Summary
L'objectif global de ce protocole est de démontrer comment présenter des odorants de faible volatilité pour l'enregistrement à sens unique des neurones récepteurs olfactifs de Drosophila qui répondent aux phéromones cuticulaires à longue chaîne.
Abstract
Les insectes dépendent de leur odorat pour guider un large éventail de comportements essentiels à leur survie, tels que la recherche d'aliments, l'évitement des prédateurs, l'oviposition et l'accouplement. Une myriade de produits chimiques de volatilité variable ont été identifiés comme des odeurs naturelles qui activent les neurones des récepteurs olfactifs d'insectes (ORN). Cependant, l'étude des réponses olfactives aux odorants à faible volatilité a été entravée par une incapacité à présenter efficacement ces stimuli en utilisant des méthodes classiques d'administration d'odeurs. Ici, nous décrivons une procédure qui permet de présenter efficacement des odorants à faible volatilité pour l'enregistrement in vivo solo-sensillum (SSR). En minimisant la distance entre la source d'odeurs et le tissu cible, cette méthode permet l'application d'odorants biologiquement salants mais inaccessibles jusqu'à présent, y compris l'acide palmitoléique, une phéromone stimulante ayant un effet démontré sur les ORN impliqués dans la parade et le comportement d'accouplement 1 .Notre procédure offre ainsi une nouvelle voie pour tester une foule d'odorants à faible volatilité pour l'étude de l'olfaction des insectes et de la communication de la phéromone.
Introduction
Les ORN de Drosophila répondent à un grand nombre d'odorants, avec des longueurs de chaîne de carbone très variées et une variété de groupes fonctionnels, y compris les esters, les alcools, les cétones, les lactones, les aldéhydes, les terpènes, les acides organiques, les amines, les composés soufrés, les hétérocycliques et les aromatiques 2 , 3 . Les odeurs variées dans leurs caractéristiques physicochimiques peuvent avoir des volatilités nettement différentes, indiquées par la pression de vapeur du composé. Notamment, les odeurs biologiquement pertinentes pour Drosophila melanogaster diffèrent énormément de leur volatilité. Par exemple, les ORN Ir92a répondent à l'ammoniac 4 , très volatil, avec une pression de vapeur de 6,432 mmHg à 20 ° C. En revanche, les ORN Or67d répondent à une phéromone masculine, l'acétate de cis -acétate de vaccin ( c VA) 5 , 6 , dont la pression de vapeur est de 43 mmHg à 20 ° C.
Ove_content "> L'étude de la réponse olfactive aux odorants de faible volatilité est particulièrement difficile avec les méthodes classiques d'administration d'odeurs, dans lesquelles des odorants sont délivrés par un flux d'air porteur sur une distance relativement longue ( c.-à-d. Plusieurs centimètres). En tant que tel, les réponses olfactives rapportées À un odorant donné à faible volatilité peut varier considérablement selon la conception du système de distribution d'odeurs. Par exemple, la réponse signalée des ORN Or67d à une dose élevée de c VA varie de ~ 40 7 -> 200 pointes / s 6 . de plus, la fourniture inefficace des c VA avec les méthodes classiques d'administration est probablement attribuable à des résultats faussement négatifs, ce qui conduit à l'interprétation que c VA par elle - même pas suffisante pour activer Or67d Orns 8. Cette interprétation a été contestée plus tard par une autre étude utilisant un Méthode de livraison de l'odeur proche de la gamme 9. Il est donc imperaAfin de développer un système robuste d'administration d'odeurs pour la présentation efficace d'odorants de faible volatilité.Récemment, nous avons identifié plusieurs acides gras cuticulaires à longue chaîne comme ligands pour Or47b ORN. Ils sont logés dans le Sensillum Trichoid Antenal de type 4 (at4). Parmi les odorants d'acides gras à longue chaîne, nous avons constaté que l'acide palmitoleique fonctionne comme une phéromone aphrodisiaque qui favorise la parade masculine en activant Or47b ORN 1 . Cependant, dans une autre étude utilisant une méthode classique d'administration d'odeur, le laurate de méthyle a montré des réponses des ORN Or47b, alors que l'acide palmitoleique n'a suscité aucune réponse lorsqu'on a été présenté à la même distance 10 . Par rapport à c VA, les acides gras à longue chaîne sont encore moins volatils, avec des pressions de vapeur inférieures à 0,001 mmHg à 25 ° C 11 . La faible volatilité inhérente aux odeurs d'acides gras à longue chaîne, qui empêche une présentation efficace à l'antenne viaLes systèmes conventionnels d'odeur-livraison, ont probablement représenté les résultats faussement négatifs 10 . Cette incohérence souligne l'insuffisance des systèmes classiques d'administration d'odeurs dans la présentation d'odorants à faible volatilité. On a précédemment montré que la livraison efficace des odeurs cuticulaires à la mouche nécessite une étroite proximité entre la source d'odeurs et le tissu cible 6 . Ainsi, pour caractériser pleinement les effets des phéromones biologiquement actives tout en imitant la distance dont elles sont probablement rencontrées par les mouches des fruits dans la nature 12 , 13 , nous avons convenu que la distance minimale doit être hautement prioritaire dans notre procédure.
Notre méthode présente d'autres avantages, y compris la compatibilité avec les plates-formes et les techniques d'électrophysiologie standard. Les configurations de plates-formes préexistantes nécessitent une modification minimale pour tenir compte de ce protocole, et la plupart des étapes de SSR ne nécessitent que des ajustements mineurs. CeRend notre technique facilement accessible aux chercheurs expérimentés en SSR. En outre, notre technique permet la présentation d'odorants à faible volatilité avec un déclenchement et un décalage brusques, en corrélant la délivrance de stimulus avec la réponse neuronale. Enfin, la disposition du matériel facilite les échanges rapides entre les cartouches odorantes, accélère la collecte des données sur une gamme de dosage souhaitée.
Nous commençons par examiner la préparation des électrodes de référence et d'enregistrement, la solution de l'hémolymphe pour adultes (AHL), les cartouches d'administration d'odorant et l'olfactomètre correspondant. Nous discutons ensuite de la préparation des solutions d'odorant d'acide palmitoleique, suivies de la préparation de la mouche pour l'enregistrement. Nous examinons les critères de sélection d'un sensillum trichoïde pour enregistrer et examinons de plus près le positionnement de la cartouche odorante avant de présenter les données représentatives obtenues selon cette méthode. Enfin, nous concluons en explorant des applications utiles de cette techniqueCertains problèmes rencontrés et leurs solutions.
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Protocol
1. Préparation du matériel pour l'enregistrement at4
- Utilisez un appareil extracteur à pipette pour préparer des électrodes avec des capillaires en verre aluminosilicaté (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Enlevez légèrement la pointe de l'électrode de référence avec une paire de pinces fines pour faciliter l'insertion dans le clypeus de la mouche ( c'est -à- dire une plaque arrondie à l'avant de la tête de mouche, au-dessus des embouchures).
NOTE: Les hommes WT de 7 jours (Berlin) ont été utilisés dans cette étude. Utiliser la solution saline AHL 14 comme électrolyte pour les deux électrodes. - Préparer 1 litre de AHL en mélangeant 900 mL d'eau distillée avec 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO 3, 0,1120 g de NaH 2 PO 4, 1,892 g de trehalose ּ 2 H 2 O, 3,423 g de saccharose, 1,192 g de HEPES et 8,2 ml de MgCl 2 1 M. En utilisant de l'eau distillée, amener le volume total jusqu'à 1 L. Apportez le pH à 7,4 en utilisant du NaOH 1 N et stérilisez la solution avec unSystème de filtre à vide. Pour un stockage à long terme, conservez les aliquotes AHL à 4 ° C.
NOTE: Les livraisons cohérentes d'acide palmitoleique dépendent de l'uniformité entre les cartouches. Il est essentiel que chaque cartouche soit assemblée de manière reproductible. - À l'aide d'une lame de rasoir, retirez 0,9 cm de la pointe d'une pointe de pipette de 200 μL pour créer la première section de cartouche, mesurant 4,1 cm; Se référer aux dimensions détaillées dans la figure 1A . Utilisez une autre pointe de pipette de 200 μL et retirez 1,7 cm et 1,5 cm de la pointe et de la base, respectivement, pour créer la deuxième section de la cartouche, mesurant 1,8 cm ( figure 1A ). Utilisez une règle pour assurer la reproductibilité.
- Utilisez un perforateur ⅛ "pour couper les disques du papier filtre.
- Utilisez une pince pour placer un disque de papier filtre à l'extrémité de la seconde section de la cartouche. Confirmez visuellement qu'il y a une ouverture dans la pointe de la cartouche à travers laquelle l'air peut passer.
- Fixez les première et seconde sections de cartouche ensemble, comme le montre la figure 1A . Angle de la deuxième section de la cartouche vers le bas pour faciliter le pointage carré en vue de la préparation ( Figure 1B ).
- Connectez la cartouche avec le tube d'injection d'odeur, qui est monté sur un micromanipulateur.
REMARQUE: cette conception permet de faire pivoter la cartouche vers l'extérieur pour faciliter l'échange ( figure 1C ). - Réglez le flux d'air humidifié constant à 2 L / min dans un contrôleur de masse et le flux d'odorant à 500 mL / min dans un autre contrôleur de masse.
