Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

Published: October 6, 2017 doi: 10.3791/56121
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pathogen Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University, 2Reproductive Medical Centre of Guangdong Women and Children's Hospital

Summary

. מדווחים באמצעות מלאכותיים intronic קטן RNA ביטוי אסטרטגיית לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. הליך מפורט עבור בנייה, אריזה, ניתוח כמותי של וקטורים rAaeDV כמו גם כ נגוע זחל מתואר.

Abstract

Microinjection in vivo הוא הטכניקה העברת גנים הנפוצות ביותר לניתוח הפונקציות ג'ין יתושים בודדים. אולם, שיטה זו דורשת יותר טכנית בדרישה מבצע, כרוך פרוצדורות מסובכות, במיוחד כשמשתמשים בהם הזחלים שלהם גודל קטן, יחסית דק ושברירי לציפורן וכתוצאה תמותה גבוהה, אשר להגביל היישום שלה. לעומת זאת, וקטורים ויראלי למסירה גן פותחו כדי להתגבר על המחסומים חוץ-תאית, תאיים. המערכות הללו יש את היתרונות של טיפול קל, ג'ין גבוה התמרה חושית יעילות, תחזוקה לטווח הארוך של ביטוי גנים, את היכולת לייצר תופעות מתמשכות ויוו. יתוש densoviruses (MDVs) הם וירוסים דנ א חד גדילי ספציפי נגד יתושים, קטנים שיכולים לספק ביעילות חומצות גרעין זר לתוך תאים יתושים; עם זאת, החלפת או החדרת גנים זרים כדי ליצור וירוסים רקומביננטי בדרך כלל גורמת לאובדן יכולות אריזה ו/או שכפול, המהווה מחסום לפיתוח של וירוסים אלה כמו משלוח וקטורים.

במסמך זה, מדווחים באמצעות אסטרטגיית מלאכותי ביטוי קטן-RNA intronic לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. מתוארים הליכים מפורטים עבור בנייה, אריזה אנליזה כמותית של הווקטורים rAaeDV, זיהום זחל.

מחקר זה מדגים, בפעם הראשונה, את הכדאיות של פיתוח מפורמטת רקומביננטי MDV מיקרו RNA (miRNA) ביטוי מערכת, ובכך לספק כלי רב עוצמה לניתוח פונקציונלי של גנים יתושים ואת הקמת בסיס יישום של נגיפי paratransgenesis לפיקוח על מחלות בעקיצות יתוש. הפגנו כי אדס 1סנט לחלל הזחלים יכול להיות בקלות וביעילות נגוע על ידי החדרת הנגיף לגוף מים הזחלים רבייה אתר, כי rAaeDVs מפותחת יכול לשמש overexpress או להפיל ביטוי של גנים יעד ספציפיות של הזחלים, מתן כלי לניתוח פונקציונלי של יתוש גנים.

Introduction

בעקיצות יתוש מחלות כמו מלריה, קדחת דנגי, קדחת zika, קדחת צהובה, הן בעיות בריאות הציבור הבינלאומיים הגדולים ימשיך להביא בחשבון חלק משמעותי של מחלה זיהומית העולמי נטל1,2. חומרי הדברה קונבנציונאליים, אשר שימשו בתגובה וקטורים, הם מרכיב מרכזי של קיימא יתושים משולבת אסטרטגיה הבקרה למניעת מחלות בעקיצות יתוש. עם זאת, אסטרטגיות מעין אלו הוכיחו להיות יחסית לא יעילה או לא רצוי בשל את המשויך השפעות סביבתיות שליליות, כמו גם את האבולוציה של עמידות נגד יתושים אוכלוסיות3,4. מסיבות אלו, יש צורך דחוף שיטות אלטרנטיביות של יתוש שליטה, וכן השימוש בשיטות הטרנסגניים לייצר יתושים זכרים מעוקרים, שחרורו של יתושים פתוגן עמיד שהתעוררו כמו אסטרטגיות שליטה חדש מבטיח. לפתח אפקטיבי חדש לשלוט בשיטות, כגון גישות בטוח ויעיל עבור ויוו המסירה הגן, ניתוח מקיף של יתוש ג'ין פונקציה זו נדרשת.

