Summary
פרוטוקול זה מספק הוראה עבור דגימות וירוס מכתים שלילי אשר יכול בקלות לשמש במעבדות BSL-2, -3, -4 או -4. הוא כולל את השימוש בקפסולה עיבוד חדשנית, אשר מגן על רשת אלקטרונים שידור מיקרוסקופיה ומספק למשתמש טיפול קל יותר בסביבות סוערות יותר בתוך biocontainment.
Abstract
מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) משמש כדי לבחון את התשתית של וירוסים ופתוגנים פתולוגיים אחרים עם רזולוציה ננומטר. רוב החומרים הביולוגיים אינם מכילים אלמנטים צפופים המסוגלים לפזר אלקטרונים כדי ליצור תמונה; לכן, כתם שלילי, אשר מציב מלחי מתכת כבדים צפופים סביב המדגם, נדרש. כדי לדמיין וירוסים ההשעיה תחת TEM הם חייבים להיות מיושמים על רשתות קטנות מצופה משטח שקוף רק ננומטר עבה. בשל גודלם הקטן שבריריות, רשתות אלה קשה להתמודד בקלות עברו זרמי אוויר. משטח דק פגום בקלות, משאיר את המדגם קשה או בלתי אפשרי התמונה. וירוסים זיהומיים חייבים להיות מטופלים בארון biosafety (BSC) וחלקם דורשים סביבה מעבדה biocontainment. וירוסים מכתים ברמות biosafety (BSL) -3 ו -4 הוא מאתגר במיוחד כי סביבות אלה הם יותר סוערים טכנאים נדרשיםO ללבוש ציוד מגן אישי (PPE), אשר מקטין מיומנות.
במחקר זה, הערכנו מכשיר חדש כדי לסייע בוירוס מכתים שלילי biocontainment. המכשיר הוא כמוסה שפועלת כמו טיפ פיפטה מיוחדים. לאחר הרשתות נטענות לתוך הקפסולה, המשתמש פשוט שואף ריאגנטים לתוך הקפסולה כדי לספק את הנגיף ואת הכתמים לרשת encapsulated, ובכך ביטול טיפול המשתמש של רשתות. למרות טכניקה זו תוכננה במיוחד לשימוש BSL-3 או -4 biocontainment, זה יכול להקל על הכנת המדגם בכל סביבת מעבדה על ידי הפעלת מכתים שלילי קל של הנגיף. שיטה זו יכולה גם להיות מיושם להכין דגימות TEM שלילי מוכתם של חלקיקים, מקרומולקולות ודגימות דומות.
Introduction
מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הוא כלי יעיל לצפייה מורפולוגיה ו ultrastructure של דגימות ביולוגיות כי הם קטנים מדי כדי להיראות עם מיקרוסקופ אור מסורתי 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs לירות electrons דרך דגימה דקה מאוד לייצר תמונה ברזולוציה גבוהה כמו האלקטרונים יש אורך גל קצר בהרבה מאשר אור. אזורים של המדגם כי לכופף או לחסום אלקטרונים מופיעים כהה, ואילו אזורים כי הם אלקטרונים lucent מופיעים לבן.
חוסר חומר צפוף אלקטרונים עושה וירוסים קשה להציג תחת TEM כי הם לא יכולים לפזר אלקטרונים. מכתים שלילי היא השיטה הנפוצה ביותר המשמש ליצור ניגודיות וירוסים עם נוף TEM. ההליך הראשון של מכתים שלילי הוצע על ידי ברנר ו הורן בשנת 1959, מבוסס על ניסוי שבו הול (1955) ו Huxley (1957)נראה את המראה של מבנים ביולוגיים בניגוד הפוך כאשר שקוע בחומר צפוף אלקטרונים 5 . תהליך של מכתים שלילי כבר כמעט ללא שינוי במהלך חצי המאה האחרונה. מכתים שלילי כרוך בקצרה יישום פתרון מלח מתכת כבד מדגם ברשת TEM בניסיון להקיף את הנגיף עם חומר צפוף ללא חדירת הנגיף 6 . זה יוצר גבול כהה חושף את הצורה של החלקיקים 5 . מחקר זה משתמש בשני ריאגנטים עבור מכתים שליליים, אורניל אצטט (UA) וחומצה phosphotungstic אשלגן (PTA). שני כתמים אלה משמשים בדרך כלל כתם שלילי דגימות ביולוגיות קטנות, כגון וירוסים, קומפלקסים חלבונים, וחלקיקים 7 , 8 , 9 .
הטכניקה קונבנציונאלי שלילי מכתים הוא טיפה ידנית שלילית מכתים טק7 . שיטה זו דורשת טיפול מדויק של קטנים, שברירי רשתות TEM עם מלקחיים ליישם כמויות קטנות של מדגם וירוסים, כתם, שטיפות. פרוטוקול הכנה טיפוסי כרוך החלת טיפת ההשעיה מדגם על פני השטח של רשת מצופה TEM הסרט ( איור 1 א ). לאחר ההתקשרות של המדגם למשטח הסרט, הרשת שטופה כדי להסיר וירוסים שאינם דביקים ומוכתמים עם UA או PTA למשך כמה שניות עד דקה, בהתאם לסוג המדגם. עודף נוזלים הוא מרושע מן הרשת על ידי נגיעה פיסת נייר סינון לקצה הרשת.
השיטה ידנית טיפות דורש כל רשת להיות בנפרד. אם לא מטופלים בזהירות, רשתות TEM מצופה נקב בקלות, כפוף, או מזוהמים. עיבוד דגימות מרובות יכול להוביל קשיים במעקב אחר הרשתות ולהבטיח מכתים עקביים עבור כל מדגם. הליך זה מכתים ידני הוא הרבה יותר דכאשר הוא מתבצע במעבדות ביו-בטיחותיות (BSL) -3 ו -4 ביו-מעבדות, בשל ציוד המגן האישי הנדרש (PPE) הנדרש עבור סביבות אלה. PPE הוא מסורבל הסביבה biocontainment הרבה יותר סוער לעומת מעבדה רגילה. כוח אדם העובד במעבדות Biocontainment BSL-3 נדרש ללבוש 2 זוגות של כפפות ולעבוד בארון biosafety (BSC). שכבה כפולה של כפפות מפחית רגישות מישוש ומגביל התנועה המנועית בסדר. זרימת האוויר של BSC כי מגן על המשתמש ומסייע במניעת זיהום מדגם יכול לגרום דגימות וכתמים להתייבש מהר מדי ובכך להשפיע על איכות הכתם. זרימת האוויר הסוערת חזקה ב BSC יכול גם לפוצץ במהירות את הרשת כי הוא לא מאובטח היטב. במעבדות ביו-שכבת BSL-4 קיימות דרישות בטיחות נוספות. כוח אדם נדרש ללבוש חליפת לחץ חיובית, אשר מגבילה עוד יותר תנועה פיזית ואת היכולת לראות בבירור וללכתUle רשתות. הטכנאי העובד ב BSL-4 לובש לפחות 2 זוגות כפפות, כאשר הצמד החיצוני הוא כפפה עבה אשר מקטינה באופן משמעותי את המיומנות ואת תחושת המישוש. לבסוף, מלקחיים המשמשים להתמודד עם רשתות TEM חדים, ובכך מהווה סיכון לטכנאי בשל יכולתם לנקב כפפות. עם כמוסות המכילות רשתות, מלקחיים הם לא הכרחי, ובכך לספק בטוח, מלקחיים ללא אלטרנטיבה עבור מניפולציה רשתות biocontainment. לבסוף, כמוסות גם לספק דרך יעילה לאחסן רשתות במהלך עיבוד, אודיום אדי טיהור, ובמהלך אחסון; ובכך לשמור על רשתות מאורגן ובטוח מפני נזק.
בדו"ח זה, אנו מציגים שיטה חדשה עבור רשתות מכתים שליליות של TEM במעבדות biocontainment כי מנצל mPrep / g כמוסות, מכשיר מבוסס על הקפסולה לטיפול ברשת מכתים 10 , 11 , 12 . הקפסולה מתאימהModates שתי רשתות TEM, ממזער טיפול ישיר, ומקטין את פוטנציאל נזק לרשת. הקפסולה מייחסת ישירות פיפטה אחת או רב באותו אופן כמו קצה פיפטה, המאפשר יישום של נוזלים שונים לרשת הכלולה. זה מאפשר הכנה סימולטנית של דגימות מרובות עם רשתות כפולות ( איור 1 ב ). כתם שלילי עם כמוסות המדגם וירוס הוא aspirated לתוך הקפסולה והחזיק במשך 10 דקות לתת וירוסים adsorb על פני הרשת. הרשתות עם וירוסים adsorbed נשטפים לאחר מכן עם מים deionized (dI) ומוכתמים או UA או PTA במשך כמה שניות עד 1 דקות. תהליך זה עושה שימוש באותו פרוטוקול צעדים ריאגנטים כמו שיטת טיפות ידני; ההבדל הוא שכל העבודה מתרחשת בתוך הקפסולה ללא טיפול פיזי של הרשתות. ( תרשימים 1C , 1D ).
מטרת המחקר הייתה להעריך כמוסותשיטה חדשה מכתים שלילי של דגימות וירוס בסביבות biocontainment. מחקר זה בחן גם את איכות תמונות TEM המיוצר משני הליכים שונים של מניעת הנגיף: 1) איון מהיר, עם 1% אדי tetroxide אוסמיום, ו 2) 24 שעות inactivation עם glutaraldehyde 2%. שניהם נערכו באמצעות הכמוסות. לבסוף, הערכנו שני כתמים שליליים נפוצים, UA ו- PTA, לשימוש בקפסולה. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ניסוי הכנה בסביבת BSL-2 לפני עבודה עם דוגמאות וירוסים
- הכן או לרכוש Formvar ופחמן מצופים TEM רשתות נחושת, בדרך כלל 200-400 רשת.
- הכנס את רשתות TEM מצופה לתוך כמוסות.
- השתמש בעדשה מוגדלת כדי להפוך את התהליך הזה קל לביצוע. רשת אחת או שתיים ניתן להכניס לתוך כל כמוסה. טרום טעון קפסולות ניתן לרכוש כדי לבטל את שלב זה אם תרצה.
- מעבירים את הכמוסות עם רשתות TEM מצופה מוכנס, יחד עם חומרים אחרים ריאגנטים, כדי biocontainment שבו הווירוסים יהיו מוכתמים שלילית.
2. שיטת הקפסולה עבור מכתים שלילי Biocontainment באמצעות Glutaraldehyde מימית ו 1% אוסמיום Tetroxide אדי איטום
- בתוך biocontainment BSC, לשאוב 40 μL ההשעיה וירוס לתוך הקפסולה המצורפת פיפטה.
הערה: פיפטה נשאר מחובר thE כמוסה עד להשלמת התהליך. הכנת וירוסים היא על פי הפרסום הקודם שלנו 14 . - מניחים את פיפטה בצד שלה במשך 10 דקות עם רשתות בכיוון אופקי. זה כדי לקדם הפצה אפילו של חלקיקי הנגיף על גבי רשתות מצופים.
- לנטרל את הנגיף בתוך הקפסולה בתוך bococontainment BSC.
- להרים את פיפטה ו לדכא את הבוכנה כדי לוותר על פתרון וירוס לתוך מיכל פסולת.
- לשאוב 40 μL של מקבע glutaraldehyde 2% לתוך כמוסות.
זהירות: Glutaraldehyde הוא כימי מסוכנת דורש הגנה מתאימה. Glutaraldehyde ניתן להשתמש בתקופות קצרות ב BSC נורמלי, אבל מגיב פתוח מורחב דורש לעבוד BSC צינור או כיבוי קטר כימי. - מניחים את פיפטה על הצד שלה במשך 20 דקות. זה כדי להבטיח דגימות הם קבועים היטב.
- לגרש את מקבע לשאוב 40 μL של מים dI לתוך כמוסות wאפר משם מקבע. חזור על צעד זה לשטוף עבור סך של 3 מחזורי שטיפה.
- לשאוב 40 μL של 1% uranyl אצטט (UA) או 1% אשלגן חומצה phosphotungstic (PTA) לתוך כמוסות ולאפשר לשבת במשך 30 שניות.
הערה: זמן הכתמה עשוי להשתנות מ 10 שניות עד 1 דקות מבוסס על מדגם וירוס.
זהירות: UA הוא פולט אלפא, ורעל מצטבר. לטפל בו עם הגנה מתאימה. - הסר את הקפסולה מן פיפטה כתם לייבש את הרשתות על ידי נגיעה פיסת נייר סינון לקצה של רשתות בעוד רשתות להישאר בתוך הקפסולה.
- אוסמומי Tetroxide אדי תהליך איטום.
- מניחים את הקפסולה, עם מכסה פתוח, לתוך צינור 50 צנטריפוגה מ"ל המכיל נייר מסנן ספוג תמיסת tetroxide אוסמיום 1%.
זהירות: tetroxide אוסמיום הוא רעיל מאוד עם לחץ אדים נמוך. זה חייב לשמש BSC צינור או כימיים קטר כיפה. לטפל בו עם הגנה מתאימה. פרסם אזהרהמידע בתחום העבודה. - חותם צינור 50 מ"ל צנטריפוגות עבור 1 שעות כדי לאפשר חדירה מלאה של אדי tetroxide אוסמיום. לאחר מכן, לאחר מכן לטהר ולהעביר את הצינור מתוך biocontainment למתקן BSL-2 EM.
- מניחים את הקפסולה, עם מכסה פתוח, לתוך צינור 50 צנטריפוגה מ"ל המכיל נייר מסנן ספוג תמיסת tetroxide אוסמיום 1%.
- הסר רשתות EM מן הקפסולה.
- במתקן BSL-2 EM, להסיר את הקפסולה מצינור צנטריפוגות ומניחים אותו על פיפטה.
- לשאוב 40 μL של מים dI לתוך הקפסולה ולהחלק את המים לתוך מיכל פסולת שלוש פעמים.
- הסר את הקפסולה מן פיפטה כתם לייבש את הרשתות באמצעות נייר סינון לגעת בקצה הרשתות.
- לאחר ייבוש האוויר, לאחסן את הרשתות עבור הדמיה TEM לאחר מכן.
3. שיטת הקפסולה עבור איטום בביו-שכנוע עם Glutaraldehyde 2%, ואחריו מכתים שלילי במעבדה BSL-2
- נוהל וירוסים.
- להשבית וירוסים עם מקבע עבור מינימום של 24 שעות לפני האריזה, טיהור, ולהעביר אותו למתקן BSL-2 EM.
הערה: זה כדי לקדם הפצה אפילו של חלקיקי הנגיף על גבי רשתות TEM.
הערה: זמן מכתים השתנה מ 10 שניות עד 1 דקות על סמך מדגם וירוס.
זהירות: UA הוא פולט אלפא, ורעל מצטבר. לטפל בו עם הגנה מתאימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטת הקפסולה לייצר מכתים שלילי באיכות טובה עבור הדמיה TEM:
ראשית, הערכנו את איכות התמונות שנוצרו על ידי שימוש הן שיטת טיפה ידני ושיטות כמוסה עבור מכתים שלילי ebolavirus זאיר. Ebolaviruses הם חברים של Filoviridae המשפחה, יחד עם וירוס Marburg. Ebolavirus הוא בדרך כלל 80-100 ננומטר בקוטר יכול להיות מעל 1000 ננומטר אורך. Ebolavirus חייב להיות מטופלים בסביבת BSL-4 biocontainment. איור 2 מציג תמונות שנוצרו באמצעות שיטת טיפות ידני שיטת הקפסולה עבור מכתים שליליים. איור 2 א (שיטת טיפות ידני) ואיור 2B (שיטת הקפסולה) להראות דוגמאות ebolavirus כי יש להגדיר בבירור פרטים עם מבנים nucleocapsid במרכז virion, וגליקופרוטין גלוי ebolavirusעל פני השטח. לכן, הן הקפסולה ושיטות טיפה יש את היכולת לייצר תמונות באיכות דומה TEM.
השווה ולהעריך איכות תמונה EM לאחר איון מהיר עם glutaraldehyde מימית ואדים 1% tetroxide אוסמיום לעומת 24 שעות inactivation עם 2% glutaraldehyde מימית, תוך שימוש בשיטה הקפסולה:
אנו העריכו את איכות התמונות TEM שנוצר משני שיטות שונות של איון מדגם באמצעות וירוס Chikungunya. וירוס Chikungunya הוא חבר של סוג Alphavirus ב Togaviridae המשפחה. זה כדורית עם קוטר של 60-70 ננומטר. Virion מכיל מעטפה עשירה גליקופרוטאינים אשר יוצרים קוצים trimeric על פני השטח ויראלי. וירוס Chikungunya יש לטפל ב BSL-3. איון מהיר מושגת באמצעות glutaraldehyde 2% במשך 20 דקות ואחריו חשיפה 1 שעות ל 1% אוסמומי tetroxide אוסמיום, עם השלילה כולהתהליך מכתים ative המתרחשים בתוך קפסולה בתוך BSC במעבדה biocontainment ( איור 1 ג ). עם זאת, כאשר משתמשים 2% glutaraldehyde עבור 24 שעות כדי להשבית את הנגיף, האי - אקטיבציה מתרחשת בתוך סביבה biocontainment, אבל 1% UA כתם שלילי כתם מתבצעת באמצעות שיטת הקפסולה במעבדה BSL-2 ( איור 1D ). הליכי אי-פעילות אלה אינם מייצרים את אותן תמונות איכותיות ( איור 3 ). ברור באיור 3 כי קיבעון glutaraldehyde ללא נוכחות של tetroxide אוסמיום ( איור 3 א , 3B ) מראה פרטים ultrastructural יותר מדגמים מוכן עם glutaraldehyde ו tetroxide אוסמיום ( איור 3 ג , 3D ).
שיטת הקפסולה פועלת היטב באמצעות אצטט Uranyl (UA) ו פוספ חומצה otungstic (PTA) כתמים שליליים עבור דגימות קבוע אלדהיד.
דוגמאות של מכתים שלילי UA ו PTA באמצעות שיטת הקפסולה מוצגים בתרשים 4 על אלדהיד קבוע וירוס כמו חלקיקים (VLPs). VLPs הם חלבונים התאספו לתוך מבנים כמו וירוסים, אך אינם מכילים כל חומר גנטי נגיפי. הם משמשים בדרך כלל בפיתוח חיסונים למחקר ויראלי בסיסי. מכתים שלילי הוא כלי רב ערך כדי להעריך VLP הרכבה מורפולוגיה. השתמשנו הן UA ו PTA עבור מכתים שלילי של VLPs עם שיטת הקפסולה. שני כתמים להציג תוצאות באיכות גבוהה עם גליקופרוטאינים גלויים גבולות מוגדרים בבירור של אבולה ננו VLPs 15 ( איור 4A , 4B ) ו Murine לוקמיה VLPs 16 ( איור 4C , 4D ).
בעמודה = "1"> 
איור 1: סקירה של שיטות שליליות של מכתים. ( א ) שיטת טיפה ידני מבוצע על ידי רצף נע רשתות TEM מ טיפות טיפה של הדגימה, שטיפות וכתמים. ( ב ) הגדרת שיטת הקפסולה עם רשתות ויישום ההשעיה מדגם. ( ג ) נוהל אופייני באמצעות שיטת הקפסולה biocontainment עם איון לטווח קצר עם אדי 1% tetroxide אוסמומי. ( ד ) נוהל מומלץ באמצעות שיטת הקפסולה biocontainment עם איון לטווח ארוך עם glutaraldehyde 2%. איור פורסם בעבר ושימוש חוזר עם הרשאות מתוך התייחסות 13 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Er.within-page = "1"> 
איור 2: השוואה של 1% PTA שלילי Ebolavirus שלילי חלקיקים. ( א ) מוכתם שלילי עם שיטת טיפות ידני. ( ב ) כתמים שליליים בשיטת הקפסולה. איור פורסם בעבר ושימוש חוזר עם הרשאות מתוך התייחסות 13 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: 1% מכתים שלילית UA עם שיטת הקפסולה של וירוס Chikungunya באמצעות נהלים שונים איון. ( A , B ) עבור מינימום של 24 שעות עם glutaraldehyde 2% בלבד. ( C ,ד) מהיר איון עם glutaraldehyde 2% ו 1% אוסמומי tetroxide אדי. איור פורסם בעבר ושימוש חוזר עם הרשאות מתוך התייחסות 13 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: דוגמאות של חומצה Phosphotungstic (PTA) ו Uranyl אצטט (UA) שלילי מוכתם וירוסים כמו חלקיקים (VLPs) באמצעות שיטת הקפסולה. ( A ) סקירה ההגדלה נמוכה של 1% PTA מוכתם ebola ננו VLPs. ( B ) הגדלה תמונה TEM מראה פרטים מבניים של PTA מוכתם ebola ננו- VLPs. ( ג ) סקירה כללית של הגדלה נמוכה של 1% UA מוכתם Murine לוקמיה VLPs. ( D ) הגדלה גבוהה תמונה TEM מראה מבנית detAils מוכתם של לוקין VLPs לוקמיה עם glycoprotein ebolavirus על פני השטח שלהם. איור פורסם בעבר ושימוש חוזר עם הרשאות מתוך התייחסות 13 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מכתים שלילית היא טכניקה TEM יקר להערכת ו אומדת וירוסים, קומפלקסים חלבונים וחלקיקים. הכנה דגימה של דגימות אלה על ידי הזזת ידני של רשתות מגיב לכתמים שליליים כבר פרוטוקול קלאסי במשך יותר מחצי מאה. זהו תהליך פשוט, אך דורש מומחיות שנרכשו באמצעות הכשרה להשלמה מוצלחת. מכתים שלילי מעולה נחשב עדיין המדינה- of-the-art מיומנות להגדיר הרצוי ביותר במעבדות TEM רבים. השיטה הקפסולה יש יתרונות ברורים על פני שיטת טיפות ידני, במיוחד במעבדות biocontainment. ראשית, שיטת טיפה ידנית דורש הכשרה משמעותית וניסיון לפני זה יכול להתבצע בהצלחה, בעוד קל לשימוש בשיטה הקפסולה ניתן להשיג על ידי טכנאים ברמת הכניסה על ידי pipetting פשוטה. האתגר הגדול ביותר עם שיטת טיפת ידני הוא טיפול מוצלח ברשתות TEM עם מלקחיים BSL-3 ו BSL-4 PPE עקבO את תחושת המישוש מופחת מאוד מיומנות. שביר מצופה רשתות TEM ניזוקו בקלות או נקבצו על ידי מלקחיים. נזק לרשת TEM מצופה לעתים קרובות לא נחשף עד שהוא נצפה עם TEM. יתרון שני של כמוסות הוא כי רשתות TEM מטופלים רק ישירות כאשר הם מוכנסים לתוך כמוסות וכאשר הם מוסרים להכנסת לתוך המיקרוסקופ אלקטרונים. בין אם עובד במעבדה biocontainment או במתקן BSL-2 EM, אין טיפול ישיר ברשת. יתרון שלישי של שיטת הקפסולה הוא כי שני הצדדים של הרשת מכוסים וירוסים וכתמים. זה יכול להיות שימושי כאשר ריכוז המדגם הוא נמוך; אולם זה יכול לגרום מדגם יותר מדי אם הריכוז הוא גבוה, או לגרום דילול המדגם לפני השימוש.
שלילי מכתים רשתות מרובות באמצעות טכניקה אגל ידני הוא זמן רב, כי כל מדגם צריך להיות מוכן ומוכתם בנפרד. זה מוביל לקשיים getaiNing עקבי, מכתים לשחזור. יתר על כן, מעקב אחר רשתות בודדות רבות הוא תמיד אתגר. כל קפסולה מחזיקה שתי רשתות, כמוסות רבות ניתן לחבר פיפטה רב, לייעל את התהליך. לכן, כמוסות להבטיח כי רשתות מוכתמות בתהליך דומה מאוד, בתנאים מדגם עקבית, באותו זמן. כמוסות יכול להיות שכותרתו כדי לסייע בארגון, ובכך להפחית את הפוטנציאל ערבוב או misidentification של רשתות. בעיה נפוצה נוספת מתמודדת בעת שימוש בשיטה ידנית טיפות הוא זיהום רשת. זה יכול להתרחש כאשר רשתות נשארים באוויר הפתוח במשך זמן רב מדי או הם ירדו. הקפסולה מגנה על רשתות ה- TEM מהאוויר הפתוח ומחזיקה אותן בצורה בטוחה, כך שהן לעולם לא יירדו. כמוסות לספק שליטה ניסויית רבה יותר הדירות בעת הכנת מכתים שלילי כי הקפסולה היא סביבה מבוקרת יותר.
את הקפסולות ניתן לרכוש טעון מראש אם דהSired. טעינה ידנית של רשתות לתוך כמוסות לוקח קצת תרגול כדי להבטיח רשתות לא ניזוקו. שיטת הקפסולה גם דורש מעט יותר מדגם וכתם מאשר שיטת טיפות ידני. השיטה הקפסולה דורשת לפחות 40 μL של המדגם, לעומת שיטת טיפות ידני, אשר ניתן לעשות עם מעט כמו 8 μL.
נגיף הוירוס הוא חלק חשוב של מכתים שלילי ב BSL-3 ו BSL-4, שכן הוא מאפשר את הנגיף לא פעיל להיות נלקח מתוך מעבדות biocontainment עבור הדמיה במתקן EM. לנטרול באמצעות מקבע יש את היתרון הנוסף של תיקון הנגיף, מניעת השפלה. ישנן שתי דרכים שונות להשבית את המדגם הנגיף, אשר שניהם נבדקו במחקר זה. הראשון דבק את הנגיף לרשתות TEM מצופה, מתקן את וירוסים במשך 20 דקות בפתרון glutaraldehyde 2%, ואחריו חשיפה 1 שעות של הרשת לאדים tetroxide אוסמיום ( איור 1C ). זה אינו פעיליון השיטה היא יתרון כי זה חוסך זמן על ידי הפעלת המדגם להיות נלקח מתוך מעבדה biocontainment לאחר 1 שעה ו 20 דקות. זה גם מונע דילול של וירוס לפני היישום לרשת TEM מצופה, ולכן זה עשוי להיות נחוץ עבור דגימות חשודים להיות ליד גבול זיהוי TEM. עם זאת, 1% אוסמומי tetroxide אדי מפחית את איכות תמונות TEM כמו אוסמיום יכול להמשיך הכתם המדגם ( איור 3 ). דוחות קודמים מראים חשיפה 5 דקות לאדים tetroxide אוסמיום מספק תוצאות מצוינות כאשר מכתים שלילי; עם זאת, חשיפה ארוכה יותר הנדרשת עבור ביטול ויראלי מוחלט שנוצר תערובת של מכתים חיובי ושלילי 17 . שיטת מניעת השני כרוך מינימום של 24 שעות בפתרון glutaraldehyde 2%, ואינו דורש טיפול אדי tetroxide אוסמיום ( איור 1D ). שיטה זו דורשת זמן רב יותר כדי להשלים את המדגם אינו מוסר מן laboc biocontainmentRatory עבור 24 שעות, אבל יכול להיות יתרון כי זה מאפשר מכתים שלילי להיעשות מחוץ biocontainment בסביבת BSL-2, ומבטל את הצורך tetroxide אוסמיום מסוכנים. התוצאות שלנו מראות כי 24 שעות של חוסר פעילות glutaraldehyde מייצרת תמונות TEM באיכות גבוהה יותר מאשר כאשר דגימות מטופלים עם אדי tetroxide אוסמיום ( איור 3 ).
שני נימים שליליים שימשו בניסוי זה: UA ו- PTA. שני הכתמים משמשים כפתרון של 1%. UA, מלח אצטט של אורניום, עובד גם כתם שלילי כי אטומי אורניום צפופים מתפזרים אלקטרונים 5 . PTA, חומצה הטרופולית, דומה עובד גם כתם שלילי עקב אטומי טונגסטן צפופה 5 . PTA הוא העדיף לפעמים מעל UA כי זה הרבה פחות רעיל, ורק מגרה קלה אם בשאיפה או פנה. כאשר מכתים שליליים מכתים דגימות, ה- pH נמוך של UA חייב להיחשב כפי שהוא יכול לגרום נזק tO המדגם. הווירוסים המשמשים בניסוי זה דורשים קיבוע עבור אי-פעילות, כך שגם ה- UA וגם ה- PTA השיגו תוצאות דומות ולא ניתן היה לזהות יתרון ברור עבור הכתם. שניהם כתמים קל לעבוד עם, והם שניהם לייצר תמונות באיכות דומה TEM ( איור 4 ).
בסך הכל, שיטת הקפסולה היא קלה יותר לשימוש בסביבה biocontainment והוא יכול לשמש כחלופה שיטה ידנית טיפה. שימוש בקפסולות מקל מדגם מניפולציה מדגם תשואות באיכות טובה תמונות TEM. התמונות המיוצרות באמצעות שיטת הקפסולה דומים לתמונות המיוצרות באמצעות שיטת טיפות ידני. נגיף וירוסים קצר עם tetroxide אוסמיום משפר את המהירות, אבל יש להשתמש רק אם איכות התמונה מופחתת מקובל, או שהוא חשוד דילול הנגיף ישים אותו מתחת להגביל את הגילוי TEM עבור ההליך. הן UA ו PTA לספק תוצאות דומות עם דגימות וירוס קבוע המשמש במחקר זה; הוWever, התוצאות עשויות להיות שונות כאשר מכתים וירוסים לא מסודרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות המופיעות במאמר הן אלה של המחברים ואינן נתמכות בהכרח על ידי צבא ארצות הברית או משרד ההגנה.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ולהודות לד"ר ג'ון קארה ולרוואנה שוקמן על מתן ננו-אבולה ננו-VLP, ד"ר רג'יני מודסני על מתן וירוס צ'יקונגוניה, וד"ר צ'ארלס (ג'ייסון) סנדלר על מתן מורלין לוקמיה VLPs המבטאים גליקופרוטאינים של Ebolavirus. כמו כן, ברצוננו להודות ל- MAJ Carl Carl Soffler על הקלת תכנית ההתמחות של הקיץ (SIP) ועל תכנית החניכות למדע והנדסה (SEAP) ולד"ר קתרין וילהלמן על אימון בטיחות המעבדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/f couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L.
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E.
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
