Summary
Wir berichten mit einer künstlichen intronischen kleine RNA Ausdruck Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Eine detaillierte Anleitung für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren sowie für Larven Infektion wird beschrieben.
Abstract
In Vivo Mikroinjektion ist die am häufigsten verwendeten Gen Übertragung Technik für die Analyse der Genfunktionen in einzelne Mücken. Allerdings ist diese Methode erfordert eine technisch anspruchsvollere Betrieb und beinhaltet komplizierte Verfahren, besonders beim Einsatz in Larven aufgrund ihrer geringen Größe, relativ dünne und empfindliche Nagelhaut und hohe Sterblichkeit, die ihre Anwendung einschränken. Im Gegensatz dazu wurden virale Vektoren für gen-Lieferung entwickelt, um die extrazelluläre und intrazelluläre Barrieren zu überwinden. Diese Systeme haben den Vorteil der einfache Handhabung, hohe gen Transduktion Effizienz, langfristige Erhaltung der Genexpression und die Fähigkeit, dauerhafte Effekte in Vivozu produzieren. Moskito-Densoviruses (MDVs) sind Moskito-spezifische, kleine einzelsträngigen DNA-Viren, die effektiv ausländische Nukleinsäuren in Mücke Zellen liefern können; den Ersatz oder die Einfügung von Fremdgenen rekombinante Viren erstellen in der Regel verursacht jedoch einen Verlust von Verpackung und/oder Replikation Fähigkeiten, der ein Hindernis für die Entwicklung dieser Viren als Vektoren der Lieferung ist.
Hier berichten wir mit einer künstlichen intronischen kleine RNA-Ausdruck-Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Modalitäten für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren und Larven Infektion werden beschrieben.
Diese Studie zeigt zum ersten Mal die Möglichkeit der Entwicklung eines mangelfreien rekombinante MDV micro RNA (MiRNA) Ausdruck, und so bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die funktionelle Analyse von Genen in Mücke und eine Grundlage für die Anwendung des viralen Paratransgenesis zur Steuerung von Moskitos übertragenen Krankheiten. Wir gezeigt, dass Aedes Albopictus 1St Instar Larven infiziert sein könnte durch die Einführung des Virus in den Wasserkörper der Larven Zucht Website einfach und effektiv und entwickelte rAaeDVs verwendet werden könnte, um overexpress oder niederzuschlagen die Ausdruck eines bestimmten Ziel-Gens in Larven, und ein Tool für die funktionelle Analyse von Moskito Gene anbieten.
Introduction
Moskitos übertragenen Krankheiten wie Malaria, Dengue-Fieber, Zika-Fieber und Gelbfieber, sind große internationale öffentliche Gesundheitsprobleme, die weiterhin ein beträchtlicher Teil des globalen Infektionskrankheit Last1,2ausmachen. Herkömmliche Insektizide, die als Reaktion auf Vektoren verwendet wurden, sind ein wichtiger Bestandteil des nachhaltigen integrierten Moskito Regelstrategie für die Prävention von Moskitos übertragenen Krankheiten. Aber erwiesen solche Strategien sich als relativ unwirksam oder nicht wünschenswert aufgrund der damit verbundenen negativen Umweltauswirkungen sowie die Entwicklung von Resistenzen in Mücke Bevölkerung3,4. Aus diesen Gründen gibt es ein dringender Bedarf an alternativen Methoden der Mücke, Kontrolle und die Verwendung von transgenen Methoden, sterile männliche Mücken zu produzieren und die Freigabe der Erreger resistent Mücken entstanden als viel versprechende neue Bekämpfungsstrategien. Entwickeln wirksame neue control-Methoden, wie sichere und wirksame Ansätze zur in-Vivo -gen Lieferung, die umfassende Analyse der Genfunktion Moskito ist erforderlich.