Microinjection ישירה של פלסמיד ה-DNA, כפול תקועים RNA (dsRNA) או RNA קטנים מפריעות (siRNA) היא הנפוצה ביותר ויוו ג'ין משלוח השיטה יתושים. למעשה, ייצור הטרנסגניים זנים של יתושים עדיין מסתמכים על תהליך של העובר microinjection5,6,7. עם זאת, microinjection יש מספר מגבלות. ראשית, טכניקה זו הוא תובעני מבחינה טכנית, כרוך פרוצדורות מסובכות. שנית, הזרקת גורם של עלבון פיזית אל העובר, הזחלים, גלמים, מבוגר, אשר משפיע ישירות על הכדאיות של האורגניזם היעד. שלישית, קשה לשתק רימות היתוש עבור microinjection כי רוב לגור גידול מימיים והינם בעלי מאפיין נזחל התנועה. רביעית, בגודל של 1סנט-2nd לחלל הזחלים היא 10 - עד 20 פי קטן יותר מזה של 4th לחלל הזחלים בוגרים, ואת את ציפורנייך של לשעבר הם עדינים יותר. תכונות אלה מקשות לתמרן 1סנט-2nd לחלל הזחלים בהשוואה לאלו בשלבים בוגרים. משולב, גורמים אלה תורמים סיכויי הישרדות שלאחר הזרקת מופחת עבור הזחלים (כ- 5%) לעומת מבוגרים8. מערכות מבוססות ויראלי משלוח פותחו כדי להתגבר על המחסומים חוץ-תאית, תאיים הקשורים. המערכות הללו יש את היתרונות של טיפול קל, יעילות גבוהה התמרה חושית, לטווח ארוך וחזק רמות ביטוי ביכולתה לייצר תופעות מתמשכות ויוו. לכן, ג'ין מערכות אספקה ניצול רטרווירוסים, lentiviruses ו- adenoviruses היה נרחב בשימוש שורות תאים inmammalian ומינים מודל. מערכת ביטוי ויראלי Sindbis היה בשימוש בעבר כדי לנתח את פונקציית ג'ין היתוש למבוגרים; מלבד החשש אבטחה, הזרקת זאת, עדיין תהליך הכרחי עבור זיהום ויראלי9. אמנם, משלוח אוראלי למסמס את הזחלים בפתרון dsRNA דווחה בעבר שיטת משלוח ריאלי, זה מתאים ניתוח פונקציה RNA קטנים10. אז, יש עדיין לפתח שיטות משלוח ויראלי יעיל ליתושים.

יתוש densoviruses (MDVs) הם חלק תת משפחה Densovirinae Parvoviridae, ונפילתה, כולם בתוך הסוג של Brevidensovirus11. MDV virions שאינו אפוף הינם מורכבים של גנום חד גדילי הדנ א (ssDNA), של capsid icosahedral (20 ננומטר בקוטר). הגנום הנגיפי משוכפל בתוך הגרעינים של התאים המארחים והיא בגודל של-4 kb. MDVs יציבים יחסית בסביבת ולהציג מגוון מארח צר עם ירידה לפרטים גבוה ליתושים. וירוסים אלה יש פוטנציאל התפשטה, מתעקש באופן טבעי אוכלוסיות יתוש, יכול לפלוש כמעט כל איברים ורקמות של חרקים אלה, לרבות פיתול, Malpighian בקוריאנית, שומן הגוף, מערכת השרירים, נוירונים, בלוטות הרוק12.

הגנום MDV שלם יכול להיות subcloned לתוך פלסמיד וקטורים לייצר שיבוטים זיהומיות המבוסס על פלסמיד; כאשר שיבוטים אלה מועברים לתאים יתושים, הגנום הנגיפי מופק מן הווקטור פלסמיד, נגיפים זיהומיות מיוצרים. מכיוון MDV יש גנום קטן ssDNA, שיבוטים זיהומיות נבנות בקלות וניתן הגנום הנגיפי בקלות בעורמה11,13. מאפיינים אלה להפוך MDV סוכן יקר לבחינת ביולוגיה נגד יתושים. עם זאת, כי כמעט את כל רצף הגנום הנגיפי חיונית עבור הפצה ויראלית, היצירה של וירוס רקומביננטי באמצעות החלפת או החדרת גנים זרים גורמת הפסד יכולות אריזה ו/או שכפול ויראלי, אשר יוצר מכשול להתפתחות של MDVs כמו ג'ין משלוח וקטורים. במסמך זה, אנחנו מדווחים באמצעות אסטרטגיית מלאכותי ביטוי קטן-RNA intronic לפתח מפורמטת rAaeDV ויוו RNA משלוח מערכת בעלת היתרונות של בנייה קלה פלסמיד ותחזוקה של וירוס פונקציונלי יכול לייצר ביטוי ארוכות טווח ויציבה בתאי המארח ללא צורך פראי-סוג וירוס. בנוסף, שיטה זו מאפשרת התמרה חושית קל של הזחלים.

הפרוטוקולים עבור השלבים הבאים מתוארים במחקר זה: שורה 1) העיצוב של rAaeDVs קידוד של קלטת ביטוי קטן-RNA intronic, 2) לייצור חלקיקי וירוס רקומביננטי שימוש בתא C6/36 אריזה, 3) ניתוח כמותי של התא-חופשית הגנום rAaeDV להעתיק מספרים ו- 4) זיהום של Ae. albopictus הזחלים על ידי ישיר החדרת וירוס לתוך הגוף מים של הגידול הזחל. בסך הכל, עבודה זו הוכיחה כי RNAs קטן מסוים או גנים היעד שניתן overexpressed או הפיל ב הזחלים יתושים באמצעות מערכת מפותחת של משלוח MDV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים אושרו על-ידי אתי הוועדה של דרום רפואי האוניברסיטה.

1. עיצוב אינטרון מלאכותי של

הערה: אינטרון מלאכותי המשמש בעבודה זו הוא 65 bp ב אורך, ואודות הרצף הוא 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.

  1. מקום Hpa אני הגבלה באתר בשני קצוות אינטרון מלאכותי אז זה Hpa אני העיכול יכול לשחרר את אינטרון של פלסמידים (ראה איור 1 א').
  2. מקום השני Xba אני הגבלת אתרי אינטרון אז זה Xba אני העיכול יכול לשמש כדי להוסיף ביטוי קטן-RNA רצפים.
  3. להזמין סינתזה כימית של רצפי DNA באורך מלא של אינטרון מלאכותי יצרן ה-DNA. סינתטיים DNA שנוצר הוא שיבוט לתוך פלסמיד pUC19 סטנדרטי.
    הערה: מרכיבים חיוניים של אינטרון מלאכותית כוללים מספר רכיבי נוקלאוטיד קונצנזוס, כולל 5 ' אחוי התורם (DS) עם הרצף GUAAGAGU, רצף בנקודת הסתעפות שנשמרת (BPS) עם הרצף UACUAAC, פולי-פירימידין בדרכי (PPT) עם רצף ה-UCUUC(U) 10, ו- 3 '-אתר splice מקבל (AS) עם הרצף GAUAUCCUGCAG ( איור 1 א'). שני Xba אני באתרים מגבלת הוצגו בין DS BPS שיכול לשמש להוספת רצפי ביטוי קטן-RNA. היכולת לבצע ביעילות אחוי הזה אינטרון מלאכותי מתאי מידע יונקים וכילה נגד יתושים כבר קודם לכן אישר 14.

2. עיצוב מלאכותית Intronic קטן RNA ביטוי קלטת

הערה: ביטוי או נוקאאוט של miRNA אנדוגני, רצפים קידוד miRNA קודמן או ספוגית miRNA הוכנסו בין DS BPS. כדי לשמש דוגמה, miRNA קודמן אנדוגני של Ae. albopictus aal-תן-7 נבחר לבנות רקומביננטי וקטורים ויראלי ביטוי miRNA, נוקאאוט. ספוג אנטי-let-7 תוכנן על פי השיטות שתוארו 15. כדי להפיל את היעד גנים הזחלים, עיצבנו ספציפי miRNA מלאכותית (amiRNA) או סיכת ראש קצר רצפי RNA (shRNA) באמצעות תוכנה באינטרנט 16 , 17; כדי לשמש דוגמה, V-ATPase יחידת משנה של mRNA (ההצטרפות לא. AY864912) נבחר גן המטרה במחקר זה. AmiRNA יכונו כפי amiVTP להלן. כל הפרטים רצפים של טרום-miRNA, ספוג, amiRNA shRNA מתוארים משלימה טבלה 1-

  1. להזמין את הסינתזה של רצפי cDNA באורך מלא של קודמן miRNAs, ספוגים miRNA, shRNA עם Xba אני הגבלת אתרים בשני הקצוות מיצרן דנ א.
  2. לאחר קבלת ה-DNA מסודרות, ספין הצינורות המכילה DNA רחובות ב- 10,000-14,000 x g עבור 1 דקות להבטיח כי מיובש הדנ א הוא בתחתית השפופרת.
  3. Resuspend ה-DNA מיובשים במים נטולי DNase להשגת ריכוז סופי של 10 ng/µL.
  4. לעכל את עמוד השדרה של פלסמיד ו DNA וחלבונים בעלי Xba אני ב 37 ° C עבור 1 h ולאחר מכן dephosphorylate 5 ' הקצוות של עמוד השדרה פלסמיד ליניארית עם עגל מעיים אלקליין פוספטאז (CIAP) על פי היצרן ' פרוטוקול s .
  5. בטל CIAP על ידי חימום עבור 60 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס
  6. לרוץ ג'ל agarose 1.0% וחותכים את עמוד השדרה ליניארית. ואז לחלץ את ה-DNA של הפרוסה ג'ל באמצעות ערכת חילוץ ג'ל בעקבות היצרן ' הוראות s.
  7. Ligate מקטע DNA לתוך ליגאז T4 DNA backboneby (U 5/µL) ב 22 ° C עבור ה 1
  8. להפוך את המוצרים של התגובה מצדו של תאים הצעד 2.7 המוסמכת Escherichia coli (e. coli) וצלחת על צלחת אגר Lysogeny מרק (LB) המכיל אמפיצילין (על ריכוז של µg 100/mL). זן
    1. לבצע השינוי דרך שיטת הלם חום 18, שימוש המתאים e. coli. לדוגמה, השתמש e. coli זן DH5α לשינוי הלם חום.
  9. פיק מושבה בודדת של צעד 2.8, דגירה בתרבות של 3 מ ל מועשרים בינוני המכיל אמפיצילין (על ריכוז של µg 100/mL).
  10. לחלץ את פלסמיד ה-DNA של התרבות חיידקי באמצעות ערכת הכנה מיני בעקבות היצרן ' s הוראות. לשלוח את הדגימה חברה רצפי דנ א.
    הערה: עבור ביטוי או נוקאאוט של miRNA אנדוגני, הרצפים קידוד miRNA קודמן או ספוגית miRNA הוכנסו בין השניים Xba אני אתרים. כל המבנים ביטוי או ספוג miRNA צריך להיות קצר יותר 400 bp (10% של אורך גנום ויראלי) עקב המגבלה אריזה של וירוס 19.

