Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Использование рекомбинантных комаров Densovirus как вектор доставки генов для функционального анализа генов в личинки комаров

Published: October 6, 2017 doi: 10.3791/56121
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pathogen Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University, 2Reproductive Medical Centre of Guangdong Women and Children's Hospital

Summary

Мы сообщать, с использованием искусственного intronic малых РНК выражение стратегию для разработки не дефектных рекомбинантной Aedes aegypti densovirus (AaeDV) в естественных условиях системы доставки. Описывается подробная процедура для строительства, упаковки и количественный анализ векторов rAaeDV, а также что касается личиночной инфекции.

Abstract

В естественных условиях микроинъекции является метод передачи наиболее часто используемых гена для анализа функции гена в отдельных комаров. Однако этот метод требует более технически сложные операции и включает в себя сложные процедуры, особенно когда используется в личинок из-за их малого размера, относительно тонкой и хрупкой кутикулы и высокой смертности, которые ограничивают его применение. В отличие от вирусных векторов для доставки генов были разработаны для преодоления внеклеточные и внутриклеточных барьеров. Эти системы имеют преимущества простой манипуляции, высокая гена электромеханической эффективности, долгосрочное техническое обслуживание экспрессии генов и способность производить постоянные эффекты в естественных условиях. Комар densoviruses (MDVs) являются комаров конкретных, небольшие одноцепочечной ДНК вирусов, которые могут эффективно поставлять иностранных нуклеиновых кислот в клетки комаров; Однако замены или вставки чужеродных генов для создания рекомбинантных вирусы обычно приводит к потере упаковки или репликации способностей, которая является препятствием для развития этих вирусов в качестве векторов доставки.

Здесь мы сообщаем, использование искусственных intronic малых РНК выражение стратегии для разработки не дефектных рекомбинантной Aedes aegypti densovirus (AaeDV) в естественных условиях системы доставки. Описаны подробные процедуры для строительства, упаковки и количественный анализ векторов rAaeDV и личинок инфекции.

Это исследование показывает, в первый раз, целесообразность разработки не дефектных рекомбинантных MDV микро РНК (miRNA) выражение системы и таким образом обеспечивая мощный инструмент для функционального анализа генов в комаров и создания основы для использование вирусного paratransgenesis для контроля заболеваний, переносимых комарами. Мы продемонстрировали, что instar личинки Aedes albopictus 1st могут быть легко и эффективно заражены путем внедрения вируса в тело воды личинки, разведение сайт и что развитые rAaeDVs может использоваться для overexpress или постучать вниз экспрессия гена конкретных целевых в личинки, обеспечивая инструмент для функционального анализа комаров генов.

Introduction

Москиты таких заболеваний, как малярия, лихорадка денге, лихорадка Зика и желтой лихорадки, являются проблемы международного общественного здравоохранения, которые по-прежнему приходится значительная часть глобального инфекционных заболеваний бремя1,2. Обычных инсектицидов, которые были использованы в ответ на векторы, являются одним из основных компонентов стратегии устойчивого комплексного Москито управления для профилактики болезней, переносимых комарами. Однако такие стратегии оказались относительно неэффективными или нежелательным из-за связанного негативного экологического воздействия, а также эволюция сопротивления в Москито населения3,4. По этим причинам существует настоятельная необходимость в альтернативных методов комаров, управления и использования трансгенных методов для производства стерильных мужской комаров и выпуска устойчивостью возбудителя комаров возникли как перспективных новых стратегий управления. Для разработки эффективных новых управления методы, такие, как безопасные и эффективные подходы в vivo гена доставки, всесторонний анализ функции гена комаров не требуется.

