Summary
Bu protokol, BSL-2, -3 veya -4 laboratuarlarında kolaylıkla kullanılabilen negatif boyama virüsü örnekleri için talimatlar sağlar. İletim elektron mikroskobu şebekesini koruyan ve biyokontainmenta giren daha çalkantılı ortamlarda kullanıcıya daha kolay taşıma olanağı sağlayan yenilikçi bir işleme kapsülü de dahildir.
Abstract
İletim elektron mikroskobu (TEM), virüslerin ve diğer mikrobik patojenlerinin nanometrenin çözünürlüğünü gözlemlemek için kullanılır. Çoğu biyolojik materyal, elektron saçarak görüntüyü oluşturmak için yoğun elementler içermez; Bu nedenle, yoğun ağır metal tuzlarını numune etrafına yerleştiren negatif bir leke gereklidir. Askıdaki virüsleri TEM altında görselleştirmek için sadece nanometre kalınlığında şeffaf bir yüzeye sahip küçük ızgaralara uygulanmalıdır. Küçük boyutları ve kırılganlıklarından dolayı, bu ızgaraları tutmak zordur ve hava akımlarıyla kolayca taşınırlar. İnce yüzey kolayca hasar görebilir ve numuneyi görüntü zorlaştırır ya da imkansız hale getirir. Bulaşıcı virüsler, biyogüvenlik kabininde (BSC) ele alınmalı ve bazıları biyolojik kontaminasyon laboratuar ortamına ihtiyaç duymaktadır. Biyogüvenlik düzeyleri (BSL) -3 ve -4'deki boyama virüsü, özellikle bu ortamlar daha çalkantılı olduğu ve teknisyenlere ihtiyaç duymaları nedeniyle zorlayıcıdır.• Kişisel becerileri azaltan kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin.
Bu çalışmada, biyolojik kontaminasyonda negatif boyama virüslerine yardımcı olacak yeni bir cihaz değerlendirildi. Cihaz, özel bir pipet ucu olarak çalışan bir kapsüldür. Izgaralar kapsüle yüklendikten sonra, kullanıcı virüsleri ve lekeleri kapsüllenmiş ızgaraya dağıtmak için reaktifleri kapsüle aspire eder, böylece ızgaraların kullanıcı tarafından taşınmasını ortadan kaldırır. Bu teknik BSL-3 veya -4 biyokontainment için özel olarak tasarlanmış olmasına rağmen, virüsün kolay negatif boyanmasını sağlayarak herhangi bir laboratuar ortamında numune hazırlamayı kolaylaştırabilir. Aynı yöntem, nanoparçacıkların, makromoleküllerin ve benzeri örneklerin negatif boyalı TEM numunelerini hazırlamak için de uygulanabilir.
Introduction
İletim elektron mikroskopisi (TEM), geleneksel ışık mikroskopu 1 , 2 , 3 , 4 ile görülemeyecek kadar küçük olan biyolojik örneklerin morfolojisini ve altyapısını görüntülemek için etkili bir araçtır. Elektronların ışıktan çok daha kısa bir dalga boyuna sahip olduğu için TEM'ler, elektronları çok ince bir numuneyle vurarak daha yüksek çözünürlüklü bir görüntü üretir. Elektronları kirleten veya bloke eden örneklerin bölgeleri karanlık, elektron lucent olan bölgeler beyaz renktedir.
Elektron yoğun maddelerin olmaması, virüsleri bir TEM altında görmek zorlaştırır, çünkü elektronları dağıtamazlar. Negatif boyama, TEM ile kontrast oluşturmak ve virüsleri görüntülemek için kullanılan en yaygın yöntemdir. İlk negatif boyama prosedürü Hall (1955) ve Huxley'in (1957) gözlem yaptığı bir deney temelli 1959'da Brenner ve Horne tarafından önerildiBir elektron-yoğun bir madde 5 batırıldığında ters aksine biyolojik yapıların görünüşünü ved. Negatif boyama süreci, son yarım asır boyunca neredeyse hiç değişmedi. Negatif boyama kısaca virüsü 6 infiltre olmadan yoğun bir malzeme ile virüs çevreleyen için bir girişimde bir TEM ızgara üzerinde bir numuneye bir ağır metal tuzu çözeltisi uygulanmasını kapsar. Bu, koyu bir kenar oluşturur ve parçacığın şeklini ortaya çıkarır 5 . Bu çalışma negatif boyama için iki reaktif, uranil asetat (UA) ve potasyum fosfotungstik asit (PTA) kullanmaktadır. Bu lekelerin her ikisi de, virüsler, protein kompleksleri ve nanopartiküller 7 , 8 , 9 gibi küçük biyolojik örnekleri olumsuz şekilde lekelemek için sıklıkla kullanılır.
Geleneksel negatif boyama tekniği manuel damlacık negatif boyama teknolojisiNezaket 7 . Bu yöntem küçük miktarlarda virüs örneği, leke ve durulama uygulamak için forsepsle hassas, küçük, kırılgan TEM ızgaralarını kullanmayı gerektirir. Tipik hazırlama protokolü, bir film kaplı TEM şebekesinin yüzeyine örnek süspansiyon damlacıklarının uygulanmasını içerir ( Şekil 1A ). Numunenin film yüzeyine tutturulmasından sonra, ızgara yapışkan olmayan virüsleri gidermek için durulandı ve numunenin türüne bağlı olarak birkaç saniye ila bir dakika için UA veya PTA ile boyandı. Aşırı sıvı, ızgaranın kenarına bir filtre kağıdına dokunarak ızgaradan uzaklaşır.
Manuel damlacık yöntemi, her bir ızgaranın ayrı ayrı yapılması gerekliliğini belirtir. Dikkatle ele alınmazsa, kaplamalı TEM ızgaraları kolayca delinir, bükülür veya kontamine olur. Birden çok numunenin işlenmesi, ızgaraları izlemek ve her numune için tutarlı boyamayı sağlamakta zorluklara neden olabilir. Bu elle boyama prosedürü çok daha fazla dBu ortamlar için gerekli olan kişisel koruyucu ekipman (KKD) nedeniyle biyogüvenlik seviyesi (BSL) -3 ve -4 biyolojik kontaminasyon laboratuvarlarında yürüttüklerinde güçlük çekmektedir. KKD hantaldır ve biyokontainment ortamı düzenli bir laboratuara kıyasla çok daha çalkantılıdır. BSL-3 biyolojik kontaminasyon laboratuarlarında çalışan personelin 2 çift eldiven giymesi ve biyogüvenlik kabininde (BSC) çalışması gerekiyor. Bu çift kat eldiven dokunma duyarlılığını azaltır ve ince motor hareketini kısıtlar. Kullanıcıyı koruyan ve numunenin kirlenmesini önlemeye yardımcı olan BSC'nin hava akışı, örneklerin ve lekelerin çok çabuk kurumasına ve böylece leke kalitesinin bozulmasına neden olabilir. BSC'deki güçlü türbülanslı hava akışı, iyi korunmayan bir ızgarayı da çabucak uzaklaştırabilir. BSL-4 biyolojik kontaminasyon laboratuarlarında ek güvenlik gereklilikleri vardır. Personelin, fiziksel hareketi ve açıkça görme ve manipüle etme kabiliyetini kısıtlayan pozitif basınç giymeyi giymesi gerekiyorUlate ızgaraları. BSL-4'te çalışan teknisyen de en az 2 çift eldiven giyiyor; dış çift eldiven ve dokunsal duyumu büyük ölçüde azaltan kalın eldiven. Son olarak, TEM ızgaralarını tutan forsepsler keskin olduğundan, teknisyene eldivenlerini delme yetenekleri nedeniyle bir risk oluşturuyor. Izgara içeren kapsüller ile, forseps gerekli değildir, böylece biyolojik kontaminasyonda ızgaraları manipüle etmek için forsepsten muaf bir alternatif sağlar. Son olarak, kapsüller aynı zamanda işleme, osmiyum buhar dekontaminasyonu ve depolama sırasında ızgaraları depolamak için etkili bir yol sağlar; Böylece ızgaraları düzenli ve hasar görmeden muhafaza eder.
Bu raporda, mPrep / g kapsüller, ızgara kullanım ve 10, 11, 12 lekelenmesi için bir kapsül bazlı cihaz kullanan biyolojik sınırlama laboratuarlarında negatif boyama TEM ızgaraların için yeni bir yöntem sunar. Kapsül kayitlariİki TEM ızgarasını değiştirir, direkt kullanımını en aza indirir ve ızgara hasarı olasılığını azaltır. Kapsül, içinde bulunan ızgaralara çeşitli sıvıların uygulanmasına izin verecek şekilde, bir pipet ucu gibi doğrudan tek veya çok kanallı bir pipete bağlanır. Bu, çoğaltılmış ızgaralarla birden çok numunenin aynı anda hazırlanmasını sağlar ( Şekil 1B ). Kapsüllü negatif lekeye virüs örneği kapsül içine aspire edilir ve virüslerin ızgaralı yüzeylere adsorbe olmasını sağlamak için 10 dakika bekletilir. Adsorbe edilen virüslü ızgaralar daha sonra deiyonize (dI) su ile yıkanır ve birkaç saniye ila 1 dakika boyunca UA veya PTA ile boyanır. Bu işlem, manuel damlacık yöntemi ile aynı protokol adımlarını ve reaktifleri kullanır; Fark, tüm işlerin ızgaraların fiziksel olarak ele alınması olmadan kapsül içinde gerçekleşmesidir. ( Şekil 1C , 1D ).
Bu çalışmanın amacı, kapsüllerinBiyokontainment ortamlarında virüs örneklerinin negatif boyanması için yeni bir yöntem. Bu çalışma ayrıca, iki farklı virüs inaktivasyon prosedüründen üretilen TEM görüntülerinin kalitesini inceledi: 1)% 1 osmiyum tetroksit buharı ile hızlı inaktivasyon ve 2)% 2 glutaraldehitle 24 saat inaktivasyon. Her ikisi de kapsülleri kullanarak gerçekleştirildi. Son olarak, yaygın olarak kullanılan negatif lekeleri, UA ve PTA'yi kapsülde kullanmak için değerlendirdik. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Virüs Örnekleri ile Çalışma Yapmadan Önce Bir BSL-2 Ortamında Deney Hazırlama
- Formvar ve karbon kaplı TEM bakır ızgaraları hazırlayın veya satın alın, genellikle 200-400 mesh'dir.
- Kaplanmış TEM ızgaralarını kapsüllere yerleştirin.
- Bu işlemi gerçekleştirmek kolaylaştırmak için büyütülmüş bir mercek kullanın. Her bir kapsüle bir veya iki ızgaralar takılabilir. İstenirse, bu adımı ortadan kaldırmak için önceden yüklenmiş kapsüller satın alınabilir.
- Eklenmiş TEM kaplamalı ızgaralı kapsülleri, diğer malzemeler ve reaktiflerle birlikte, virüslerin olumsuz olarak lekelenebileceği biyolojik kaplara aktarın.
2. Sulu Glutaraldehit ve% 1 Osmiyum Tetroksit Buharı İnaktivasyonu Kullanan Biyokontainment Sırasındaki Negatif Boyama İçin Kapsül Yöntemi
- Biyokontainment BSC içinde, pipetle takılı kapsüle 40 μL virüs süspansiyonu aspire edin.
Not: pipet bağlı kalırE kapsülü tamamlanana kadar. Virüs hazırlığı bir önceki yayımıza 14 göre yapılır. - Yatay olarak yönlendirilmiş ızgaralar ile pipeti 10 dakika yan yatırın. Bu, virüs parçacıklarının kaplamalı ızgaralara eşit dağılımını sağlamaktır.
- Biyokontainment BSC içindeki kapsül içindeki virüsü etkisiz hale getirin.
- Virüs solüsyonunu bir atık kabına boşaltmak için pipeti alıp pistona basınız.
- Kapsüllere 40 μL% 2 glutaraldehit sabitleyici aspire edin.
Dikkat: Glutaraldehit tehlikeli bir kimyasaldır ve uygun bir koruma gerektirir. Glutaraldehit, normal bir BSC'de kısa süreli olarak kullanılabilir, ancak uzatılmış açık reaktif, kanallı bir BSC veya kimyasal duman davlumbazında çalışmayı gerektirir. - Pipeti 20 dakika boyunca yan yatırın. Bu, örneklerin iyi sabitlenmesini sağlamaktır.
- Fiksatifi dışarı atın ve 40 μL dI suyun kapsüllere asılması için suyunu boşaltın.Katılan fiksatif maddeyi. Bu yıkama adımını toplam 3 durulama çevrimi için tekrarlayın.
- % 1 uranil asetat (UA) veya% 1 potasyum fosfotungstik asit (PTA) 40 uL'yi kapsüllere aspire edin ve 30 saniye boyunca bekletin.
NOT: Boyama zamanı, virüs numunesine göre 10 saniyeden 1 dakikaya kadar değişebilir.
Dikkat: UA, bir alfa yayıcı ve birikimli toksindir. Uygun koruma ile tutun. - Kapsül pipetten çıkarın ve ızgaralar kapsülde kalırken ızgaranın kenarına bir filtre kağıdına dokunarak ızgaraları kurutun.
- Osmium Tetroksid Buhar inaktivasyon prosedürü.
- Kapsülü, kapak açıkken,% 1 osmiyum tetroksit solüsyonuna batırılmış filtre kağıdı içeren 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
Dikkat: Osmiyum tetroksit, düşük buhar basıncı ile son derece toksiktir. Kanallı BSC veya kimyasal duman davlumbazında kullanılmalıdır. Uygun koruma ile tutun. Mesaj uyarısıÇalışma alanında bilgi. - Osmiyum tetroksit buharı tamamen nüfuz edebilmek için 50 ml'lik santrifüj tüpünü 1 saat boyunca mühürle. Ardından, biyokontainmentten tüpü dezenfekte edin ve BSL-2 EM tesisine aktarın.
- Kapsülü, kapak açıkken,% 1 osmiyum tetroksit solüsyonuna batırılmış filtre kağıdı içeren 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
- EM ızgaraları kapsülden çıkarın.
- BSL-2 EM tesisinde, kapsülü santrifüj borusundan çıkarın ve pipet üzerine yerleştirin.
- Kap içine 40 uL dI su emdirin ve suyu üç kez bir atık kabına boşaltın.
- Kapsül pipetten çıkarın ve ızgaraların kenarına dokunmak için ızgaraları filtre kağıdı ile kurutun.
- Hava ile kurutulduktan sonra, ızgaraları sonraki TEM görüntüleme için saklayın.
3. Bir BSL-2 Laboratuvarında Negatif Boyanmayı takiben% 2 Glutaraldehit ile Biyokontainment'ta İnaktivasyon Kapsül Yöntemi
- Virüs inaktivasyon prosedürü.
- Virüsleri, paketlemeden önce en az 24 saat fiksatif ile etkisiz hale getirin, dekontaminasyon ve BSL-2 EM tesisine aktarın.
NOT: Bu, TEM ızgaralarına virüs partiküllerinin eşit dağılımını sağlamak içindir.
NOT: Boyama süresi, virüs numunesine göre 10 saniyeden 1 dakikaya kadar değişir.
Dikkat: UA, bir alfa yayıcı ve birikimli toksindir. Uygun koruma ile tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kapsül yöntemi, TEM görüntüleme için kaliteli negatif boyama üretir:
Birincisi, manuel damlacık yöntemi ve negatif Zeire ebolavirüs lekelenmesi için kapsül yöntemleri kullanılarak üretilen görüntülerin kalitesini değerlendirdik. Ebolavirüsler Marburg virüsü ile birlikte Filoviridae ailesinin üyeleridir. Ebolavirüs genellikle çapı 80 ila 100 nm arasında olup 1000 nm'nin üzerinde olabilir. Ebolavirüs BSL-4 biyolojik kontaminasyon ortamında ele alınmalıdır. Şekil 2 , manuel damlacık yöntemi ve negatif boyama için kapsül yöntemi kullanılarak üretilen görüntüleri göstermektedir. Şekil 2A (elle damla yöntemi) ve Şekil 2B (kapsül yöntemi), virionun merkezinde nükleokapsid yapıları ile açıkça tanımlanmış detaylara sahip ebolavirüs örneklerini ve görünür ebolavirüs glikoproteini göstermektedirYüzeyde. Dolayısıyla, hem kapsül hem de damlacık yöntemleri, benzer nitelikte TEM görüntüleri üretme kabiliyetine sahiptir.
Kapsül metodu kullanılarak sulu glutaraldehit ve% 1 osmiyum tetroksit buharına karşı hızlı inaktivasyondan sonra EM görüntü kalitesini karşılaştırın ve% 2 sulu glutaraldehit ile 24 saat inaktivasyon yapın:
Chikungunya virüsünü kullanarak iki farklı numune örneklerinin inaktifleştirilmesinden elde edilen TEM görüntülerinin kalitesini değerlendirdik. Chikungunya virüsü, Togaviridae familyasındaki Alphavirus cinsinin bir üyesidir. 60-70 nm çapında küreseltir. Virion, viral yüzeyde trimerik sivri uçlar oluşturan glikoproteinler bakımından zengin bir zarf içeriyor. Chikungunya virüsü BSL-3'te ele alınmalıdır. Hızlı inaktivasyon, 20 dakika boyunca% 2 glutaraldehid kullanılarak ve bunu takiben% 1 osmiyum tetroksit buharı ile 1 saat süreyle maruz bırakılarak sağlanır, tüm negatifBiyolojik kontaminasyon laboratuarında bir BSC içinde bir kapsülde meydana gelen biyolojik boyama işlemi ( Şekil 1C ). Bununla birlikte, virüsü etkisiz hale getirmek için 24 saat süreyle% 2 glutaraldehit kullanıldığında, inaktif bir biyokontainment ortamında meydana gelir ancak% 1 UA negatif leke prosedürü, bir BSL-2 laboratuvarında kapsül metodu kullanılarak gerçekleştirilir ( Şekil 1D ). Bu inaktivasyon prosedürleri aynı kalitede görüntüler üretmez ( Şekil 3 ). Şekil 3'ten açıkça görüleceği üzere, glutaraldehitte osmiyum tetroksit ( Şekil 3A , 3B ) bulunmayan sabitleme, glutaraldehit ve ozmiyum tetroksit ile hazırlanan örneklere kıyasla daha fazla ultrastrüktürel ayrıntı göstermektedir ( Şekil 3C , 3D ).
Kapsül yöntemi, Uranil asetat (UA) ve fosfatAldehit sabit numuneler için negatif lekeler olarak otungstik asit (PTA).
Kapalı yöntemi kullanarak UA ve PTA negatif boyamanın örnekleri, Şekil 4'te aldehit sabit virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) üzerinde gösterilmektedir. VLPler, virüs benzeri yapılara monte edilen proteinlerdir, ancak viral genetik materyal içermezler. Genellikle aşı geliştirme ve temel viral araştırmalar için kullanılırlar. Negatif boyama, VLP montajını ve morfolojisini değerlendirmek için değerli bir araçtır. Kapsül yöntemi ile VLP'lerin negatif boyanmasında UA ve PTA kullandık. Her iki leke, Ebola nano-VLP'lerin 15 ( Şekil 4A , 4B ) ve Murin Lösemi VLP'lerinin 16 ( Şekil 4C , 4D ) sınırları glikoproteinleri ile görünür ve net bir şekilde tanımlanmış haliyle yüksek kalitede sonuçlar verir.
Şekil 1: Negatif Boyama Yöntemlerine Genel Bakış. ( A ) Manuel damlacık yöntemi, TEM gridlerini damla damla örnek damlasına, durulamalara ve lekelere sırayla hareket ettirerek gerçekleştirilir. ( B ) Izgaralarla kapsül yönteminin hazırlanması ve örnek süspansiyon uygulaması. ( C )% 1 osmiyum tetroksit buharı ile kısa süreli inaktivasyon ile biyokontainmentta kapsül yöntemini kullanan tipik prosedür. ( D )% 2 glutaraldehid ile uzun süreli inaktivasyon ile biyokontainmentte kapsül yöntemini kullanarak önerilen prosedür. Şekil, daha önce yayınlanmış ve referans 13'deki izinlerle yeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2:% 1 PTA Negatif Boyalı Ebolavirüs Parçacıklarının Karşılaştırılması. ( A ) Negatif lekeli manuel damla yöntemi ile. ( B ) Kapsül metodu kullanılarak negatif boyanmıştır. Şekil, daha önce yayınlanmış ve referans 13'deki izinlerle yeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Farklı İnaktivasyon Prosedürlerini Kullanan Chikungunya Virüsü Kapsül Yöntemiyle% 1 UA Negatif Boyama. ( A , B ) sadece% 2 glutaraldehitle minimum 24 saat inaktivasyon. ( C ,D)% 2 glutaraldehit ve% 1 osmiyum tetroksid buharıyla hızlı inaktivasyon. Şekil, daha önce yayınlanmış ve referans 13'deki izinlerle yeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Kapsül Yöntemi Kullanılarak Fosfo-toungstik asit (PTA) ve Uranil Asetat (UA) Negatif Boyalı Virüs-Benzeri Parçacıkların (VLP'ler) Örnekleri. ( A )% 1 PTA lekeli ebola nano-VLP'lerin düşük büyütülmüş genel görünümü. ( B ) PTA boyalı ebola nano-VLP'lerin yapısal ayrıntılarını gösteren yüksek büyütme TEM görüntüsü. ( C )% 1 UA lekeli Murin Lösemi VLP'lerinin düşük büyütülmüş genel görünümü. ( D ) Yapısal deteksiyon gösteren yüksek büyütmeli TEM görüntüsüUA'lar, lezyonlu Murin Lösemi VLP'lerini yüzeyinde ebolavirüs glikoprotein ile boyadı. Şekil, daha önce yayınlanmış ve referans 13'deki izinlerle yeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Negatif boyama, virüsleri, protein komplekslerini ve nanoparçacıkları değerlendiren ve boyutlandıran değerli bir TEM tekniğidir. Bu örneklerin reaktiften negatif lekelere manuel olarak hareket ettirilmesiyle damlacık hazırlanması, yarım yüzyıla kıyasla klasik bir protokoldür. Bu basit bir süreçtir, ancak başarıyla tamamlanması için eğitim yoluyla edindiği uzmanlığı gerektirir. Mükemmel negatif boyama hala pek çok TEM laboratuarında son teknoloji beceri seti olarak düşünülmektedir. Kapsül yöntemi, özellikle biyokonsolidasyon laboratuvarlarında manuel damlacık yöntemine göre birkaç avantaja sahiptir. Birincisi, manuel damlacık yöntemi başarıyla gerçekleştirilebilmesi için önemli bir eğitim ve deneyim gerektirirken, kapsül yönteminin kullanımı kolay giriş seviyesi teknisyenler tarafından basit pipetleme ile gerçekleştirilebilir. Manuel damlacık yöntemi ile en büyük zorluk BSL-3 ve BSL-4 PPE'de forseps ile TEM gridleri başarılı bir şekilde kullanmaktır.O Büyük ölçüde azaltılmış dokunma hissi ve beceriden. Kırılgan kaplı TEM ızgaraları forseps ile kolayca hasar görebilir veya delinebilir. Kaplamalı TEM ızgaranın hasar görmesi çoğu zaman bir TEM ile görüntülendiğinde ortaya çıkmaz. Kapsüllerin ikinci bir avantajı, TEM ızgaralarının sadece kapsüllere yerleştirildiğinde ve elektron mikroskopu içine yerleştirilmek üzere çıkarıldıkları zaman doğrudan ele alınmasıdır. Biyokontainment laboratuarında veya BSL-2 EM tesislerinde çalışsın, doğrudan ızgara kullanımı yok. Kapsül yönteminin üçüncü bir avantajı ızgaranın her iki tarafının da virüs ve lekelerle kaplanmasıdır. Bu örnek konsantrasyonu düşük olduğunda yararlı olabilir; Bununla birlikte, konsantrasyon yüksekse bu çok fazla numuneye neden olabilir veya numunenin kullanımdan önce seyreltilmesine neden olabilir.
Manuel damlacık tekniğini kullanarak çoklu ızgaraların negatif olarak boyanması zaman alıcıdır, çünkü her numunenin ayrı olarak hazırlanması ve lekelenmesi gerekir. Bu zorluklara neden olur obtaiTutarlı, yeniden üretilebilir boyama. Ayrıca, birçok bireysel ızgarayı takip etmek her zaman zorlayıcıdır. Her bir kapsül iki ızgaraya sahiptir ve çoklu kapsüller çok kanallı bir pipete tutturulabilir ve böylece süreç düzene sokulabilir. Bu nedenle, kapsüller, ızgaraların tutarlı örnek koşulları altında ve aynı zamanda aynı yöntemle lekelenmesini sağlar. Kapsül organizasyona yardımcı olacak şekilde etiketlenebilir ve böylece ızgaraların karıştırılması veya yanlış tanımlanması olasılığı azaltılır. Manuel damlacık yöntemini kullanırken karşılaşılan diğer bir yaygın sorun, ızgaralı kirliliktir. Izgaralar açık havada çok uzun süre bırakıldığında veya düşürüldüğünde ortaya çıkabilir. Kapsül, TEM ızgaraları açık havadan korur ve asla düşürülemeyecek şekilde güvenli bir şekilde tutar. Kapsül, hazırlanırken daha fazla deneysel kontrol ve tekrarlanabilirlik sağlar ve kapsül daha kontrollü bir çevre olduğundan negatif boyanır.
Kapsüller önceden yüklenmişse satın alınabilirler.sired. Izgaraların elle kapsüllere yüklenmesi ızgaraların hasar görmediğinden emin olmak için bazı pratiklere ihtiyaç duyar. Kapsül yöntemi, manuel damlacık yönteminden biraz daha fazla numune ve leke gerektirir. Kapsül yöntemi, manuel damlacık yöntemine kıyasla en az 40 μL numune gerektirir ve bu miktar 8 μL kadar az yapılabilir.
Virüs inaktivasyonu, inaktive virüsün EM tesisindeki görüntüleme için biyolojik kontaminasyon laboratuarlarından çıkarılmasına izin verdiği için, BSL-3 ve BSL-4'te negatif boyamanın önemli bir parçasıdır. Fiksatifleri kullanarak inaktivasyon, virüsün sabitlenmesinin, bozulmayı önlemenin ek bir yararıdır. Virüs numunesini inaktive etmek için iki farklı yol vardır, her ikisi de bu çalışmada incelenmiştir. Birincisi, virüsü kaplı TEM ızgaralarına yapışır, virüsleri% 2'lik bir glutaraldehid solüsyonunda 20 dakika sabitler ve bunu takiben ızgaranın osmiyum tetroksit buharına maruz kalması sağlanır ( Şekil 1C ). Bu inaktivatIyon yöntemi avantajlıdır, çünkü saati 1 saat 20 dakika sonra biyokontainment laboratuarından çıkarıp zaman kazandırır. Ayrıca, kaplamalı TEM şebekesine uygulanmadan önce virüsün seyreltilmesini önler, bu nedenle TEM tespit sınırına yakın olduğu düşünülen numuneler için gerekli olabilir. Bununla birlikte, osmiyum numuneyi daha da lekeleyebileceğinden,% 1 osmiyum tetroksit buharı TEM görüntülerinin kalitesini düşürür ( Şekil 3 ). Önceki raporlar, osmiyum tetroksit buharı ile 5 dakika maruz bırakıldığında, negatif boyama sırasında mükemmel sonuç verir; Bununla birlikte, mutlak viral deaktivasyon için daha uzun süre maruz kalma pozitif ve negatif boyama 17 karışımını üretmiştir. İkinci inaktivasyon yöntemi,% 2 glutaraldehid solüsyonunda en az 24 saat içerir ve osmiyum tetroksit buhar işlemi gerektirmez ( Şekil 1D ). Bu ikinci yöntem, örnek biyokontainment laboasından kaldırılmadığından tamamlanması daha uzun sürmektedir24 saat boyunca bekletilir, ancak negatif boyanın bir BSL-2 ortamında biyokontainment dışında yapılmasına ve tehlikeli ozmiyum tetroksit ihtiyacının ortadan kaldırılmasına neden olacağından avantajlı olabilir. Sonuçlarımız, 24 saatlik glutaraldehit inaktivasyonunun, osmiyum tetroksit buharı ile muamele edildiğinden daha yüksek kaliteli TEM görüntüleri ürettiğini göstermektedir ( Şekil 3 ).
Bu deneyde iki olumsuz leke kullanıldı: UA ve BKA. Her iki leke de% 1'lik bir solüsyon olarak kullanılır. UA, uranyumun asetat tuzu, olumsuz bir leke gibi iyi çalışır, çünkü yoğun uranyum atomları elektronları 5 dağlar. Bir heteropoli asit olan PTA, yoğun tungsten atomları 5 nedeniyle negatif bir leke kadar benzer şekilde çalışır. Bazen UA'ya kıyasla PTA daha çok tercih edilir, çünkü daha az toksiktir ve solunması veya teması halinde hafif bir tahriş edicidir. Negatif boyama, sabitlenmemiş numuneler olduğunda, UA'nın daha düşük pH'ı, hasara neden olabileceği için düşünülmelidir tO numune. Bu deneyde kullanılan virüslerin etkisiz hale getirilmesi için sabitlenmesi gerektiğinden UA ve PTA hem benzer sonuçlar elde etti hem leke için belirgin bir avantaj tespit edilemedi. Her iki lekenin de kullanımı kolaydır ve her ikisi de benzer kalite TEM görüntüleri üretir ( Şekil 4 ).
Genel olarak, kapsül yöntemi bir biyokontainment ortamında daha kolaydır ve manuel damlacık metoduna bir alternatif olarak kullanılabilir. Kapsüllerin kullanılması numune manipülasyon kusurlarını hafifletir ve kaliteli TEM görüntüleri verir. Kapsül yöntemi kullanılarak üretilen görüntüler manuel damla yöntemi kullanılarak üretilen görüntülerle karşılaştırılabilir. Osmiyum tetroksit ile kısa virüs inaktivasyonu hızını artırır, ancak azaltılmış görüntü kalitesi kabul edilebilirse veya virüs seyreltilerek prosedür için TEM tespit sınırının altına düşeceğinden şüpheleniliyorsa kullanılmalıdır. Hem UA hem de BKA, bu çalışmada kullanılan sabit virüs numuneleri ile benzer sonuçlar vermektedir; hoAncak, sabitlenmemiş virüsleri boyarken sonuçlar farklı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Makalede belirtilen görüş, yorum, sonuç ve tavsiyeler yazarların görüşleri olup, ABD Ordusu ya da Savunma Bakanlığı tarafından onaylanmayabilir.
Acknowledgments
John Carra ve Rowena Schokman'a saflaştırılmış Ebola nano-VLP'lerini sağladıkları için teşekkür ediyoruz, Dr. Rajini Mudhasani, Chikungunya virüsünü sağlıyor ve Dr. Charles (Jason) Shoemaker, Ebolavirüs glikoproteinlerini ifade eden Murin Lösemi VLP'lerini sağlamaya teşekkür ediyoruz. Yaz Staj Programını (SIP) ve Bilim ve Mühendislik Çıraklık Programını (SEAP) ve Dr Catherine Wilhelmsen'i laboratuvar güvenliği eğitimi için kolaylaştırdıkları için MAJ Carl Soffler'a teşekkür etmek isteriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/f couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L.
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E.
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
