Summary
В этом протоколе содержится инструкция для образцов отрицательного окрашивания вирусов, которые могут быть легко использованы в лабораториях BSL-2, -3 или -4. Он включает в себя использование инновационной капсулы для обработки, которая защищает сетку электронной микроскопии трансмиссии и обеспечивает удобство работы пользователя в более бурных средах в рамках биоконцентрации.
Abstract
Передаточная электронная микроскопия (TEM) используется для наблюдения ультраструктуры вирусов и других микробных патогенов с нанометровым разрешением. Большинство биологических материалов не содержат плотных элементов, способных рассеивать электроны для создания изображения; Поэтому требуется отрицательное пятно, которое помещает плотные соли тяжелых металлов вокруг образца. Чтобы визуализировать вирусы в суспензии под ТЕМ, их следует наносить на небольшие сетки, покрытые прозрачной поверхностью толщиной всего нанометров. Из-за их небольшого размера и хрупкости эти решетки трудно обрабатывать и легко перемещать воздушными потоками. Тонкая поверхность легко повреждается, оставляя образец трудным или невозможным для изображения. Инфекционные вирусы должны быть обработаны в шкафу для биобезопасности (BSC), а некоторые требуют лабораторной среды для биоконцентрации. Окрашивание вирусов на уровнях биобезопасности (BSL) -3 и -4 особенно сложно, поскольку эти среды более бурные и требуются технические специалисты tO носить средства индивидуальной защиты (СИЗ), что снижает ловкость.
В этом исследовании мы оценили новое устройство, помогающее отрицательным окрашивающим вирусам в биоконцентрации. Устройство представляет собой капсулу, которая работает как специализированный наконечник пипетки. Когда сетки загружаются в капсулу, пользователь просто отсасывает реагенты в капсулу, чтобы доставлять вирус и пятна в инкапсулированную сетку, тем самым устраняя обработку пользователем сеток. Хотя этот метод был разработан специально для использования в биологическом обогащении BSL-3 или -4, он может облегчить подготовку проб в любой лабораторной среде, обеспечивая легкое отрицательное окрашивание вируса. Этот же метод может быть также применен для получения отрицательно окрашенных образцов ТЕМ наночастиц, макромолекул и аналогичных образцов.
Introduction
Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕА) является эффективным инструментом для просмотра морфологии и ультраструктуры биологических образцов, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть с помощью обычного светового микроскопа 1 , 2 , 3 , 4 . TEM снимают электроны через очень тонкий образец, создавая изображение с более высоким разрешением, поскольку электроны имеют гораздо более короткую длину волны, чем свет. Регионы образца, которые изгибают или блокируют электроны, выглядят темными, а области, которые являются электронно-лучистыми, кажутся белыми.
Отсутствие электронного плотного вещества затрудняет просмотр вирусов при ТЭМ, поскольку они не могут рассеивать электроны. Отрицательное окрашивание является наиболее распространенным методом, используемым для создания контраста и просмотра вирусов с помощью TEM. Первая отрицательная процедура окрашивания была предложена Бреннером и Хорном в 1959 году на основе эксперимента, в котором Холл (1955) и Хаксли (1957) наблюдалиПривело к появлению биологических структур в обратном контрасте при погружении в электронно-плотное вещество 5 . Процесс отрицательного окрашивания практически не изменился за последние полвека. Отрицательное окрашивание включает кратковременное применение раствора соли тяжелых металлов к образцу на сетке ТЕА в попытке окружить вирус плотным материалом без проникновения вируса 6 . Это создает темную границу и показывает форму частицы 5 . В этом исследовании используются два реагента для отрицательного окрашивания, уранилацетат (UA) и фосфовольфрамовая кислота калия (PTA). Оба эти пятна обычно используются для негативного окрашивания небольших биологических образцов, таких как вирусы, белковые комплексы и наночастицы 7 , 8 , 9 .
Традиционная технология отрицательного окрашивания - это технология ручного отрицательного окрашивания капельNique 7 . Этот метод требует точной обработки небольших хрупких сеток ТЕА с помощью щипцов для нанесения небольшого количества образца вируса, пятен и полосканий. Типичный протокол подготовки включает в себя нанесение капельки суспензии образца на поверхность сетки ТЕА, покрытой пленкой ( рис. 1А ). После прикрепления образца к поверхности пленки сетку промывают для удаления неадгезивных вирусов и окрашивают либо UA, либо PTA в течение нескольких секунд до минуты, в зависимости от типа образца. Избыточная жидкость отходит от сетки, прикоснувшись к куску фильтровальной бумаги к краю сетки.