Прямые микроинъекции плазмидной ДНК, двойной мель РНК (dsRNA) или малые интерферирующие РНК (siRNA) является наиболее часто используемым в vivo гена метод доставки в комаров. В самом деле производства трансгенных штаммов комаров по-прежнему полагаются на процесс эмбриона микроинъекции5,6,7. Однако микроинъекции имеет ряд ограничений. Во-первых этот метод является технически сложным и включает в себя сложные процедуры. Во-вторых инъекций вызывает физическое оскорбление эмбриона, личинок, куколок и взрослых, который непосредственно влияет на жизнеспособность организма целевой. В-третьих это трудно иммобилизации личинок комаров для микроинъекции потому, что большинство живут в водной среде обитания и обладают характерной извиваясь движения. В-четвертых размер 1st-2nd instar личинки 10 - 20 раз меньше, чем 4го возраста и старше личинок и смазывают бывшего более тонкие. Эти особенности делают трудно манипулировать 1st-2nd instar личинки по сравнению с теми в старых этапов. Вместе, эти факторы способствуют сокращению впрыск выживаемости для личинок (около 5%), по сравнению с8взрослых. Систем на базе вирусный были разработаны для преодоления барьеров, связанных внеклеточные и внутриклеточных. Эти системы имеют преимущества простой манипуляции, высокая электромеханической эффективности, долгосрочные и надежные уровней экспрессии и способность производить постоянные эффекты в естественных условиях. Таким образом Джин, систем доставки, используя ретровирусы, lentiviruses и аденовирусы были широко используется модель видов и inmammalian клеточных линий. Система вирусного выражение синдбис были ранее использованы для анализа функции гена в взрослых комаров; Помимо проблем биобезопасности однако, инъекции-прежнему необходимый процесс для вирусной инфекции9. Несмотря на то, как метод возможности доставки перорального путем замачивания личинок в решении двуцепочечной ДНК уже сообщалось ранее, она непригодна для малых РНК функция анализа10. Таким образом методы эффективные вирусный доставки по-прежнему должны быть разработаны для комаров.

Комар densoviruses (MDVs) являются частью подсемейство Densovirinae Parvoviridae, и все, но один падения в род Brevidensovirus11. MDV вирионы не охватило и состоят из одноцепочечной ДНК (ssDNA) генома и икосаэдра капсид (20 Нм в диаметре). Вирусного генома находится примерно в 4 kb в размер и реплицируется внутри ядер клеток хозяина. MDVs относительно устойчивы в окружающей среде и показать узкие хозяйского диапазона с высокой точностью для комаров. Эти вирусы имеют потенциал для распространения и сохранения естественно популяции комаров и может вторгнуться почти все органы и ткани этих насекомых, в том числе средняя, Malpighian трубочки, жир тела, мускулатура, нейронов и слюнных желез12.

Нетронутыми MDV геномов может быть subcloned в векторы плазмиды производить на основе плазмида инфекционных клоны; когда эти клоны доставляются в клетки комаров, вирусного генома извлекается из вектор плазмиды, и производятся инфекционных вирусных частиц. Потому что MDV имеет небольшой ssDNA генома, инфекционные клонов легко построены и вирусного генома могут быть легко манипулировать11,13. Эти характеристики делают MDV ценным агентом для изучения биологии комаров. Однако, потому что почти все из вирусного генома имеет важное значение для вирусного распространения, создание рекомбинантных вируса путем замены или вставки чужеродных генов приводит к потере вирусный упаковки или репликации способностей, который создает барьером для развития MDVs как ген доставки векторов. Здесь мы сообщаем, что с помощью искусственных intronic малых РНК выражение стратегии для разработки не дефектных rAaeDV в vivo РНК системы доставки, которая имеет преимущества легко плазмида строительство и поддержание функциональной вирус, который может производить стабильное и долгосрочное выражение в клетки хозяина без необходимости дикого вируса. Кроме того этот метод позволяет легко трансдукции личинок.

В этом исследовании описываются протоколы для следующих шагов: 1) дизайн rAaeDVs кодирования кассета intronic выражение малых РНК, 2) производство рекомбинантных вирусных частиц с помощью упаковки ячейки C6/36 линия, 3) количественный анализ клеток бесплатно геном rAaeDV копировать номера и 4) инфекции личинок А.е. albopictus путем прямого введения в организм воды личиночной обитания вируса. В целом эта работа продемонстрировал, что конкретные малые РНК или целевых генов может оверэкспрессировали или сбил в личинки комаров с помощью разработанной системы доставки MDV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

все протоколы были утверждены Этический Комитет Южной медицинского университета.

1. Проектирование искусственного Интрон

Примечание: искусственные Интрон, используемые в этой работе является 65 bp в длину и последовательность-5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.

  1. Место гПа я ограничения сайта на обоих концах искусственных Интрон так что гПа я пищеварение может выпустить Интрон от плазмид (см. рис. 1 A).
  2. Место два Xba я ограничения сайтов в Интрон так что Xba я пищеварение может использоваться для вставки выражение малых РНК последовательности.
  3. Заказать химического синтеза полнометражного последовательностей ДНК из искусственного Интрон от производителя ДНК. Синтетических ДНК создали это от клонирования в стандартной pUC19 плазмиду.
    Примечание: Основные компоненты искусственного Интрон включают несколько нуклеотидов элементы консенсуса, включая 5 ' доноров сращивания сайта (DS) с последовательностью GUAAGAGU, последовательность сохраняется точка филиала (BPS) с последовательностью UACUAAC, поли пиримидина тракта (PPT) с последовательности UCUUC(U) 10 и 3-'-акцептор сращивания сайта (AS) с последовательностью GAUAUCCUGCAG ( рис. 1 А). Два Xba я места ограничения были введены между DS и бит, который может использоваться для вставки малых РНК выражения последовательности. Способность эффективно сращивания этот искусственный Интрон от клеток млекопитающих и Москито был ранее подтвержденных 14.

2. Проектирование искусственного Intronic малых РНК выражение кассета

Примечание: гиперэкспрессия или нокдаун эндогенного Мирна, последовательности кодирования Мирна прекурсоров или губкой Мирна были вставлены между DS и БПС. В качестве примера, Мирна эндогенного прекурсоров из А.е. albopictus aal пусть-7 был выбран построить рекомбинантных вирусных векторов гиперэкспрессия Мирна и сногсшибательно. Губка let-7 был разработан согласно ранее описанных методов 15. Чтобы сбить целевых генов в личинки, мы разработали конкретные искусственные микроРНК (amiRNA) или последовательности РНК (индуцируемый) коротких шпильки, используя программное обеспечение для онлайн 16 , 17; в качестве примера, V-АТФазы Субблок мРНК (присоединение-нет. AY864912) был выбран в качестве целевого гена в этом исследовании. AmiRNA будет именоваться amiVTP далее. Все детали последовательности pre-miRNA и губки, amiRNA, индуцируемый описаны в Справочная таблица 1.

  1. Заказать химического синтеза полнометражного cDNA последовательностей интерферирующим прекурсоров, Мирна губки и индуцируемый с Xba я места ограничения на обоих концах от производителя ДНК.
  2. После получения заказанных ДНК, спина пробирки, содержащие блоки ДНК на 10 000-14 000 x g за 1 мин обеспечить, что все сушат ДНК находится в нижней части трубки.
  3. Ресуспензируйте сушеные ДНК в DNase свободной воды для достижения конечной концентрации 10 нг/мкл.
  4. Дайджест плазмида позвоночника и ДНК последовательности с Xba при 37 ° C за 1 ч, а затем dephosphorylate 5 ' концы линеаризованного плазмида позвоночника с икры кишечной щелочной фосфатазы (CIAP) согласно данным производителя ' протокол s .
  5. Инактивировать CIAP нагревом для 60 мин на 65 ° C.
  6. Запустить 1,0% агарозном геле и сократить линеаризованного позвоночника. Затем извлечь ДНК из геля фрагмента, используя набор извлечения геля после производитель ' s инструкции.
  7. Ligate фрагмент ДНК в backboneby T4 ДНК лигаза (5 U/мкл) при 22 ° C в течение 1 ч.
  8. Превратить продукты реакции перешнуровки от 2.7 пошаговой сведущее Escherichia coli (E. coli) клеток и пластины на пластину агар Lysogeny бульон (LB), содержащий ампициллина (в концентрации 100 мкг/мл). Штамм
    1. выполнять преобразование посредством теплового шока метод 18 и использовать соответствующие E. coli. Например, используйте штамм E. coli DH5α для преобразования тепловой шок.
  9. Выбрать один колонии от шаг 2.8 и инкубировать в культуре 3 мл обогащенный средних содержащий ампициллина (в концентрации 100 мкг/мл).
  10. Извлечение плазмидной ДНК из бактериальной культуры, с помощью мини-prep набор после производитель ' s инструкции. Отправить образец компании секвенирования ДНК.
    Примечание: Для гиперэкспрессия или нокдаун эндогенного Мирна, последовательности кодирования Мирна прекурсоров или губкой Мирна были вставлены между двумя Xba я сайтов. Все конструкции Мирна выражение или губка должна быть короче 400 bp (10% от длины вирусного генома) из-за упаковки предел вирус 19.

3. Создание rAeaDV конструкцию путем клонирования Мирна или индуцируемый выражение кассету в плазмиду позвоночника

Примечание: Пука, инфекционные клон, состоящий из Пука плазмида, содержащие геном AaeDV (3981 nt) 19, любезно предоставил профессор Джонатан Карлсон и была ранее описана в деталях 11. p7NS1-DsRed выражает-структурный белок 1 (NS1)-красных флуоресцентных белков (DsRed) синтез белка от промоутера p7 и был подробно описаны в других 14. Специфичные для человека мир-941-1 прекурсоров 20 и ее губки, кинулись индуцируемый (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), были также subcloned в AaeDV как отрицательный контроль.

  1. Перевязать pre-miRNA, Губка, индуцируемый или кассеты amiVTP выражение в гПа, я на сайте AaeDV NS1-кодирования региона в Пука плазмида позвоночника, как описано в протоколе шаг 2.4 до 2.7.
  2. Преобразование ДНК в Stbl3 сведущее Escherichia coli клетки и выберите позитивные клон, как описано в шаге 2.8 до 2.10.
  3. После этого, экстракт rAaeDV плазмиды от бактериальных клеток с использованием макси подготовка комплекта после производитель ' s инструкции.
    Примечание: Stbl3 или Stbl4 E. coli клетки должны использоваться для преобразования rAaeDV ДНК для минимизации нежелательных ITR рекомбинации. Макси приготовительная должен быть использован для извлечения плазмида rAaeDV получить большое количество ДНК (> 100 мкг). Перед созданием вирус, целостность последовательности плазмида rAaeDV всегда должны быть проанализированы секвенирования ДНК 21.

4. Transfecting ячейки C6/36 с rAaeDV плазмид

  1. культуры C6/36 клеток в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 средства, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллина/стрептомицина в инкубаторе 28 ° С.
  2. На день 0, плиты клетки в десяти 25 см 2 фляги культуры 18-20 ч до трансфекции разделяя 90-95% вырожденная клетки в разведении 1:2.
    Примечание: День 1, клетки до 90-95% впадения.
  3. На 1 день, transfect клетки с серии rAaeDV плазмид 22.
    1. Развести 10 мкг ДНК в 600 мкл RPMI 1640 среды в пробки microcentrifuge и осторожно перемешать. Тем временем подготовить 600 мкл RPMI 1640 среднего и 25 мкл Реагента трансфекции за transfection.
    2. Инкубировать на 5-10 мин при комнатной температуре (RT). Затем, добавьте 625 мкл Реагента 1640-трансфекции смеси в 1640-плазмида ДНК смесь.
    3. Инкубировать эту смесь для 20-30 мин на RT. Перед трансфекции, вымыть клетки дважды с 2 мл среды RPMI 1640.
    4. После RT инкубации (шаг 4.3.3), добавить the1640-трансфекции реагент ДНК плазмиды смесь колбу культуры 2 25 см и проинкубируйте 6 h 28 ° C.
    5. На примерно 6 ч после трансфекции, удалить Трансфекция СМИ, вымыть клетки дважды с 5 мл RPMI 1640 среды, а затем добавить среду RPMI 1640 с 10% FBS.
      Примечание: rAaeDV А.е. albopictus личинки показывает высокие темпы инфицирования (95%); Однако, по нашему опыту, в почти 50% зараженные личинки, инфекция была ограничена первичной инфекции сайтов (например, Анальный секс сосочки и щетина клетки), без распространение 23. Поэтому если есть необходимость заразить личинок в нескольких тканей, дефектных рекомбинантных вирус, выражая флуоресцентный белок должны быть сочетанной возможность визуализации инфекции сайтов. Например, для получения дефектных рекомбинантных вирус, выражая DsRed, p7NS1-DsRed должна быть совместно transfected с помощником плазмида в ячейки C6/36 согласно процедуре, описанной выше (коэффициент концентрации cotransfection должно быть 2:1).

5. Заготовки rAaeDV вирионы из C6/36 Transfected клеток

  1. урожай клетки 5 дней после transfection. Выбить и приостановить клетки в блюда с капельницей 5 мл стекла, закупорить вверх и вниз с питательной среды. Передача всех клеточных суспензий в стерильные пробирки 15-мл.
  2. Замораживания при температуре-80 ° C или в ванне с сухим льдом/этанол 30 мин и затем разморозить 37 ° C. Vortex для 1 мин повторить процедуру замораживания оттаивания 3 раза.
  3. Центрифуга образца на 4800 x g 20 мин на 4 °C.Collect супернатант и отбросить гранулы. Затем передайте супернатант через фильтр одноразовые шприц 0,22 мкм. Алиготе и магазин окончательный очищенных вирионов запасов на -80 ° C.
    Примечание: Избегать повторного замораживания оттаивания циклов.

6. Количественная оценка rAaeDV

  1. подготовить ДНК стандартов. Линеаризации все rAaeDV плазмид с гПа и очистить переваривается продуктов с гель добыча комплект 24.
  2. Построить абсолютные количественные калибровочной кривой и измерить титр вируса согласно ранее описанных методов 25.

7. Комаров трансдукции

  1. мыть 100 1 st instar А.е. albopictus личинки три раза с использованием деионизированная вода, а затем, личинки в стакан с 95 мл деионизированной водой. Добавьте 5 мл rAaeDV запасов (конечная концентрация 1,00 x 10 10 копий/мл).
  2. Инкубировать 24 h на 28 ° C, мыть личинки, три раза с помощью деионизированной воды, и затем передать личинки пластины и регулярно кормить.
  3. Контролировать уровень экспрессии генов цели в личинки с ПЦР или Вестерн-блот (представитель результаты отображаются в рисунки 3 и 4).
    Примечание: Метод обнаружения сигнала флюоресценции может использоваться для изолировать зараженные личинки более точно. Например чтобы обнаружить флуоресцентные сигналы от личинок, инфицированных вирусом рекомбинантных, выражая DsRed, личинки можно размещены на слайде вогнутость и наблюдается под Перевернутый флуоресцентным микроскопом каждые 8 ч до 2 дней после инфицирования. После обнаружения флуоресцентные личинки, они должны разделены на отдельного теста пластиковых чашек для последующего постоянного наблюдения. Личинки с несколькими тканями инфицированных могут быть определены с помощью этого метода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Стратегии для строительства rAaeDV
Вектор дефектных rAaeDV был создан для выражения гена DsRed в личинок комаров. Результате плазмида содержал NS1-DsRed синтез белка кассету с VP белка удалены (рис. 1А). (показано на рис. 1Б) были разработаны rAaeDV плазмид, содержащий выражение конструкции для Мирна, Мирна Губка, индуцируемый и amiRNA. Например вектор rAaeDV был создан для overexpress aal пусть-7 в личинок комаров. Результате плазмида содержал intronic pre-aal пусть-7 кассету в Вирусный экзона NS1 (рис. 1Б). RAaeDV вектор, содержащий выражение кассета intronic Губка aal пусть-7 в Вирусный экзона NS1 был создан чтобы сбить aal пусть-7 выражение в личинки комаров (Рисунок 1B и 2 рисунокB). Индуцируемый вектор rAaeDV и rAaeDV amiRNA вектор, содержащий intronic индуцируемый и pre-amiRNA выражение кассеты, соответственно, были использованы для сбить V-АТФазы мРНК в личинки комаров (рис. 2C).

Расчет rAaeDV титры, на основе стандартной кривой, созданные с помощью линейного регрессионного анализа
Ось y представляет значение Log10 стандартные ДНК молекулярной концентрации, и ось x указывает значение CT. CT чисел (ось x) и Log10 (концентрация) значения (ось y) отображается хорошая корреляция (R2 = 0.9988) и встретиться уравнение y = - 0,288 x + 13.87 (рис. 3). Рассчитайте rAaeDV титры образцов с помощью линейного уравнения (Таблица 1). С помощью метода описаны в протоколе (Шаг 6.2 и Таблица 1), высокие титры rAaeDV (4 мл, > 7,65 x 1010 частиц/мл) был собран. Рекомбинантных вирусов (VrepUCA-7, VrepUCA-7s, VrepUCA-amiVTP, VrepUCA-shVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1s и VrepUCA-shct) были получены путем transfecting соответствующей инфекции клоны Пука-7, Пука-7s, Пука amiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1s, Пука shct в ячейки C6/36 (разделы 3, 4 и 5).

Определение эффективности гиперэкспрессия и сногсшибательно Мирна rAaeDV векторов
В этом примере 1 100st instar личинки были относиться с равными суммами (1,00 x 1010 частиц/мл) rAaeDV, содержащих intronic выражение let до-7 вектор, intronic пусть-7 Губка вектора выражения, специфичные для человека предварительно-miR-941-1 выражение вектор или вектора выражения мир-941-1 Губка, добавив вируса в организм воды личиночной обитания. Через пять дней после инфицирования, выражение aal пусть-7 определяется ПЦР (рис. 4, n = 3; Справочная таблица 2). Пусть-7 уровней, которые отображаются как среднее ± SD три биологических реплицирует в личинки, были существенно увеличился или уменьшился на предварительно-let-7-выражая rAaeDV (оверэкспрессировали 2,843.31 ± 80,72%, p < 0,0001, t тест) и Пусть-7-Губка выражая rAaeDV (downregulated 74.78 ± 1,60%, p < 0,0001, t тест), соответственно.

Мониторинг эффективности нокдаун V-АТФазы мРНК rAaeDV векторов
В общей сложности 100 1st instar личинки относились с равными суммами (1,00 x 1010 частиц/мл) intronic amiRNA выражая rAaeDV, intronic rAaeDV, выражая индуцируемый, человека конкретные предварительные-miR-941-1-выражая rAaeDV orscramble выражая индуцируемый rAaeDV путем добавления вируса в организм воды личиночной обитания. Через пять дней после инфицирования, выражение mRNA V-АТФазы определяется ПЦР (рис. 5, n = 3; Справочная таблица 2). Уровень V-АТФазы, отображается как среднее ± SD три биологических реплицирует в личинки существенно сократилось на amiRNA выражая rAaeDV (downregulated 43.01 ±6.37%, p = 0.0011, t тест) и intronic индуцируемый выражая rAaeDV (downregulated, 72.88 ± 5,74%, p = 0.0001, t тест).

Figure 1
Рисунок 1 : Схема организации рекомбинантных плазмид AaeDV. (A) векселей и pVP вирусный промоутеров диск экспрессии генов NS1/NS2 и VP генов, соответственно. В плазмида p7NS1-DsRed ген DsRed было сплавлено NS1 гена. (B) Пука-7, Пука-7s, Пука-941-1, Пука-941-1s, Пука shct, Пука shVTP и Пука amiVTP содержат искусственные интронов, включая aal пусть-7, aal пусть-7 Губка, имеет мир-941-1, имеет мир-941-1 Губка, кинулись индуцируемый, индуцируемый V-АТФазы и искусственные Мирна, соответственно, которые были клонированы в гПая сайт NS1 гена. Искусственные Интрон показано flanked сращивания доноров (DS) и акцептор сайта (AS) и содержит точку домен (BrP), поли пиримидина тракта (PPT) и pre-miRNA. Мирна губкой или искусственных микроРНК последовательность вставляется внутрь Интрон между 5-соединитель и BrP. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Биогенеза intronic искусственных микроРНК (miRNA) и стратегии для создания Мирна губки и искусственных адаптивной. (A) Intronic miRNA совместно транскрибируется в пределах предшественником РНК (пре мРНК) о NS1, который будет обусловлен pNS1 промоутер и расщепляется из пре мРНК, сплайсинг РНК. Хотя экзонов лигируют для формирования зрелой матричная РНК (мРНК) для синтеза белка NS1, сращивания Интрон с pre-miRNA далее обрабатывается в зрелые Мирна Dicer. (B) стратегия для генерации let-7 и miR-941-1 конструкции. Выравнивание let-7 и miR-941-1 последовательностей с aal пусть-7 и имеет мир-941-1, соответственно. Отображается полное соответствие регионов семян с анти miRNA последовательности и хвост регионами. Пусть-7 и мир-941-1 губки содержат три повторения антисмысловых конструкции (красные буквы), которые можно привязать к aal пусть-7 и имеет мир-941-1, соответственно. (C) последовательности и предсказал прекурсоров структур на основе Мирна искусственных адаптивной и индуцируемый, используемые в данном исследовании. Зрелые искусственных адаптивной и индуцируемый показаны красным цветом, и их связанные последовательности мРНК в синий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Калибровочной кривой титрования rAaeDV и conce вычисляемыйntrations MDVs. (A) в реальном времени ПЦР была выполнена с Пука стандарт, который был разведен по 10 раз увеличение соотношения, и значение CT было измерено на 7500 ABI как x. Номер копии был рассчитан согласно шаг 6.2 и 6.3 по следующей формуле: скопируйте номер (y) =-0.288x + 10.87; R2 = 0.9988. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Гиперэкспрессия рекомбинантной MDV-опосредованной aal пусть-7 и нокдаун в А.е. albopictus личинки. (A) анализ экспрессии эндогенного микроРНК в личинок после инфицирования вирусом рекомбинантных, содержащие выражение aal пусть-7 кассеты (левая панель). (B) эффективность let 7 конструкции был определен в личинки (правая панель). Имеет мир-941-1 и имеет-941-1 Губка (отрицательный контроль) оверэкспрессировали и downregulated Зрелые интерферирующим пусть-7, соответственно, по сравнению с базальных уровней, наблюдаемых в контрольной группе. Мирна изобилие нормализована 5S рРНК, и данные отображаются как реплицирует среднее ± SD три биологических. T-тесты проводились на разные уровни значимости. Звездочки показывают статистически значимых различий между инфицированных и соответствующий макет лечение личинки (четыре звездочки, p < 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Анализ экспрессии мРНК V-АТФазы после инфицирования вирусом рекомбинантных, содержащие кассеты индуцируемый и amiRNA. изобилие мРНК нормализована aalrpS7. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение 2−ΔΔCT значения выражения V-АТФазы мРНК в А.е. albopictus личинки по оценке реального времени RT-PCR (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Table 1
Таблица 1: Рекомбинантные MDV C T значение, определяемое ПЦР соответствует x значение в формуле, которая используется для вычисления y значение. Номер копии вирусного генома в каждый 1 мкл пример был получен функции державой 10, ( y), которая в конечном итоге было умножено на 40, преобразование значения концентрации вируса вируса подвеска.

Supplemental Table 1
Справочная таблица 1: Последовательности Мирна прекурсоров.

Supplemental Table 2
Справочная таблица 2: данные ПЦР.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Важно преодолеть две основные барьеры, которые ограничивают rAaeDV строительство. Во-первых, производство дефектных рекомбинантных вируса. Сообщалось, что MDV может использоваться как вектор выразить соответствующим образом размера чужеродных генов, как Скорпион насекомых специфических neurotoxins20 и белка GFP; Однако независимо от стратегии строительства, после того, как заменить экзогенных генов, или вставки ORFs MDV вирионы не может самостоятельно формировать если вспомогательный плазмида cotransfected на поставку отсутствующих необходимых вирусные белки. Дефектный вирус не может заниматься вторичной передачи, которая возникает в естественных условиях в комаров с дефектных геномов. Наши результаты проверки intronic выражение стратегии, которая предлагает новую парадигму, которая может преодолеть ограничения MDVs с дефектных геномов для эффективной доставки чужеродных генов в комаров.

Во-вторых, требовательных ограничение по длине рекомбинантных вирусного генома, обусловленных размером вирусного капсида. Для эффективной упаковки, размер генома не может превышать 4400 нуклеотидов (110% от длины генома MDVs wt). Выражение кассета intronic miRNA (включая Мирна выражение кассету и искусственных Интрон) не более чем 400 nt могут быть введены в геном AaeDV. Хотя длина геном рекомбинантных вируса по-прежнему подходит для упаковки, эта система доставки есть место для улучшения. Из-за ограничения длины генома трудно выразить генов без дефектных intronic выражение стратегии.

Это важно для обеспечения здорового для обеспечения успешного transfection и упаковка rAaeDV ячейки C6/36. Однако Катионный липосом реагентов, используемых здесь и коммерческие насекомых ячеек конкретных трансфекции реагентов, не улучшить эффективность трансфекции ячейки C6/36 (40-60%). Таким образом урожай рекомбинантных высокий титр вируса, необходимо сохранить клетки в течение 5 дней после трансфекции, основанный на ранее описанных роста характеристик14. Кроме того для успешной личиночной инфекции, важно для личинок быть в контакте с инфекционных вирусных частиц для 36 h обеспечить высокий инфекции коэффициенты2324–.

В заключение intronic выражение стратегии, описанные здесь является первым для преодоления барьеров, введенных поколения дефектных MDV. Эта стратегия позволяет производство не дефектных рекомбинантной MDVs, которые могут overexpress или помощью адаптивной и целевых генов в комаров. Этот метод предоставляет инструмент для функционального анализа генов комаров без использования сложных личинки микроинъекции процедур и имеет четкие коммерческих приложений. Дальнейшие исследования будет расширяться применение стратегии описывается выражение расследовать комаров биология и paratransgenesis для контроля вируса денге.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы признают финансовой поддержке национальных ключевых исследований и развития программы Китая (2016YFC1200500 Чэнь Сяо Гуан), Национальный фонд Китая естественных наук (81672054 и 81371846), команда программы исследований природных Научный фонд Гуандун (2014A030312016) и научно -технической программы Гуанчжоу (201508020263). Мы с благодарностью признаем профессор Джонатан Карлсон (Университет штата Колорадо), любезно предоставление Пука и p7NS1-GFP плазмидов и критически чтения этой рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge machine Thermo Scientific 75004260
Centrifuge System Beckman Coulter 363118
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691
E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit Omega Biotech D6904
Purified Agar OXOID LP0028A
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) Thermo Scientific EF0651
FastDigest HpaI Thermo Scientific FD1034
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µL) Thermo Scientific EL0011
TransStbl3 Chemically Competent Cell Beijing Transgen Biotech CD521-01
Ampicillin  Beijing Tiangen Biotech RT501
Proteinase K Promega MC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) Beijing Tiangen Biotech FP205

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
  2. Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
  3. Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
  4. Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
  5. Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
  6. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
  7. Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
  8. Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
  9. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
  10. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, (Online) 69 (2013).
  11. Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
  12. Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
  13. Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
  14. Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
  15. Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).
  16. BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/ (2017).
  17. GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).
  18. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
  19. Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
  20. Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
  21. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  22. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
  23. Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
  24. Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
  25. Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).

Tags

Биология развития выпуск 128 комаров densovirus Джин доставки вектор малые РНК, Aedes albopictus переносчиками искусственные Интрон.
Использование рекомбинантных комаров Densovirus как вектор доставки генов для функционального анализа генов в личинки комаров
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, P. W., Xu, J. B., Dong, Y. Q.,… More

Liu, P. W., Xu, J. B., Dong, Y. Q., Chen, X. G., Gu, J. B. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (128), e56121, doi:10.3791/56121 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter