie zu verwenden. Erstens, jedes Kryokonservierung Protokoll ist bestimmte Arten und verschiedene Kryoprotektanten ergeben unterschiedliche Wirkungsgrade bei verschiedenen Tierarten (z.B. Ethylenglykol ergab die höchste Rentabilität in Acipenserids18 während mir2SO ergab die höchste Rentabilität Salmoniden19 und Cypriniden17). Des weiteren sollten die Konzentrationen verwendet sowie Aufmerksamkeit gewidmet werden. Die vorliegende Studie und die Studie auf Bachforellen Salmo Trutta Eierstöcke15 zeigen, dass die besten Ergebnisse erzielt werden mithilfe der gleichen Konzentration von zwei Kryoprotektanten, aber dies in anderen Arten variieren. Zu guter Letzt Zebrafisch Hoden sind sehr klein, und es ist sogar möglich, mehrere Hoden auf eine Nadel pin. Beim Arbeiten mit Arten mit größeren Hoden ist die Größe der Hoden Stücke, die verwendet werden, ein sehr wichtiger Faktor. Wir empfehlen, die um Belichtungszeiten für größere Gewebe Stücke unter Konto Kryoprotektivum Toxizität und Effizienz zu erhöhen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch die nationalen Forschung, Entwicklung und Innovation Office von Ungarn (Grant 116912, ÁH), COST-Büros (Lebensmittel und Landwirtschaft COST Action FA1205: AQUAGAMETE), das Stipendium Hungaricum Stipendienprogramm (Finanzhilfe für ZM) "und" die neu Ungarische nationale Excellence Predoctoral Fellowship (Stipendium, EK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
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