Метод ручной капли требует, чтобы каждая сетка была индивидуально изготовлена. Если не обрабатывать тщательно, покрытые сетки ТЕА легко проколоты, согнуты или загрязнены. Обработка нескольких выборок может привести к затруднениям в отслеживании сеток и обеспечении согласованного окрашивания для каждого образца. Эта процедура окрашивания вручную намного больше d(BSL) -3 и -4 лаборатории по биоконцентрации, из-за необходимого средства индивидуальной защиты (СИЗ), необходимого для этих сред. СИЗ громоздка, а окружающая среда биоконцентрации гораздо более бурная по сравнению с обычной лабораторией. Персонал, работающий в лабораториях по биологическому обогащению BSL-3, должен носить 2 пары перчаток и работать в шкафу для биобезопасности (BSC). Этот двойной слой перчаток снижает тактильную чувствительность и ограничивает тонкое движение мотора. Воздушный поток BSC, который защищает пользователя и помогает предотвратить загрязнение образца, может привести к тому, что образцы и пятна высохнут слишком быстро, что повлияет на качество пятен. Сильный турбулентный поток воздуха в BSC также может быстро сдуть сетку, которая недостаточно хорошо закреплена. В лабораториях по биологическому обогащению BSL-4 существуют дополнительные требования безопасности. Персонал должен носить костюм с положительным давлением, который дополнительно ограничивает физическое перемещение и способность четко видеть и манипулироватьUlate. Техник, работающий в BSL-4, также носит по крайней мере 2 пары перчаток, а внешняя пара - толстая перчатка, которая значительно снижает ловкость и осязание. Наконец, щипцы, используемые для работы с сетками ТЕА, являются острыми, что создает риск для техников из-за их способности проколоть перчатки. С капсулами, содержащими сетки, щипцы не нужны, тем самым обеспечивая безопасную альтернативу без использования щипцов для манипулирования сетками в биоконцентрации. Наконец, капсулы также обеспечивают эффективный способ хранения сеток во время обработки, дезактивации пара осмия и во время хранения; Тем самым сохраняя сетки организованными и безопасными от повреждений.
В этом отчете мы вводим новый метод для отрицательных окрашивающих сеток ТЕА в лабораториях по биологическому обогащению, в которых используются капсулы mPrep / g, капсульное устройство для обработки сетки и окрашивания 10 , 11 , 12 . Капсула вмещаетИзменяет две сетки ТЕА, сводит к минимуму прямую обработку и уменьшает вероятность повреждения сетки. Капсула прикрепляется непосредственно к одной или многоканальной пипетке таким же образом, что и наконечник пипетки, что позволяет применять различные жидкости к сеткам, содержащимся внутри. Это позволяет одновременно подготовить несколько образцов с дублирующими сетками ( рис. 1B ). К отрицательному пятну с капсулами образец вируса аспирируют в капсулу и выдерживают в течение 10 минут, чтобы вирусы адсорбировались на поверхности сетки. Затем сетки с адсорбированным вирусом промывают деионизированной (dI) водой и окрашивают либо UA, либо PTA в течение нескольких секунд до 1 мин. Этот процесс использует те же самые этапы и реагенты протокола, что и метод ручной капли; Разница в том, что вся работа происходит внутри капсулы без физической обработки сеток. ( Фиг.1С , 1D ).
Целью этого исследования было оценить капсулы какНовый метод отрицательного окрашивания образцов вирусов в средах биоконцентрации. В этом исследовании также изучалось качество изображений ТЕА, полученных из двух различных процедур инактивации вирусов: 1) быстрая инактивация, 1% пара тетроксида осмия и 2) 24-процентная инактивация с 2% глутаральдегидом. Оба они проводились с использованием капсул. Наконец, мы оценили два часто используемых отрицательных пятна, UA и PTA, для использования в капсуле. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка эксперимента в среде BSL-2 до работы с образцами вирусов
- Подготовьте или купите медные сетки TEM Formvar и углеродного покрытия, обычно 200-400 меш.
- Вставьте покрытые сетки ТЕА в капсулы.
- Используйте увеличенный объектив, чтобы облегчить выполнение этого процесса. Одна или две сетки могут быть вставлены в каждую капсулу. Предварительно загруженные капсулы можно приобрести, чтобы устранить этот шаг, если это необходимо.
- Перенесите капсулы со вставленными сетками, покрытыми ТЕА, вместе с другими материалами и реагентами, в биоконцентрации, где вирусы будут отрицательно окрашены.
2. Способ капсулирования для отрицательного окрашивания в биологическом обогащении с использованием водного глутаральдегида и 1% -ной инактивации паратриоксида осмия
- Внутри биоконцентрирования BSC аспирировать 40 мкл суспензии вируса в капсулу, прикрепленную к пипетке.
ПРИМЕЧАНИЕ. Пипетка остается прикрепленной к нейE до завершения процесса. Подготовка вируса соответствует нашей предыдущей публикации 14 . - Поместите пипетку на бок в течение 10 минут, сетки ориентированы горизонтально. Это должно способствовать равномерному распределению вирусных частиц на сетках с покрытием.
- Инактивировать вирус в капсуле внутри биоконтактного BSC.
- Возьмите пипетку и нажмите на поршень, чтобы распределить раствор вируса в контейнер для отходов.
- Аспирируйте 40 мкл 2% глутаральдегида в капсулы.
Осторожно: глутаровый альдегид является опасным химическим веществом и требует соответствующей защиты. Глутаральдегид можно использовать в течение коротких периодов в нормальном BSC, но расширенный открытый реагент требует работы в канальном BSC или вытяжном шкафу. - Поместите пипетку на бок в течение 20 минут. Это необходимо для правильной фиксации образцов.
- Извлеките фиксатор и аспирируйте 40 мкл воды dI в капсулы, чтобы wПепел от фиксатора. Повторите этот этап промывки в течение всего 3 циклов полоскания.
- Аспирируйте в капсулы по 40 мкл либо 1% уранилацетата (UA), либо 1% фосфовольфрамовой кислоты калия (PTA) и дайте ей сидеть в течение 30 с.
ПРИМЕЧАНИЕ. Время окрашивания может варьироваться от 10 с до 1 мин на основе образца вируса.
Осторожно: UA является альфа-эмиттером и кумулятивным токсином. Обращайтесь с ней с соответствующей защитой. - Удалите капсулу из пипетки и промокните сухие решетки, прикоснувшись к куску фильтровальной бумаги к краю сетки, в то время как решетки остаются в капсуле.
- Процедура инактивации паратексида осмия.
- Поместите капсулу с открытой крышкой в пробирку для центрифуги на 50 мл, содержащую фильтровальную бумагу, смоченную в 1% -ном растворе тетраоксида осмия.
Осторожно: четырехокиси Osmium чрезвычайно токсичен при низком давлении паров. Он должен использоваться в канальном BSC или вытяжном шкафу для химических веществ. Обращайтесь с ней с соответствующей защитой. Почтовое предупреждениеИнформации в рабочей зоне. - Уплотните 50 мл центрифужную пробирку в течение 1 часа, чтобы обеспечить полное проникновение пара тетроксида осмия. Затем, затем дезактивируйте и перенесите трубку из биоконтейнера в установку EML BSL-2.
- Поместите капсулу с открытой крышкой в пробирку для центрифуги на 50 мл, содержащую фильтровальную бумагу, смоченную в 1% -ном растворе тетраоксида осмия.
- Удалите сетки EM из капсулы.
- В установке BSL-2 EM удалите капсулу из пробирки центрифуги и поместите ее на пипетку.
- Аспирируйте 40 мкл воды dI в капсулу и три раза подавайте воду в контейнер для отходов.
- Удалите капсулу из пипетки и промокните сухие решетки с помощью фильтровальной бумаги, чтобы прикоснуться к краю сетки.
- После сушки на воздухе храните сетки для последующей визуализации TEM.
3. Способ капсулирования для инактивации в биоконцентрации с 2% глутаровым альдегидом с последующим отрицательным окрашиванием в лаборатории BSL-2
- Процедура инактивации вирусов.
- Инактивировать вирусы с фиксацией в течение как минимум 24 часов перед упаковкой, дезактивацией и переносить их на оборудование BSL-2 EM.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это должно способствовать равномерному распределению вирусных частиц на сетках ТЕА.
ПРИМЕЧАНИЕ. Время окрашивания варьировало от 10 с до 1 мин на основе образца вируса.
Осторожно: UA является альфа-эмиттером и кумулятивным токсином. Обращайтесь с ней с соответствующей защитой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод капсул дает отрицательное окрашивание хорошего качества для изображений ТЕА:
Во-первых, мы оценили качество изображений, сгенерированных с использованием как ручного метода капель, так и методов капсул для отрицательного окрашивания эболавира Заира. Эболавирусы являются членами семейства Filoviridae вместе с вирусом Марбурга. Эболавирус обычно составляет от 80 до 100 нм в диаметре и может иметь длину более 1000 нм. Эболавирус должен быть обработан в среде биологического обогащения BSL-4. На рисунке 2 показаны изображения, полученные с использованием метода ручной капли, и метод капсул для отрицательного окрашивания. Рисунок 2A (метод ручной капли) и рисунок 2B (метод капсул) показывают образцы эболавируса, которые имеют четко определенные детали с нуклеокапсидными структурами в центре вириона и видимый гликопротеин эболавирусаS на поверхности. Таким образом, как капсульные, так и капельные методы обладают способностью создавать аналогичные изображения TEM качества.
Сравнивать и оценивать качество изображения EM после быстрой инактивации водным глутаральдегидом и 1% пара тетроксида осмия против 24-часовой инактивации 2% -ным водным глутаральдегидом с использованием метода капсул:
Мы оценили качество изображений ТЕА, полученных из двух разных методов инактивации образца с использованием вируса Чикунгунья. Вирус Chikungunya является членом рода Alphavirus в семье Togaviridae . Он сферический с диаметром 60-70 нм. Вирион содержит оболочку, богатую гликопротеинами, которые образуют тримерные пики на поверхности вируса. Вирус Chikungunya должен быть обработан в BSL-3. Быстрая инактивация достигается с использованием 2% глутарового альдегида в течение 20 мин с последующим 1 ч воздействием 1% пара тетроксида осмия, при этом весь отрицательныйАтивный процесс окрашивания, происходящий в капсуле внутри BSC в лаборатории биологического обогащения ( рис. 1C ). Однако при использовании 2% глутарового альдегида в течение 24 ч для инактивации вируса инактивация происходит внутри среды биоконцентрации, но процедура 1% UA отрицательной окраски проводится с использованием капсульного метода в лаборатории BSL-2 ( рисунок 1D ). Эти процедуры инактивации не дают одинаковых качественных изображений ( рисунок 3 ). Из рисунка 3 видно, что фиксация в глутаровом альдегиде без присутствия тетраоксида осмия ( фиг. 3А , 3В ) демонстрирует больше ультраструктурной детали, чем образцы, полученные с глутаральдегидом и тетраоксидом осмия ( фиг. 3С , 3D ).
Метод капсул хорошо работает с использованием уранилацетата (UA) и фосфораOtungstic acid (PTA) в качестве отрицательных пятен для фиксированных образцов альдегида.
Примеры отрицательного окрашивания UA и PTA с использованием капсульного метода показаны на фиг. 4 на фиксированных вирусах альдегида (VLP). VLP представляют собой белки, собранные в подобные вирусам структуры, но не содержащие вирусных генетических материалов. Они обычно используются в разработке вакцин и для основных вирусных исследований. Отрицательное окрашивание является ценным инструментом для оценки сборки и морфологии VLP. Мы использовали как UA, так и PTA для отрицательного окрашивания VLP с помощью метода капсул. Оба пятна демонстрируют результаты высокого качества с видимыми и четко определенными границами нано-VLP 15 ( рис. 4A , 4B ) и ячеистыми лейкозами 10 ( рис. 4C , 4D ) гликопротеинов.
Рисунок 1: Обзор методов отрицательного окрашивания. ( A ) Ручной метод капель выполняется путем последовательного перемещения сетки ТЕА от капли до капли образца, полосканий и пятен. ( B ) Настройка метода капсул с сетками и применение суспензии образца. ( C ) Типичная процедура, использующая метод капсул в биоконцентрации с кратковременной инактивацией 1% паром тетраоксида осмия. ( D ) Рекомендуемая процедура с использованием метода капсул в биоконцентрации с долгосрочной инактивацией с 2% глутаральдегидом. Рисунок был ранее опубликован и повторно использован с разрешениями из ссылки 13 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сравнение 1% PTA отрицательно окрашенных частиц эболавируса. ( A ) Отрицательный, окрашенный ручным методом капель. ( B ) Отрицательное окрашивание с использованием капсульного метода. Рисунок был ранее опубликован и повторно использован с разрешениями из ссылки 13 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: 1% отрицательное окрашивание UA методом капсулы вируса Chikungunya с использованием различных процедур инактивации. ( А , В ) инактивации в течение как минимум 24 ч только с 2% глутаровым альдегидом. ( C ,D) Быстрая инактивация 2% глутаровым альдегидом и 1% пара тетроксида осмия. Рисунок был ранее опубликован и повторно использован с разрешениями из ссылки 13 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Примеры фосфовольфрамовой кислоты (PTA) и уранилацетата (UA), отрицательно окрашенных частиц, подобных вирусам (VLP), с использованием метода капсул. ( A ) Краткий обзор увеличения 1% PTA-окрашенных нановолоконных VLP-эбола. ( B ) Изображение TEM с высоким увеличением, показывающее структурные детали окрашенных PTA нано-VLP. ( C ) Краткий обзор увеличения 1% UA окрашенных VLP лейкоза мышей. ( D ) Изображение с высоким увеличением TEM, показывающее структурный detАуры UA, окрашивали VLP с мышей Leukemia с эболавирусным гликопротеином на их поверхности. Рисунок был ранее опубликован и повторно использован с разрешениями из ссылки 13 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Отрицательное окрашивание является ценным методом ТЕА для оценки и калибровки вирусов, белковых комплексов и наночастиц. Классификация протоколов на протяжении более полувека была составлена каплеобразным составом этих образцов путем ручного перемещения сеток от реагента до отрицательных пятен. Это простой процесс, но требует опыта, полученного в результате обучения для успешного завершения. Отличное отрицательное окрашивание по-прежнему считается современным набором навыков и очень востребованным во многих лабораториях ТЕА. Метод капсул имеет несколько отличительных преимуществ по сравнению с методом ручной капли, особенно в лабораториях по биоконцентрации. Во-первых, метод ручной капельки требует существенной подготовки и опыта, прежде чем он может быть успешно выполнен, а простой в использовании метод капсул может быть выполнен специалистами начального уровня простой пипетировкой. Самая большая проблема с ручным методом капель - успешное обращение с сетями ТЕА с помощью щипцов в BSL-3 и BSL-4 PPE из-за tO значительно уменьшенное тактильное ощущение и ловкость. Сетчатые сетки TEM с хрупким покрытием легко повреждаются или пробиваются пинцетом. Повреждение сетки TEM с покрытием часто не выявляется до тех пор, пока оно не будет рассмотрено с помощью ТЕА. Второе преимущество капсул заключается в том, что сетки ТЕА обрабатываются только непосредственно, когда они вставляются в капсулы и когда они удаляются для введения в электронный микроскоп. Независимо от того, работаете ли вы в лаборатории биоразведки или на объекте EML BSL-2, нет прямой обработки сетки. Третьим преимуществом метода капсул является то, что обе стороны сетки покрыты вирусами и пятнами. Это может быть полезно, когда концентрация проб низкая; Однако это может привести к слишком большому количеству пробы, если концентрация будет высокой или приведет к разбавлению образца перед использованием.
Отрицательное окрашивание нескольких сеток с использованием методики ручной капель занимает много времени, потому что каждый образец должен быть индивидуально подготовлен и окрашен. Это приводит к трудностям обтайПоследовательное, воспроизводимое окрашивание. Кроме того, отслеживание многих отдельных сеток всегда является проблемой. Каждая капсула содержит две сетки и несколько капсул могут быть прикреплены к многоканальной пипетке, упрощая процесс. Поэтому капсулы гарантируют, что сетки окрашиваются с использованием очень схожего процесса, в условиях согласованной выборки и в то же время. Капсулы могут быть помечены, чтобы помочь в организации, таким образом уменьшая потенциал для смешивания или неправильной идентификации сеток. Еще одна распространенная проблема, с которой сталкивается при использовании метода ручной капли, - это загрязнение сетки. Это может произойти, когда решетки остаются на открытом воздухе слишком долго или отбрасываются. Капсула защищает сетки ТЕА от открытого воздуха и надежно удерживает их, чтобы они никогда не падали. Капсулы обеспечивают больший экспериментальный контроль и повторяемость при приготовлении и отрицательном окрашивании, поскольку капсула является более контролируемой средой.
Капсулы можно приобрести предварительно загруженными, еслихряков. Ручная загрузка сетки в капсулы требует определенной практики, чтобы гарантировать, что сетки не повреждены. Метод капсул также требует немного больше образца и пятна, чем метод ручной капли. Метод капсул требует, по меньшей мере, 40 мкл образца, по сравнению с методом ручной капли, который может быть выполнен всего лишь с 8 мкл.
Инактивация вируса является важной частью негативного окрашивания в BSL-3 и BSL-4, так как позволяет инактивированному вирусу выводиться из лабораторий биологического обогащения для получения изображений в установке EM. Инактивация с использованием фиксаторов имеет дополнительное преимущество для фиксации вируса, предотвращая деградацию. Существует два разных способа инактивации образца вируса, оба из которых были рассмотрены в этом исследовании. Первый адгезирует вирус на покрытые сетки ТЕА, фиксирует вирусы в течение 20 мин в 2% -ном растворе глутаральдегида, а затем 1 час воздействия сетки на пары тетроксида осмия ( рис. 1С ). Это инактивитИонный метод выгоден, поскольку он экономит время, позволяя отбирать образец из лаборатории биологического обогащения через 1 ч и 20 мин. Он также предотвращает разбавление вируса перед нанесением на покрытую сетку ТЕА, поэтому может потребоваться, чтобы образцы, которые предположительно находились вблизи предела обнаружения ТЕА. Однако 1% пара тетроксида осмия уменьшает качество изображений ТЕА, поскольку осмий может дополнительно окрашивать образец ( рис. 3 ). Предыдущие отчеты показывают, что 5-минутное воздействие пара тетроксида осмия дает большие результаты при отрицательном окрашивании; Однако более длительная экспозиция, необходимая для абсолютной дезактивации вируса, вызывала смесь положительного и отрицательного окрашивания 17 . Второй способ инактивации включает в себя минимум 24 часа в 2% -ном растворе глутаральдегида и не требует обработки паратексидом осмиума ( рис. 1D ). Этот второй метод занимает больше времени, поскольку образец не удаляется из labo biocontainmentНо может быть выгодным, поскольку он позволяет проводить отрицательное окрашивание за пределами биоконцентрирования в среде BSL-2 и устраняет необходимость в опасном осаждении тетраоксида осмия. Наши результаты показывают, что 24 часа инактивации глутарового альдегида дают изображения TEM более высокого качества, чем при обработке образцов тефтоксидом осмия ( рис. 3 ).
В этом эксперименте использовались два отрицательных пятна: UA и PTA. Оба пятна используются как 1% раствор. UA, ацетатная соль урана, хорошо работает как отрицательное пятно, потому что плотные атомы урана рассеивают электроны 5 . PTA, гетерополикислота, также хорошо работает как отрицательное пятно из-за плотных атомов вольфрама 5 . PTA иногда предпочтительнее, чем у UA, потому что он намного менее токсичен и только слабое раздражение при вдыхании или контакте. При отрицательном окрашивании необработанных образцов следует учитывать более низкое значение рН UA, так как это может привести к повреждению tO образец. Вирусы, используемые в этом эксперименте, требуют фиксации для инактивации, поэтому оба UA и PTA достигли аналогичных результатов, и никакое четкое преимущество не может быть обнаружено ни для одного пятна. Оба пятна легко работать, и оба они создают аналогичные изображения TEM ( рисунок 4 ).
В целом, капсульный метод легче использовать в среде биологического обогащения и может использоваться в качестве альтернативы ручному методу капель. Использование капсул облегчает дефекты обработки образцов и дает изображения TEM хорошего качества. Изображения, полученные с использованием метода капсул, сопоставимы с изображениями, полученными с использованием метода ручной капли. Короткая инактивация вируса с помощью тетроксида осмия улучшает скорость, но его следует использовать только в том случае, если приемлемо пониженное качество изображения, или предполагается, что разбавление вируса приведет к его снижению до предела обнаружения TEM для процедуры. Как UA, так и PTA предоставляют аналогичные результаты с фиксированными образцами вирусов, используемыми в этом исследовании; эйОднако при окрашивании незафиксированных вирусов результаты могут быть разными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мнения, толкования, выводы и рекомендации, изложенные в статье, принадлежат авторам и не обязательно поддерживаются армией США или министерством обороны.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность и благодарность д-ру Джону Карре и Ровене Шокман за предоставление очищенных нано-VLP Эбола, доктора Раджини Мудхасани за предоставление вируса Чикунгунья и д-ра Чарльза (Джейсона) Шумейкера за предоставление VLP из мышиной лейкемии, выражающих гликопротеины Эболавируса. Мы также хотели бы поблагодарить МАЯ Карла Соффлера за содействие Программе летней стажировки (SIP) и Программе обучения в области науки и техники (SEAP) и доктору Кэтрин Вильгельмсен за обучение в области безопасности лабораторий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/f couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L.
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E.
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