3. יצירת rAeaDV לבנות על-ידי שיבוט של miRNA או shRNA ביטוי קלטת לתוך עמוד השדרה פלסמיד

הערה: ןלמה, שיבוט זיהומיות המורכב פלסמיד ןלמה המכיל את הגנום AaeDV (3,981 nt) 19. הינכם מתבקשים באדיבות סופק על ידי פרופסור ג'ונתן קרלסון, תוארה בעבר פירוט 11. p7NS1-DsRed מבטא חלבון שאינן מבניות 1 (NS1)-חלבון פלואורסצנטי אדום (DsRed) חלבון כימרי מן האמרגן p7 כבר מתוארות בפרוטרוט במקום 14. אדם ספציפי מיר-941-1 קודמן 20 ו שלה ספוג, shRNA מקושקשות (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), היו גם subcloned לתוך AaeDV כפקד שלילי.

  1. מאתרים ומפסיקים את pre-miRNA, ספוג, shRNA או קלטת הביטוי של amiVTP לתוך Hpa אני באתר של האזור AaeDV NS1-קידוד ב עמוד השדרה פלסמיד ןלמה כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 2.4-2.7.
  2. להפוך את ה-DNA Stbl3 המוסמכת e. coli תאים, בחר שיבוט חיובי כפי שמתואר בשלב 2.8 ל 2.10.
  3. בעקבות זה, לחלץ את פלסמיד rAaeDV של תאי חיידקים באמצעות ערכת ההכנה maxi בעקבות היצרן ' הוראות s.
    הערה: תאים Stbl3 או Stbl4 e. coli צריך להיות מנוצל עבור rAaeDV שינוי ה-DNA למזער רקומבינציה ITR רצויה. הכנה מקסי אמור לשמש כדי לחלץ את פלסמיד rAaeDV להשיג כמות גדולה של ה-DNA (> 100 µg). לפני יצירת הנגיף, רצף בשלמות פלסמיד rAaeDV צריך תמיד להיות נותחו על ידי רצף הדנ א 21-

4. Transfecting C6/36 תאים עם פלסמידים rAaeDV

  1. תרבות C6/36 תאים ב מכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) 1640 בינוני המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין ב חממה 28 ° C.
  2. ביום 0, צלחת התאים 10 מבחנות תרבות של 25 ס מ 2 18-20 h לפני תרביות תאים על-ידי פיצול תאים confluent 90-95% לדילול 1:2.
    הערה: ביום 1, התאים אמורים להגיע למפגש 90-95%.
  3. ביום 1, transfect את התאים עם הסדרה של פלסמידים rAaeDV 22-
    1. לדלל 10 µg DNA ב 600 µL של RPMI-1640 בינוני צינור microcentrifuge ומערבבים בעדינות. . בינתיים, מכינים 600 µL של RPMI-1640 בינוני של 25 µL של תרביות תאים ריאגנט לפי תקנים.
    2. Incubate למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, הוסף µL 625 של תערובת 1640-תקנים ריאגנט לתערובת 1640-פלסמיד דנ א.
    3. דגירה תערובת זו למשך 20-30 דקות ב- RT. לפני תרביות תאים, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ של RPMI-1640 בינונית.
    4. לאחר RT דגירה (שלב 4.3.3), להוסיף the1640-תקנים ריאגנט דנ א פלסמיד תערובת הבקבוקון תרבות 2 25 ס מ, תקופת דגירה של 6-אייץ '-28 מעלות צלזיוס
    5. -כ 6-אייץ ' פוסט-תרביות תאים, להסיר התקשורת תרביות תאים, לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ של RPMI-1640 בינוני, ולאחר מכן להוסיף RPMI-1640 בינוני עם 10% FBS.
      הערה: rAaeDV מציגה את שיעור גבוה של זיהום (95%) albopictus Ae. הזחלים; עם זאת, בחוויה שלנו, כמעט 50% של הזחלים נגוע, הזיהום היה מוגבל לאתרי זיהום ראשי, (למשל, אנאלי ואדומות סטיגמטה והיו שלמים ותאים זיפים) ללא הפצת 23. לכן, אם יש צורך להדביק את הזחלים ברקמות מרובים, וירוס רקומביננטי פגומים ביטוי חלבון פלואורסצנטי צריך להיות שותף הנגוע כדי לאפשר את הפריט החזותי של זיהום אתרים. לדוגמה, כדי לייצר וירוס רקומביננטי פגומים לבטא DsRed, p7NS1-DsRed צריך להיות שותף transfected עם פלסמיד העוזר C6/36 תאים על-פי ההליך המתואר לעיל (היחס בין ריכוז cotransfection צריך להיות 2:1).

5. קציר rAaeDV Virions מתאי C6/36 Transfected

  1. לקצור את התאים 5 ימים לאחר תרביות תאים. מכך, להשעות הכלים על ידי טפטפת זכוכית 5 מ ל, pipetting למעלה ולמטה עם המדיום התרבות התאים. להעביר את כל המתלים תא צינורות סטרילי 15-mL-
  2. להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס או באמבט קרח יבש/אתנול למשך 30 דקות, ואז להפשיר ב 37 ° C. מערבולת עבור מינימלית 1 חוזר את הליך ההקפאה-הפשרה 3 פעמים.
  3. Centrifuge הדגימה ב-4,800 פגישות g x עבור 20 דקות ב 4 °C.Collect תגובת שיקוע וזורקים בגדר. . אז, תני את תגובת שיקוע דרך מסנן 0.22 של מזרק חד פעמיות מיקרומטר. Aliquot וחנות virion מטוהרים הסופי מניות ב-80 מעלות צלזיוס
    הערה: להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה.

6. לכימות rAaeDV

  1. להכין ה-DNA סטנדרטים. Linearize כל rAaeDV פלסמידים עם Hpa, ולטהר את המוצרים מתעכל עם ערכת חילוץ ג'ל 24.
  2. לבנות העקומה סטנדרט כמותי מוחלט ולמדוד את כייל של וירוס לפי השיטות שתוארו 25.

7. התמרה חושית יתוש

  1. ווש 100 1 סנט לחלל Ae. albopictus הזחלים שלוש פעמים באמצעות יונים מים, ולאחר מכן, להעביר את הזחלים לתוך גביע המכיל יונים 95 מ"ל מים. הוסף 5 מ של המניות rAaeDV (ריכוז סופי של 1.00 x 10 10 עותקים/mL).
  2. דגירה עבור 24 h ב- 28 ° C, לשטוף את הזחלים שלוש פעמים באמצעות מים יונים, ולאחר מכן להעביר את הזחלים בחזרה אל הגלופות. ולהאכיל בקביעות.
  3. לנטר את רמת היעד גנים ב הזחלים עם qPCR או תספיג חלבון (נציג תוצאות, מוצגות באיור דמויות 3 ו- 4).
    הערה: שיטת זיהוי האות פלורסצנטיות יכול לשמש כדי לבודד את הזחלים נגועים בצורה מדויקת יותר. לדוגמה, כדי לאתר את אותות פלואורסצנט הזחלים נגוע בווירוס רקומביננטי לבטא DsRed, הזחלים ניתן להציב בשקופית השקערורית ו שנצפו תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה כל 8 שעות עד יומיים לאחר הפגיעה. ברגע הזחלים פלורסנט מזוהים, הם להפרידם לכוסות פלסטיק בדיקה אישית כדי לאפשר השגחה מתמדת עוקבות. הזחלים עם רקמות מרובים נגוע ניתן לזהות באמצעות שיטה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אסטרטגיות לבנייה rAaeDV
וקטור rAaeDV פגומים נוצר כדי לבטא את הגן DsRed ב רימות היתוש. פלסמיד וכתוצאה מכך הכיל קלטת חלבון NS1-DsRed פיוז'ן עם החלבון סמנכ ל שנמחקו (איור 1א'). פלסמידים rAaeDV המכיל ביטוי בונה עבור miRNA, miRNA ספוג, shRNA, amiRNA עוצבו (ראה איור 1B). לדוגמה, וקטור rAaeDV נוצר כדי overexpress שלומי אלחרר-תן-7 בבית. יתושים הזחלים. פלסמיד וכתוצאה מכך הכיל של קלטת טרום-aal-תן-7 intronic ב אקסון NS1 ויראלי (איור 1B). וקטור rAaeDV המכילים קלטת ביטוי של ספוג aal-תן-7 intronic ב אקסון NS1 ויראלי נוצר כדי להפיל את שלומי אלחרר-תן-7 ביטוי רימות היתוש (איור 1B ואיור 2B). וקטור shRNA rAaeDV וקטור amiRNA rAaeDV המכילה intronic shRNA, קסטות הביטוי pre-amiRNA, בהתאמה, שימשו כדי להפיל את V-ATPase mRNA של רימות היתוש (איור 2C).

חישוב של titers rAaeDV מבוסס על עיקול רגיל זה שנוצר בניתוח רגרסיה לינארית
ציר ה-y מייצג את הערך Log10 של תקן ה-DNA ריכוז מולקולרית, ציר ה-x מציין את הערך CT. המספרים CT (ציר x) ואת Log10 (ריכוז) הערכים (ציר y) מוצגת התאמה טובה (R2 = 0.9988) ולפגוש את המשוואה y = - 0.288 x + 13.87 (איור 3). לחשב את titers rAaeDV של דגימות באמצעות המשוואה הקווית (טבלה 1). באמצעות השיטה המתוארת בפרוטוקול (שלב 6.2 , טבלה 1), את titers גבוהה של rAaeDV (4 מ"ל, > 7.65 x 1010 חלקיקים/mL) נבצרו. וירוסים רקומביננטי (VrepUCA-7 VrepUCA-שביעיות, VrepUCA-amiVTP, VrepUCA-shVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1s, VrepUCA-shct) נוצרו כתוצאה transfecting של זיהום שיבוטים המתאימים ןלמה-7 ןלמה לגיל 7, ןלמה-amiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1s, ןלמה-shct C6/36 תאים (סעיפים 3, 4 ו-5).

קביעת ביטוי miRNA ויעילות נוקאאוט של וקטורים rAaeDV
בדוגמה, 1 100סנט לחלל הזחלים טופלו עם כמויות שוות (1.00 x 1010 חלקיקים/mL) של rAaeDV המכילה את הביטוי של טרום-let-7 intronic וקטורית, הווקטור ביטוי ספוג לתת-7 intronic, על האדם הספציפי וקטור טרום-miR-941-1 ביטוי או וקטור ביטוי ספוג מיר-941-1 על-ידי הוספת הנגיף לגוף מים של הגידול הזחל. חמישה ימים לאחר ההדבקה, הביטוי של שלומי אלחרר-תן-7 נקבע ע י qPCR (איור 4, n = 3; משלימה בטבלה 2). רמות לתת-7 מוצגים כמו זאת אומרת ± SD של הביולוגיה שלושה ושכפול של הזחלים, היו באופן משמעותי עלו או ירדו על-ידי rAaeDV טרום-let-7-לבטא (overexpressed ב 2,843.31 ± 80.72%, p < 0.0001, מבחן t) ו לתת-7-ספוג-לבטא rAaeDV (downregulated 74.78 ± 1.60%, p < 0.0001, t-test), בהתאמה.

פיקוח על יעילות תמונות ציפורים V-ATPase mRNA של וקטורים rAaeDV
סכום כולל של 100 1סנט לחלל הזחלים טופלו עם כמויות שוות (1.00 x 1010 חלקיקים/mL) של rAaeDV לבטא amiRNA intronic, intronic rAaeDV לבטא shRNA, אדם ספציפי טרום-miR-941-1-לבטא rAaeDV orscramble הבעת shRNA rAaeDV על-ידי הוספת הנגיף לגוף מים של הגידול הזחל. חמישה ימים לאחר ההדבקה, הביטוי של V-ATPase mRNA נקבע ע י qPCR (איור 5, n = 3; משלימה בטבלה 2). רמת V-ATPase שיוצג זאת אומרת ± SD של הביולוגיה שלושה משכפל ב הזחלים צומצם במידה ניכרת על ידי הבעת-amiRNA rAaeDV (downregulated 43.01 ±6.37%, p = 0.0011, מבחן t) ו rAaeDV לבטא shRNA intronic (downregulated ידי 72.88 ± 5.74%, p = 0.0001, מבחן t).

Figure 1
איור 1 : ארגון סכמטי של פלסמידים רקומביננטי AaeDV. (א) היזמים נגיפי מערכת העצבים ההיקפית ו pVP להסיע את הביטוי של גנים NS1/NS2, סמנכ ל גנים, בהתאמה. ב פלסמיד p7NS1-DsRed, הגן DsRed שהיה מחובר לגבו הגן NS1. (B) ןלמה-7, ןלמה לגיל 7, ןלמה-941-1, ןלמה-941-1s, ןלמה-shct, ןלמה-shVTP ןלמה-amiVTP מכיל אינטרונים מלאכותיים, כולל את שלומי אלחרר-תן-7, שלומי אלחרר-תן-7 ספוג ספוג יש-מיר-941-1, יש-מיר-941-1, shRNA מקושקשות, V-ATPase shRNA, מלאכותיים miRNA, בהתאמה, אשר היו משובטים לתוך Hpaאני באתר של הגן NS1. אינטרון מלאכותית מוצג flanked על ידי תורם אחוי (DS), אתר מקבל (AS) ומכיל תחום בנקודת הסתעפות (BrP), בדרכי פולי-פירימידין (PPT), טרום-miRNA. MiRNA ספוג או רצף miRNA מלאכותיים מוכנס פנימה אינטרון בין 5-splice האתר BrP של. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : להן microRNA intronic מלאכותית (miRNA) ואסטרטגיה ליצירת miRNA לקלימנוס miRNAs מלאכותי. MiRNA Intronic (א) הוא שותף משועתקים בתוך הקדמה RNA שליח (pre-mRNA) של NS1, אשר להיות מונע על ידי האמרגן pNS1, ביקע מחוץ pre-mRNA על ידי שחבור. למרות exons מאתרים לטופס של RNA שליח בוגר (mRNA) סינתזה של חלבון NS1, אינטרון spliced עם pre-miRNA הוא עיבוד נוסף לתוך miRNA בוגר מאת לטעמים. (B) אסטרטגיה ליצירת המבנה אנטי-let-7 ואנטי-miR-941-1. היישור של אנטי-let-7, אנטי-miR-941-1 רצף עם שלומי אלחרר-תן-7, יש-מיר-941-1, בהתאמה. התאמה מוחלטת של האזורים זרע עם האזורים רצף וזנב anti-miRNA מוצג. ספוגים לתת-7 וגם מיר-941-1 להכיל שלוש אני חוזר antisense בונה (אותיות אדומות) ניתן לאגד aal-תן-7, יש-מיר-941-1, בהתאמה. (ג) רצפים ומבנים קודמן החזוי miRNAs מלאכותי מבוסס miRNA ו shRNA השתמשו במחקר זה. בוגרת miRNAs מלאכותי ואת shRNA מוצגים באדום, רצפי mRNA שלהם קשורות היעד בכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : עיקול רגיל עבור טיטור rAaeDV ו את מחושב להופעות אחרי יוםntrations של MDVs. (א) בזמן אמת qPCR בוצעה עם תקן ןלמה זה היה מדולל על ידי 10 פעמים את יחס הגדלה, הערך CT נמדדה על 7500 ABI כמו x. העתק מספר חושבה לפי שלב 6.2, 6.3 עם הנוסחה הבאה: להעתיק את המספר (y) =-0.288x + 10.87; R2 = 0.9988. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : ביטוי רקומביננטי בתיווך MDV aal-תן-7 ונוקאאוט ב Ae. albopictus הזחלים. (א) ניתוח של ביטוי miRNA אנדוגני הזחלים לאחר ההידבקות בווירוס רקומביננטי המכיל את הקלטת ביטוי aal-תן-7 (החלונית הימנית). (B) היעילות של אנטי-let-7 לבנות נקבע בהזחלים (לוח נכון). יש-מיר-941-1 ויש-941-1 ספוג (בקרה שלילית) overexpressed של downregulated miRNAs לתת-7 בוגרת, בהתאמה, לעומת רמות הבסיס שנצפה בקבוצת הביקורת. שפע miRNA היה מנורמל ל 5S rRNA, הנתונים מוצגים משכפל זאת אומרת ± SD של שלושה ביולוגית. T-בדיקות בוצעו ב משמעות בכמה מישורים different. הכוכביות מציינות הבדלים משמעותיים סטטיסטית בין הרימות נגוע, המקביל שטופלו מעושה (ארבעה כוכביות, p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : ניתוח של הביטוי mRNA V-ATPase לאחר ההידבקות בווירוס רקומביננטי המכילים קסטות shRNA, amiRNA. שפע mRNA היה מנורמל ל aalrpS7. קווי שגיאה לייצג סטיית התקן של הערכים−ΔΔCT 2 להבעה V-ATPase mRNA הזחלים Ae. albopictus כפי שהוערכו בזמן אמת RT-PCR (* *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: רקומביננטי MDV C T ערך נקבעים על-ידי qPCR מקביל x ערך בנוסחה, אשר נמצא בשימוש כדי לחשב y ערך. המספר עותק גנום ויראלי בכל מדגם 1 µL היה מתקבל על ידי הכוח פונקציה (10, y), אשר היה בסופו של דבר מוכפל 40, המרת הערך לריכוז וירוס וירוסים ההשעיה.

Supplemental Table 1
משלימה טבלה 1: רצפים של קודמן miRNA.

Supplemental Table 2
משלימה בטבלה 2: qPCR נתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חשוב להתגבר על שני המחסומים מפתח המגבילות בנייה rAaeDV. הראשון הוא הייצור של וירוס רקומביננטי פגומה. בעבר דווח כי MDV יכול לשמש וקטור לבטא כראוי בגודל גנים זרים, כגון עקרב חרקים ייחודיות neurotoxins20 החלבון GFP; עם זאת, משנה האסטרטגיה הבנייה, ברגע ORFs של MDV נוספו או מוחלף גנים אקסוגני, virions לא יכול ליצור באופן עצמאי אלא אם כן פלסמיד helper הוא cotransfected לספק את חסרים חלבונים ויראלי הכרחית. הנגיף הפגום אין אפשרות לעסוק שידור משני, המופיעה ויוו יתושים עם הגנום הפגום. התוצאות שלנו לאמת אסטרטגיית ביטוי intronic המציעה פרדיגמה חדשה זה יכול להתגבר על המגבלות של MDVs עם הגנום הפגום כדי לאפשר את משלוח יעיל של גנים זרים לתוך יתושים.

השניה היא מגבלת אורך התובעניים של הגנום הנגיפי רקומביננטי המוטלים על-ידי גודל capsid ויראלי. לאריזה יעילה, גודל הגנום יכול לחרוג 4,400 נוקלאוטידים (110% מאורכו של הגנום MDVs wt). Intronic miRNA ביטוי קלטת (כולל miRNA ביטוי קלטת אינטרון מלאכותי) של לא יותר מ 400 nt שיוכל להיכנס לתוך הגנום AaeDV. למרות האורך של הגנום וירוס רקומביננטי, מתאימה עדיין אריזה, מערכת משלוח זו יש מקום לשיפור. בגלל המגבלה אורך הגנום, קשה גנים אקספרס ללא ביטוי intronic פגומים אסטרטגיות.

זה חיוני כדי להבטיח כי C6/36 תאים בריאים כדי לאפשר את מוצלחת תרביות תאים, אריזה של rAaeDV. אולם, ריאגנטים ליפוזום cationic המשמש כאן של חרק מסחרי תא ריאגנטים ספציפיים תרביות תאים, לא לשפר את היעילות של תרביות תאים תא C6/36 (40-60%). לכן, הקציר וירוס רקומביננטי כייל גבוה, זה הכרחי לשמור על התאים 5 ימים לאחר תרביות תאים בהתבסס על מאפייני הגידול שתואר לעיל14. בנוסף, זיהום זחל מוצלח, זה חיוני עבור הזחלים להיות בקשר עם חלקיקי וירוס מדבק עבור 24–h 36 כדי להבטיח זיהום גבוה יחסי23.

לסיכום, האסטרטגיה ביטוי intronic המתוארים כאן הוא הראשון כדי להתגבר על המחסומים שהוטלו על ידי הדור של MDV פגומה. אסטרטגיה זו מאפשרת הייצור של מפורמטת רקומביננטי MDVs זה יכול overexpress או גנים miRNAs והמטרה downregulate יתושים. טכניקה זו מספקת כלי לניתוח פונקציונלי של יתוש הגנים ללא שימוש הזחלים מורכבים microinjection נהלים ויש לו יישומים מסחריים ברורים. מחקרים נוספים ירחיב את היישום של האסטרטגיה ביטוי שתואר לחקור יתושים ביולוגיה ו paratransgenesis עבור שליטה וירוס דנגה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

המחברים לאשר תמיכה כספית מן המחקר הלאומי מפתח תוכנית הפיתוח של סין (2016YFC1200500 אל שיאו-גואנג חן), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81672054 ו- 81371846), התכנית צוות המחקר של הטבעי קרן המדע של גואנג-דונג (2014A030312016), התכנית המדעית והטכנולוגית של גואנגג'ואו (201508020263). אנו להכיר בהכרת תודה פרופסור ג'ונתן קרלסון (קולורדו סטייט) עבור מתבקשים לספק את פלסמידים ןלמה ו- p7NS1-GFP, אנושות קריאת כתב היד הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge machine Thermo Scientific 75004260
Centrifuge System Beckman Coulter 363118
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691
E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit Omega Biotech D6904
Purified Agar OXOID LP0028A
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) Thermo Scientific EF0651
FastDigest HpaI Thermo Scientific FD1034
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µL) Thermo Scientific EL0011
TransStbl3 Chemically Competent Cell Beijing Transgen Biotech CD521-01
Ampicillin  Beijing Tiangen Biotech RT501
Proteinase K Promega MC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) Beijing Tiangen Biotech FP205

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
  2. Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
  3. Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
  4. Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
  5. Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
  6. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
  7. Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
  8. Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
  9. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
  10. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, (Online) 69 (2013).
  11. Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
  12. Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
  13. Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
  14. Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
  15. Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).
  16. BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/ (2017).
  17. GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).
  18. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
  19. Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
  20. Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
  21. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  22. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
  23. Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
  24. Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
  25. Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 128 יתוש densovirus ג'ין משלוח וקטור RNA קטנים, אדס וקטור שליטה אינטרון מלאכותי.
שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, P. W., Xu, J. B., Dong, Y. Q.,… More

Liu, P. W., Xu, J. B., Dong, Y. Q., Chen, X. G., Gu, J. B. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (128), e56121, doi:10.3791/56121 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter