Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

Zusammenfassung

Wir berichten mit einer künstlichen intronischen kleine RNA Ausdruck Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Eine detaillierte Anleitung für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren sowie für Larven Infektion wird beschrieben.

Zusammenfassung

In Vivo Mikroinjektion ist die am häufigsten verwendeten Gen Übertragung Technik für die Analyse der Genfunktionen in einzelne Mücken. Allerdings ist diese Methode erfordert eine technisch anspruchsvollere Betrieb und beinhaltet komplizierte Verfahren, besonders beim Einsatz in Larven aufgrund ihrer geringen Größe, relativ dünne und empfindliche Nagelhaut und hohe Sterblichkeit, die ihre Anwendung einschränken. Im Gegensatz dazu wurden virale Vektoren für gen-Lieferung entwickelt, um die extrazelluläre und intrazelluläre Barrieren zu überwinden. Diese Systeme haben den Vorteil der einfache Handhabung, hohe gen Transduktion Effizienz, langfristige Erhaltung der Genexpression und die Fähigkeit, dauerhafte Effekte in Vivozu produzieren. Moskito-Densoviruses (MDVs) sind Moskito-spezifische, kleine einzelsträngigen DNA-Viren, die effektiv ausländische Nukleinsäuren in Mücke Zellen liefern können; den Ersatz oder die Einfügung von Fremdgenen rekombinante Viren erstellen in der Regel verursacht jedoch einen Verlust von Verpackung und/oder Replikation Fähigkeiten, der ein Hindernis für die Entwicklung dieser Viren als Vektoren der Lieferung ist.

Hier berichten wir mit einer künstlichen intronischen kleine RNA-Ausdruck-Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Modalitäten für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren und Larven Infektion werden beschrieben.

Diese Studie zeigt zum ersten Mal die Möglichkeit der Entwicklung eines mangelfreien rekombinante MDV micro RNA (MiRNA) Ausdruck, und so bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die funktionelle Analyse von Genen in Mücke und eine Grundlage für die Anwendung des viralen Paratransgenesis zur Steuerung von Moskitos übertragenen Krankheiten. Wir gezeigt, dass Aedes Albopictus 1^St Instar Larven infiziert sein könnte durch die Einführung des Virus in den Wasserkörper der Larven Zucht Website einfach und effektiv und entwickelte rAaeDVs verwendet werden könnte, um overexpress oder niederzuschlagen die Ausdruck eines bestimmten Ziel-Gens in Larven, und ein Tool für die funktionelle Analyse von Moskito Gene anbieten.

Einleitung

Moskitos übertragenen Krankheiten wie Malaria, Dengue-Fieber, Zika-Fieber und Gelbfieber, sind große internationale öffentliche Gesundheitsprobleme, die weiterhin ein beträchtlicher Teil des globalen Infektionskrankheit Last^1,2ausmachen. Herkömmliche Insektizide, die als Reaktion auf Vektoren verwendet wurden, sind ein wichtiger Bestandteil des nachhaltigen integrierten Moskito Regelstrategie für die Prävention von Moskitos übertragenen Krankheiten. Aber erwiesen solche Strategien sich als relativ unwirksam oder nicht wünschenswert aufgrund der damit verbundenen negativen Umweltauswirkungen sowie die Entwicklu....

Protokoll

alle Protokolle wurden von den ethischen Komitees der Southern Medical University angenommen.

1. entwerfen eine künstliche Intron

Hinweis: die künstliche Intron in dieser Arbeit verwendeten ist 65 bp in der Länge, und die Reihenfolge ist 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.

1. Legen die Hpa ich Beschränkung site an beiden Enden des künstlichen Intron so dass Hpa ich Verdauung kann loslassen das Intron aus Plasmide (siehe Abbildung 1 A).
2. Legen Sie die zwei Xba ich Einschränku....

Ergebnisse

Strategien für rAaeDV Bau
Ein defekten rAaeDV Vektor wurde generiert, um die DsRed gen in Mückenlarven exprimieren. Die daraus resultierende Plasmid enthalten eine NS1-DsRed Fusion Protein Kassette mit dem VP-Protein gelöscht (Abb. 1A). rAaeDV Plasmide mit Ausdruck Konstrukte für MiRNA, wurden MiRNA Schwamm, ShRNA und AmiRNA (dargestellt in Abbildung 1B) ausgelegt. Zum Beispie.......

Diskussion

Es ist wichtig, zwei der wichtigsten Hindernisse zu überwinden, die rAaeDV Konstruktion zu begrenzen. Die erste ist die Produktion von defekten rekombinanten Virus. Es wurde berichtet, dass MDV als ein Vektor angemessen zum Ausdruck bringen fremde Gene, wie Skorpion Insekt-spezifische neurotoxins20 und das GFP-Protein Größe verwendet werden kann; aber unabhängig von der Aufbau-Strategie, können nicht sobald die ORFs MDV eingefügt oder mit exogenen Gene ersetzt Virionen selbständig bilden, wenn ein Helfer Plasmid cotransf.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zentrifugenmaschine	Thermo Scientific	75004260
Zentrifugensystem	Beckman Schar	363118
GeneJET Gel-Extraktionskit	Thermo Scientific	K0691
E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit	Omega Biotech	D6904
Gereinigter Agar	OXOID	LP0028A
FastAP Thermosensitive alkalische Phosphatase (1 μμ; L)	Thermo Scientific	EF0651
FastDigest HpaI	Thermo Scientific	FD1034
FastDigest XbaIThermo	Scientific	FD0684
T4 DNA-Ligase (5 U/&Mikro; L)	Thermo Scientific	EL0011
TransStbl3 Chemisch kompetente Zelle	Beijing Transgen Biotech	CD521-01
Ampicillin	Beijing Tiangen Biotech	RT501
Proteinase K	Promega	MC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	Beijing Tiangen Biotech	FP205