Direkte Mikroinjektion von Plasmid DNA, doppelte stranded RNA (DsRNA) oder kleine interferierende RNA (SiRNA) ist die am häufigsten verwendeten in Vivo gen Übermittlungsmethode in Mücken. In der Tat die Herstellung transgener Linien von Mücken noch verlassen sich auf einen Prozess der Embryo Mikroinjektion5,6,7. Mikroinjektion hat jedoch einige Einschränkungen. Zuerst, diese Technik ist technisch anspruchsvoll und komplizierte Verfahren beinhaltet. Zweitens verursacht Injektion eine körperliche Beleidigung des Embryos, Larven, Puppen und Erwachsenen, die direkten Einfluss auf die Lebensfähigkeit des Zielorganismus. Drittens ist es schwierig, Mückenlarven für die Mikroinjektion zu immobilisieren, weil die meisten in einem aquatischen Lebensraum leben und besitzen eine charakteristische Bewegung zappelt. Viertens ist die Größe der 1St-2Nd Instar Larven 10 bis 20 Mal kleiner als die 4th Instar und älteren Larven und die Nagelhaut der erstere empfindlicher sind. Diese Funktionen machen es schwierig, 1St-2Nd Instar Larven im Vergleich zu denen in älteren Stadien zu manipulieren. Kombiniert, tragen diese Faktoren zu einer reduzierten nach der Injektion Überlebensrate für Larven (ca. 5 %) im Vergleich zu Erwachsenen8. Viral-basierte Systeme wurden entwickelt, um die damit verbundenen extrazellulären und intrazellulären Barrieren zu überwinden. Diese Systeme haben den Vorteil der einfachen Handhabung, hohe Transduktion Effizienz, langfristige und stabile Ebenen des Ausdrucks und die Fähigkeit, dauerhafte Effekte in Vivozu produzieren. Daher verwendet gen, die Nutzung der Retroviren, Lentiviren und Adenoviren-Delivery-Systeme weit verbreitet gewesen sein Inmammalian Zelllinien und Modell-Arten. Sindbis Virus Expressionssystems hatte früher die Genfunktion in der Erwachsenmoskito zu analysieren; Neben der biologischen Sicherheit Bedenken ist die Injektion noch ein notwendiger Prozess für virale Infektion9. Obwohl die mündlichen Lieferung durch Larven in der DsRNA-Lösung einweichen vorher als möglich Lieferung Methode berichtet worden ist, ist es für kleine RNA Funktion Analyse10ungeeignet. Also, müssen wirksame virale Liefermethoden für Mücken noch entwickelt werden.
Moskito-Densoviruses (MDVs) sind Teil der Unterfamilie Densovirinae Parvoviridaeund alle außer einem Fall innerhalb der Gattung Brevidensovirus11. MDV Virionen sind unbehüllte und bestehen aus einem Genom einzelsträngiger DNA (SsDNA) und einem ikosaedrischen Kapsid (20 nm im Durchmesser). Das virale Genom ist etwa 4 kb groß und wird in den Kernen der Wirtszellen repliziert. MDVs sind relativ stabil in der Umgebung und zeigen einen schmalen Wirtsspektrums mit hoher Spezifität für Moskitos. Diese Viren haben das Potenzial, zu verbreiten und natürlich in Moskito-Populationen bestehen und fast allen Organen und Geweben von diesen Insekten, darunter den Mitteldarm Malpighian Tubuli, fetten Körper, Muskulatur, Neuronen und Speicheldrüsen12eindringen können.
Intakte MDV Genome können in Plasmid-Vektoren, Plasmid-basierte infektiöse Klone produzieren subcloned; Wenn diese Klone in Mücke Zellen geliefert werden, das virale Genom wird gewonnen aus dem Plasmid-Vektor und infektiöse Viruspartikel produziert. Da MDV eine kleine SsDNA Genom hat, kann infektiöse Klone sind leicht gebaut und das virale Genom leicht manipulierbar11,13. Diese Eigenschaften machen MDV ein wertvolles Mittel für die Prüfung von Moskito-Biologie. Da fast alle das virale Genom-Sequenz ist unerlässlich für die virale Verbreitung, die Schaffung von rekombinanten Virus durch den Ersatz oder Einbau von fremden Genen verursacht jedoch einen Verlust in virale Verpackung und/oder Replikation Fähigkeiten schafft eine Hindernis für die Entwicklung der MDVs gen Lieferung Vektoren. Hier berichten wir mit einer künstlichen intronischen kleine RNA-Ausdruck-Strategie eine mangelfreie rAaeDV in Vivo RNA-Delivery-System zu entwickeln, die hat die Vorteile der einfachen Plasmid Bau und die Wartung eines funktionalen Virus, die produzieren kann stabile und langfristige Ausdruck in Wirtszellen ohne die Notwendigkeit der Wildtyp Virus. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode für die einfache Transduktion von Larven.
Die Protokolle für die folgenden Schritte werden in dieser Studie beschrieben: (1) Design der Codierung eine intronischen kleine RNA Expressionskassette, 2) die Produktion von rekombinanten Virus-Partikel mit der Verpackung Zelle C6/36 rAaeDVs Linie, Quantitative Analyse (3) der zellfreien rAaeDV Genom kopieren Zahlen und 4) Infektion von Ae. Albopictus Larven durch direkte Einschleppung des Virus in den Wasserkörper des larvalen Lebensraums. Insgesamt zeigte diese Arbeit, dass bestimmten kleinen RNAs oder Zielgene überexprimiert oder klopfte in Mückenlarven mit den entwickelten MDV-Delivery-System.
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Protocol
alle Protokolle wurden von den ethischen Komitees der Southern Medical University angenommen.
1. entwerfen eine künstliche Intron
Hinweis: die künstliche Intron in dieser Arbeit verwendeten ist 65 bp in der Länge, und die Reihenfolge ist 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.
- Legen die Hpa ich Beschränkung site an beiden Enden des künstlichen Intron so dass Hpa ich Verdauung kann loslassen das Intron aus Plasmide (siehe Abbildung 1 A).
- Legen Sie die zwei Xba ich Einschränkung Websites in der Intron so dass Xba ich Verdauung kann verwendet werden, um kleine RNA Ausdruck Sequenzen einfügen.
- Bestellen die chemische Synthese von durchgehenden DNA-Sequenzen der künstlichen Intron einem DNA-Hersteller. Das synthetische DNA erstellt von Klonen in ein Plasmid pUC19 standard ist.
Hinweis: Die wesentlichen Bestandteile der künstlichen Intron enthalten mehrere Konsens Nukleotid-Elemente, einschließlich einer 5 ' Spleiß Entnahmestelle (DS) mit der Sequenz GUAAGAGU, eine erhaltene Verzweigungspunkt Sequenz (BPS) mit der Sequenz UACUAAC, eine Poly-Pyrimidine Darm-Trakt (PPT) mit der Sequenz UCUUC(U) 10 und 3 '-Akzeptor Splice Site (AS) mit der Sequenz GAUAUCCUGCAG ( Abb. 1 A). Zwei Xba ich Restriktionsschnittstellen wurden zwischen DS und BPS, die einzufügende Ausdruck klein-RNA-Sequenzen verwendet werden kann. Die Möglichkeit dieser künstlichen Intron aus Säugetieren und Mücke Zellen effektiv Splice wurde zuvor bestätigten 14.
2. Gestaltung eines künstlichen intronischen kleine RNA Expressionskassette
Hinweis: Überexpression oder Knockdown von endogenen MiRNA, Sequenzen, die Codierung Precursor MiRNA oder MiRNA Schwamm zwischen DS und BPS eingefügt wurden. Um als Vorbild dienen, wählte man eine endogene Precursor MiRNA aus Ae. Albopictus Aal-Let-7, rekombinante virale Vektoren für MiRNA Überexpression und Zuschlag zu konstruieren. Ein let-7 Schwamm wurde nach zuvor beschriebenen Methoden 15 entwickelt. Um knock down Zielgene in Larven, entwarfen wir bestimmte künstliche MiRNA (AmiRNA) oder kurze Haarnadel (ShRNA) RNA-Sequenzen mit Onlinesoftware 16 , 17; als ein Beispiel, V-ATPase Untereinheit eine mRNA dienen (Beitritt nein. AY864912) wurde als ein Zielgen in dieser Studie ausgewählt. Die AmiRNA wird, als AmiVTP bezeichnet werden. Alle Sequenzen Details des Pre-MiRNA, Schwamm, AmiRNA und ShRNA werden in ergänzenden Tabelle1 beschrieben.
- Die chemische Synthese von in voller Länge cDNA-Sequenzen der Vorläufer MiRNAs, MiRNA Schwämme und ShRNA mit Xba bestellen ich Restriktionsschnittstellen an beiden Enden eines DNA-Herstellers.
- Nach Erhalt der bestellten DNS Spin die Rohre mit DNA-Blöcken bei 10.000-14.000 x g für 1 min um sicherzustellen, dass alle DNA getrocknet ist an der Unterseite des Rohrs.
- Aufschwemmen die getrockneten DNA in DNase-freies Wasser um eine Endkonzentration von 10 ng/µL zu erreichen.
- Verdauen das Plasmid-Rückgrat und DNA-Sequenzen mit Xba ich bei 37 ° C für 1 h und dann die 5 dephosphorylate ' Enden des linearisierten Plasmid-Backbones mit Kalb Darm alkalische Phosphatase (CIAP) nach Angaben des Herstellers ' s-Protokoll .
- Inaktivieren CIAP durch Erhitzen für 60 min bei 65 ° c
- Führen eine 1,0 % Agarosegel und schneiden das linearisierte Rückgrat. Ziehen Sie dann die DNA aus den Gel-Scheibe mit einem Gel Extraction Kit nach dem Hersteller ' Anweisungen s.
- Ligate das DNA-Fragment in der Backboneby-T4 DNA-Ligase (5 U/µL) bei 22 ° C für 1 h.
- Die Produkte der Ligatur Reaktion aus Schritt 2.7 in kompetenten Escherichia coli (E. Coli) Zellen und Platte auf einer Lysogeny Brühe (LB) Agarplatte mit Ampicillin (in einer Konzentration von 100 µg/mL) zu verwandeln.
- Führen die Transformation durch eine Hitze Schock Methode 18 und Nutzung der entsprechenden E. Coli-Stamm. Z. B. E. Coli-Stamm DH5α für Hitze Schock Transformation.
- Pick eine einzige Kolonie von 2,8 Schritt und inkubieren Sie in einer Kultur von 3 mL bereichert mittlere mit Ampicillin (in einer Konzentration von 100 µg/mL).
- Das Plasmid DNA extrahieren die Bakterienkultur mit einem Mini-Prep Kit nach dem Hersteller ' Anweisungen. Senden Sie die Probe auf eine DNA-Sequenzierung Unternehmen.
Hinweis: Für die Überexpression oder Knockdown von endogenen MiRNA, die Codierung Precursor MiRNA oder MiRNA Schwamm Sequenzen eingefügt wurden zwischen den beiden Xba ich Websites. Alle MiRNA Ausdruck oder Schwamm Konstrukte muss kürzer als 400 bp (10 % von der Länge des Virusgenoms) aufgrund der Verpackung Begrenzung des Virus 19.
3. Generierung von ein rAeaDV Konstrukt durch Klonen einer MiRNA oder ShRNA Expressionskassette in ein Plasmid-Backbone
Hinweis: pUCA, eine infektiöse Klon, bestehend aus einem pUCA Plasmid, das AaeDV Genom enthält (3.981 nt) 19, wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Jonathan Carlson und wurde zuvor im Detail 11 beschrieben. p7NS1-DsRed drückt eine nichttragende Protein 1 (NS1)-rot fluoreszierenden Proteins (DsRed) Schmelzverfahren Protein aus dem p7-Promotor und wurde 14 an anderer Stelle ausführlich beschrieben. Ein Mensch-spezifische MiR-941-1 Vorläufer- 20 und der Schwamm, eine verschlüsselte ShRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), waren auch in AaeDV als Negativkontrolle subcloned.
- Verbinden die Pre-MiRNA, Schwamm, ShRNA oder eine Expressionskassette AmiVTP in Hpa I Seite der AaeDV NS1-kodierende Region im pUCA Plasmid Rückgrat wie beschrieben im Protokoll Schritt 2,4 bis 2,7.
- Verwandeln sich die DNA in Stbl3 kompetenten E. Coli-Zellen und wählen Sie einen positiven Klon wie beschrieben im Schritt 2,8 bis 2.10.
- Im Anschluss an diese, entziehen die Bakterienzellen mit einem Maxi Prep Kit nach dem Hersteller der rAaeDV Plasmid ' Anweisungen s.
Hinweis: Für rAaeDV DNA-Transformation, unerwünschte ITR Rekombination zu minimieren sollten Stbl3 oder Stbl4 E. Coli Zellen genutzt werden. Maxi Vorbereitung sollte verwendet werden, um das Plasmid rAaeDV um eine große Menge an DNA zu erhalten zu extrahieren (> 100 µg). Vor der Generierung des Virus, die Sequenz-Integrität des Plasmids rAaeDV sollte immer durch DNA-Sequenzierung 21 analysiert werden.
4. Transfecting C6/36 Zellen mit rAaeDV Plasmide
- Kultur C6/36 Zellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin in einem Inkubator 28 ° C.
- Am Tag 0, Platte Zellen in zehn 25 cm 2 Kulturflaschen 18-20 h vor Transfektion durch die Spaltung von 90-95 % konfluierende Zellen in einer Verdünnung von 1:2.
Hinweis: Tag 1, die Zellen sollten erreichen 90-95 % Zusammenfluss. - Am 1. Tag, transfizieren die Zellen mit der Serie rAaeDV Plasmide 22.
- 10 µg DNA in 600 µL RPMI-1640 Medium in einem Microcentrifuge Schlauch zu verdünnen und vorsichtig mischen. Unterdessen bereiten 600 µL RPMI-1640 Medium und 25 µL Transfection Reagens pro Transfektion.
- Inkubation für 5-10 min bei Raumtemperatur (RT). Fügen Sie dann 625 µL des Gemisches 1640-Transfection Reagens, das 1640-Plasmid-DNA-Gemisch.
- Inkubieren Sie diese Mischung für 20-30 min bei RT Vor Transfektion, waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL RPMI-1640 Medium.
- Nach RT Inkubation (Schritt 4.3.3), 25 cm 2 Kultur Kolben the1640-Transfection Reagens DNA Plasmid Mischung hinzu und inkubieren Sie für 6 h bei 28 ° c
- Bei ca. 6 h nach Transfektion, entfernen die Transfektion Medien, waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL RPMI-1640 Medium, und fügen Sie RPMI-1640 Medium mit 10 % FBS.
Hinweis: rAaeDV zeigt hohe Rate der Infektion (95 %) in Ae. Albopictus Larven, aber nach unserer Erfahrung in fast 50 % der infizierten Larven, die Infektion beschränkte sich auf Primärinfektion Websites (z.B. anal Papillen und Borsten Zellen) ohne Verbreitung 23. Wenn besteht die Notwendigkeit, Larven in mehrere Gewebe zu infizieren, sollte ein defektes rekombinantes Virus mit dem Ausdruck fluoreszierenden Proteins Co-infizierte ermöglichen die Visualisierung der Infektion Websites daher. Zum Beispiel um defekte rekombinanten Virus mit dem Ausdruck DsRed zu produzieren, sollte p7NS1-DsRed Co transfected mit einem Helfer-Plasmid in C6/36 Zellen nach dem oben beschriebenen Verfahren werden (die Cotransfection-Konzentration-Verhältnis sollte 2:1).
5. Ernte rAaeDV Virionen aus transfiziert C6/36 Zellen
- Ernten der Zellen 5 Tage nach Transfektion. Verdrängen und die Zellen in den Gerichten durch eine 5 mL Glas Pipette Pipettieren rauf und runter mit dem Kulturmedium auszusetzen. Übertragen Sie alle Zellsuspensionen auf sterile 15-mL-Tuben.
- Einfrieren bei-80 ° C oder in einem Trockeneis/Ethanol-Bad für 30 min und dann Auftauen bei 37 ° C. Vortex für 1 min. die Gefrier-Tau-Prozedur 3 x wiederholen.
- Zentrifugieren die Probe bei 4.800 x g für 20 min bei 4 °C.Collect überstand und entsorgen das Pellet. Dann übergeben Sie des Überstands durch einen 0,22 µm Einwegspritze Filter. Aliquoten und laden die endgültige gereinigte Virion Aktien bei-80 ° c
Hinweis: Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-wechseln.
6. Quantifizierung der rAaeDV
- Vorbereitung der DNA-Normen. Alle rAaeDV-Plasmide mit Hpa linearisieren ich, und reinigen die verdauliche Produkte mit einem Gel Extraction Kit 24.
- Die absolute quantitative Standardkurve zu konstruieren und messen die Titer der Virus nach der zuvor beschriebenen Methoden 25.
7. Mosquito Transduktion
- Wash 100 1 St Instar Ae. Albopictus Larven dreimal mit entionisiertem Wasser, und übertragen Sie anschließend die Larven in ein Becherglas mit 95 mL entionisiertem Wasser. Geben Sie 5 mL der rAaeDV Aktien (Endkonzentration von 1,00 x 10 10 Kopien/mL).
- Brüten für 24 h bei 28 ° C, die Larven drei Mal mit entionisiertem Wasser zu waschen, und übertragen Sie dann die Larven zurück auf die Platten und regelmäßig zu ernähren.
- Überwachen die Ziel-gen-Expression in die Larven mit qPCR oder Western-Blot (Vertreter Ergebnisse, in den Figuren 3 und 4 angezeigt werden).
Hinweis: Die Fluoreszenz Signal Erkennungsmethode kann verwendet werden, um die infizierten Larven genauer zu isolieren. Beispielsweise um fluoreszierende Signale von Larven infiziert mit rekombinanten Virus mit dem Ausdruck DsRed zu erkennen, können die Larven auf eine Konkavität Folie gelegt und beobachtet unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop alle 8 Std. bis 2 Tage nach der Infektion. Sobald fluoreszierende Larven entdeckt werden, sollten sie in Kunststoff Einzeltest Tassen für anschließende kontinuierliche Beobachtung ermöglichen getrennt werden. Larven mit mehreren Gewebe infiziert mit dieser Methode identifiziert werden können.
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Representative Results
Strategien für rAaeDV Bau
Ein defekten rAaeDV Vektor wurde generiert, um die DsRed gen in Mückenlarven exprimieren. Die daraus resultierende Plasmid enthalten eine NS1-DsRed Fusion Protein Kassette mit dem VP-Protein gelöscht (Abb. 1A). rAaeDV Plasmide mit Ausdruck Konstrukte für MiRNA, wurden MiRNA Schwamm, ShRNA und AmiRNA (dargestellt in Abbildung 1B) ausgelegt. Zum Beispiel wurde ein rAaeDV-Vektor generiert, um Aal-Let-7 in Mückenlarven overexpress. Die daraus resultierende Plasmid enthalten eine intronischen Pre-Aal-Let-7-Kassette in das virale NS1 Exon (Abbildung 1B). RAaeDV Vektor, enthält eine Expressionskassette intronischen Aal-Let-7 Schwamm in das virale NS1 Exon wurde generiert, um knock down Aal-Let-7 Ausdruck in Mückenlarven (Abbildung 1B und Abbildung 2B). Ein rAaeDV ShRNA Vektor und ein rAaeDV AmiRNA Vektor mit intronischen ShRNA und Pre-AmiRNA Expressionskassetten wurden bzw. zur knock down V-ATPase mRNA in Mückenlarven (Abbildung 2C).
Berechnung der rAaeDV Titer, basierend auf einer Standardkurve mit der linearen Regressionsanalyse generiert
Die y-Achse entspricht dem Log10 Wert von molekularen Standardkonzentration DNA und die x-Achse zeigt die CT-Werte. Die CT-Zahlen (x-Achse) und Log10 (Konzentration) Werte (y-Achse) angezeigt, eine gute Korrelation (R2 = 0.9988) und erfüllen die Gleichung y = - 0.288 X + 13.87 (Abbildung 3). Berechnen Sie die rAaeDV-Titer von Proben unter Verwendung der linearen Gleichung (Tabelle 1). Mit der Methode des Protokolls (Schritt 6.2 und Tabelle 1), die hohe Titer von rAaeDV beschrieben (4 mL > 7,65 x 1010 Partikel/mL) geerntet wurden. Rekombinante Viren (VrepUCA-7, VrepUCA-7, VrepUCA-AmiVTP, VrepUCA-ShVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1 s und VrepUCA-Shct) wurden durch transfecting der entsprechenden Infektion Klone pUCA-7, pUCA-7 s, pUCA-AmiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1 s erzeugt, pUCA-Shct in C6/36 Zellen (Abschnitte 3, 4 und 5).
Ermitteln der MiRNA-Überexpression und Zuschlag-Effizienz der rAaeDV Vektoren
Im Beispiel Vektor 100 1St Instar Larven mit gleichen Mengen (1,00 x 1010 Partikel/mL) des rAaeDV, die intronischen pre-let-7 Expression enthält behandelt wurden, dem Expressionsvektor intronischen Let-7 Schwamm Mensch-spezifische Pre-miR-941-1 Expressionsvektor oder MiR-941-1 Schwamm Expressionsvektors durch Hinzufügen des Virus in den Wasserkörper des larvalen Lebensraums. Fünf Tage nach der Infektion, der Ausdruck der Aal-Let-7 wurde durch qPCR ermittelt (Abbildung 4, n = 3; Zusätzliche Tabelle 2). Der Let-7 Ebenen, die angezeigt werden, da bei den Larven der Mittelwert ± SD von drei biologischen repliziert wurden erheblich erhöht oder verringert durch die pre-let-7-mit dem Ausdruck rAaeDV (überexprimiert 2.843,31 ± 80.72 %, p < 0,0001, t-Test) und die Let-7-Schwamm-mit dem Ausdruck rAaeDV (herunterreguliert durch 74.78 ± 1,60 %, p < 0,0001, t-Test), beziehungsweise.
Überwachung der V-ATPase mRNA Knockdown Effizienz rAaeDV Vektoren
Insgesamt 100 1St Instar Larven, mit gleichen Mengen (1,00 x 1010 Partikel/mL) intronischen AmiRNA exprimierenden rAaeDV, intronischen ShRNA exprimierenden rAaeDV, Mensch-spezifische vor-miR-941-1-mit dem Ausdruck rAaeDV behandelt wurden Orscramble ShRNA exprimierenden rAaeDV durch Hinzufügen des Virus in den Wasserkörper des larvalen Lebensraums. Fünf Tage nach der Infektion, der Ausdruck von V-ATPase mRNA wurde durch qPCR ermittelt (Abbildung 5, n = 3; Zusätzliche Tabelle 2). Die V-ATPase angezeigt, wie bei den Larven der Mittelwert ± SD von drei biologischen repliziert wurde erheblich reduziert durch AmiRNA mit dem Ausdruck rAaeDV (herunterreguliert 43,01 ±6.37 %, p = 0.0011, t-Test) und intronischen ShRNA-mit dem Ausdruck rAaeDV (herunterreguliert durch 72.88 ± 5,74 %, p = 0,0001, t-Test).
Abbildung 1 : Schematische Organisation von den rekombinanten Plasmiden AaeDV. (A) die pNS und pVP virale Promotoren fahren bzw. Ausdruck des NS1/NS2 Gene und VP Gene. In das Plasmid p7NS1-DsRed war das DsRed gen mit dem NS1 gen verschmolzen. (B) pUCA-7, pUCA-7 s, pUCA-941-1, pUCA-941-1 s, pUCA-Shct, pUCA-ShVTP und pUCA-AmiVTP enthalten künstliche Introns, einschließlich der Aal-Let-7, Aal-Let-7 Schwamm, hat-MiR-941-1, hat-MiR-941-1 Schwamm, Rührei ShRNA, V-ATPase ShRNA und künstliche MiRNA, bzw. die in der Hpageklont wurden I Seite des Gens NS1. Die künstliche Intron wird flanked durch ein Spleiß-Spender (DS) und ein Akzeptor-Ort (AS) und enthält ein Verzweigungspunkt Domäne (BrP), Poly-Pyrimidine Trakt (PPT) und ein Pre-MiRNA. Die MiRNA Schwamm oder künstliche MiRNA Sequenz steckt im Inneren der Intron zwischen der 5-Splice-Site und BrP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Biogenese der künstlichen intronischen MicroRNA (MiRNA) und Strategie zur Erzeugung von MiRNA Schwämme und künstliche MiRNAs. (A) intronischen MiRNA ist Co transkribierten innerhalb einer Vorstufe Boten-RNA (Pre-mRNA) des NS1, angetrieben vom Veranstalter pNS1 und aus der Pre-mRNA durch RNA-Spleißen gespalten wird. Obwohl die Exons ligiert sind, um einen Reifen Boten-RNA (mRNA) für NS1-Protein-Synthese zu bilden, ist die gespleisste Intron mit Pre-MiRNA von Dicer in Reife MiRNA weiterverarbeitet. (B) Strategie zur Erzeugung der let-7 und anti-miR-941-1 Konstrukte. Ausrichtung des let-7 und anti-miR-941-1 Sequenzen mit Aal-Let-7 und hat-MiR-941-1, beziehungsweise. Vollständige Anpassung der Saatgut-Regionen mit den Anti-MiRNA-Sequenz und Tail-Regionen wird angezeigt. Let-7 und MiR-941-1 Schwämme enthalten drei wiederholten antisense-Konstrukte (roten Buchstaben), die Aal-Let-7 und hat-MiR-941-1, bzw. binden können. (C) Sequenzen und vorhergesagten Vorläufer Strukturen für die MiRNA-basierten künstlichen MiRNAs und ShRNA in dieser Studie verwendet. Die ausgereifte künstliche MiRNAs und ShRNA werden in rot angezeigt, und ihre damit verbundenen Ziel-mRNA-Sequenzen sind in blau. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Standardkurve für rAaeDV Titration und der berechneten ConceNtrations der MDVs. (A) in Echtzeit qPCR erfolgte mit einem pUCA standard, die durch 10 Mal den Abbildungsmaßstab verdünnt wurde, und der C-T -Wert wurde auf eine ABI 7500 xgemessen. Exemplarzahl wurde gemäß Schritt 6.2 und 6.3 mit folgender Formel berechnet: Kopieren Sie Nummer (y) =-0.288X + 10,87; R2 = 0.9988. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Überexpression rekombinanter MDV-vermittelten Aal-Let-7 und Zuschlag in Ae. Albopictus Larven. (A) Analyse der endogenen MiRNA Ausdruck in Larven nach Infektion mit rekombinanten Virus, enthält die Aal-Let-7 Expressionskassette (linken). (B) die Effizienz des anti-let-7 Konstrukt wurde in Larven (rechte Abbildung) ermittelt. Hat-MiR-941-1 und hat-941-1 Schwamm (Negativkontrolle) überexprimiert und herunterreguliert Reifen lassen-7-MiRNAs, bzw. im Vergleich zu den basalen Ebenen in der Kontrollgruppe beobachtet. MiRNA Fülle wurde auf 5 s rRNA normalisiert, und die Daten werden angezeigt, wenn der Mittelwert ± SD von drei biologischen repliziert. T-Tests wurden an verschiedenen Bedeutungsebenen durchgeführt. Die Sternchen zeigen statistisch signifikante Unterschiede zwischen den infizierten und entsprechenden Mock-behandelten Larven (vier Sternchen, p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Analyse von V-ATPase mRNA Ausdruck nach Infektion mit rekombinanten Virus ShRNA und AmiRNA Kassetten enthalten. mRNA Fülle war auf aalrpS7 normalisiert. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der 2−ΔΔCT Werte für V-ATPase mRNA Expression in der Ae. Albopictus Larven wie von Real-Time RT-PCR bewertet (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: Die rekombinante MDV C T von qPCR ermittelte Wert entspricht der x Wert in der Formel zur Berechnung der y Wert. Die virale Genom Kopienzahl in jeder 1 µL Probe erhielt durch die Funktion macht (10, y), die letztlich mit 40 multipliziert wurde, den Wert in der Viruskonzentration des Virus Aussetzung konvertieren.
Zusätzliche Tabelle 1: Sequenzen von MiRNA Vorläufer.
Zusätzliche Tabelle 2: qPCR Daten.
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Discussion
Es ist wichtig, zwei der wichtigsten Hindernisse zu überwinden, die rAaeDV Konstruktion zu begrenzen. Die erste ist die Produktion von defekten rekombinanten Virus. Es wurde berichtet, dass MDV als ein Vektor angemessen zum Ausdruck bringen fremde Gene, wie Skorpion Insekt-spezifische neurotoxins20 und das GFP-Protein Größe verwendet werden kann; aber unabhängig von der Aufbau-Strategie, können nicht sobald die ORFs MDV eingefügt oder mit exogenen Gene ersetzt Virionen selbständig bilden, wenn ein Helfer Plasmid cotransfected ist, um die fehlenden unverzichtbare virale Proteine liefern. Das defekte Virus ist nicht in der Lage zu beteiligen, sekundäre Übertragung, die in Vivo in Mücken mit defekten Genome auftritt. Unsere Ergebnisse bestätigen eine intronischen Ausdruck-Strategie, die ein neues Paradigma anbietet, das Überwindung der Grenzen der MDVs mit defekten Genome ermöglichen die effiziente Bereitstellung von Fremdgenen in Mücken können.
Die zweite ist die anspruchsvolle Längenbegrenzung des rekombinanten Virusgenoms auferlegt durch die Größe des viralen Kapsid. Effiziente Verpackung kann der Genomgröße 4.400 Nukleotide (110 % der Länge des wt MDVs Genoms) nicht überschreiten. Ein intronischen MiRNA Expressionskassette (einschließlich MiRNA Expressionskassette und künstliche Intron) von nicht mehr als 400 nt in das Genom des AaeDV eingeführt werden kann. Obwohl die Länge des rekombinanten Virus Genoms noch geeignet für Verpackungen, hat dieses Liefersystem Raum für Verbesserungen. Wegen der Beschränkung im Genom Länge ist es schwierig, ausdrückliche Gene ohne Defekte intronischen Ausdruck Strategien.
Es ist unbedingt darauf zu achten, dass C6/36 Zellen gesund sind die erfolgreichen Transfektion und Verpackung von rAaeDV ermöglichen. Die kationischen Liposomen Reagenzien und kommerziellen Insekt Zell-spezifische Transfektion Reagenzien jedoch nicht verbessern die Effizienz der C6/36 Zelle Transfektion (40-60 %). Um hohe Titer rekombinanten Virus zu ernten, ist es daher notwendig, die Zellen für 5 Tage nach Transfektion anhand der zuvor beschriebenen Wachstum Eigenschaften14beizubehalten. Darüber hinaus ist es für erfolgreiche Larven Infektion unerlässlich für Larven in Kontakt mit infektiösen Viruspartikeln für 24–36 h hohe Infektion Verhältnisse23sicherzustellen.
Zusammenfassend ist die hier beschriebene Strategie zur intronischen Ausdruck die erste, die Barrieren von der Generation der defekten MDV zu überwinden. Diese Strategie ermöglicht die Produktion von mangelfreien rekombinante MDVs, die overexpress können oder Downregulate MiRNAs und Ziel Gene in Mücken. Diese Technik bietet ein Tool für die funktionelle Analyse von Moskito Gene ohne den Einsatz von komplizierten Larven Mikroinjektion Verfahren und hat klare kommerzielle Anwendungen. Weitere Studien werden die Anwendung der beschriebenen Ausdruck Strategie, Moskito-Biologie und Paratransgenesis für Dengue-Virus unter Kontrolle zu untersuchen erweitern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen finanziellen Unterstützung von National Key Research and Development Program of China (2016YFC1200500, Xiao Guang Chen), der National Natural Science Foundation of China (81672054 und 81371846), das Team Forschungsprogramm des natürlichen Science Foundation von Guangdong (2014A030312016), und die wissenschaftliche und technologische Programm von Guangzhou (201508020263). Wir erkennen dankbar Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) für freundlicherweise die pUCA und p7NS1-GFP Plasmide und kritisch lesen dieses Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
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