- En utilisant le logiciel (voir la table des matières ), programmez la procédure pour administrer une bouffée d'odeur de 500 ms.
2. Préparation des solutions d'odeur d'acide palmitoleique pour la livraison
NOTE: Or47b ORN répondent à l'acide cis -et trans- palmititoleique. Comme l'acide palmitoleique est instable à RT, les stocks sont stockés à -20 ° C et utilisés dans un mois à l'ouverture. L'éthanol est le solvant choisi pour l'acide palmitoléique.
- Utilisez un mélangeur à vortex pour mélanger soigneusement 10 μL de stocks d'acide cis- ou trans- palmitoléique ou des dilutions avec 90 μL d'éthanol à 100% pour des dilutions en série à dix fois dans des microtubes de 1,7 ml. Préparer des dilutions d'acide palmitoleique fraîches quotidiennement avant les expériences et utiliser dans une journée.
REMARQUE: pour les odeurs qui ne sont pas solubles dans l'éthanol, un flacon en verre est recommandé pour la préparation des dilutions d'odeurs avec d'autres types de solvants organiques. - En utilisant une micropipette P10, appliquer 5 μL de solutions d'acide cis- palmititoïques des dilutions souhaitées sur le papier filtre dans chaque cartouche correspondante.
NOTE: Le dosage le plus élevé (10 -1 ) contient 450 μg du composé. Pour les solutions d'acide trans- palmititoleique, appliquez 4,5 μL à la place pour que la dose la plus élevée (10 -1 ) contienne également 450 μg de tIl a composé. - Pour évaporer complètement le solvant, placer les cartouches d'acide palmitoleique dans un dessiccateur sous vide pendant 1 h à la température ambiante et 7,59 mmHg de pression.
REMARQUE: les cartouches peuvent être utilisées jusqu'à 4 h à la RT.
3. Préparation de la drosophile pour l'accès facile à l'at4 Sensilla pour les enregistrements électrophysiologiques In Vivo
NOTE: Les mouches WT (Berlin) sont élevées dans un milieu de farine de maïs standard à 25 ° C dans un cycle de lumière-obscurité 12:12. Lors de l'éclosion, les mouches sont séparées par sexe en groupes de dix, selon lesquelles ils sont hébergés en groupe jusqu'à 7 jours d'âge. Or47b Les ORN dans les mouches mâles et femelles répondent à l'acide palmitoléique. Pour simplifier, seules les mouches mâles sont examinées dans la présente étude.
- Assembler une glissière de préparation de mouche: sur une glissière en verre, placez une lamelle de verre (18 x 18 mm 2 ) sur une petite quantité d'argile de modélisation, formant un angle de ~ 3 ° avec la glissière en verre. Placez un ruban adhésif double face sur l'intérieurDge de la lamelle et sur la zone de la glissière immédiatement en dessous. Remplacez-le par un ruban frais pour chaque jour d'enregistrement ( Figure 2A ).
- Utilisez un aspirateur à mouches 15 pour collecter la mouche d'intérêt dans le tube, puis ajoutez une pointe de pipette de 200 μL sur l'extrémité du tube. Appuyez simultanément sur le tube vers l'avant tout en soufflant de l'air dans le tube pour pousser la mouche jusqu'à la fin de la pointe de la pipette. Utilisez une lame de rasoir pour couper juste en dessous du corps de la mouche et 2 longueurs de tête au-dessus de la mouche.
- Tamp le bas de la pointe de la pipette avec l'argile de modélisation, poussant la mouche vers le haut jusqu'à ce que les antennes et les clypeus soient exposés ( Figure 2B ). Pour éviter de tuer la mouche, ajoutez seulement suffisamment d'argile pour exposer les antennes et l'aristae, car cela empêche l'abdomen de la mouche d'être écrasé. En outre, ajouter de l'argile lentement et doucement pour éviter toute contraction soudaine. Confirmez que la mouche est en vie en vérifiant l'antenneOu le mouvement de proboscis.
- Utilisez une pince pour manœuvrer la pointe de la pipette qui abrite la mouche. Orientez la tête de façon à ce que le clype se trouve à droite de l'observateur. Réglez la préparation le long de la lamelle à l'aide de pinces fines jusqu'à ce que le côté latéral de l'antenne soit placé contre la surface de lamelles scellées ( Figure 2B ).
- Placez une tige de maintien sur l'arista pour fixer l'antenne sur le ruban double face pour éviter tout mouvement ( Figure 2B ).
REMARQUE: La tige de retenue est tirée d'un capillaire en verre borosilicaté avec un extracteur de pipette et maintenue en position avec l'argile de modélisation ( Figure 2A ). - Placez la préparation sur la scène de la plate-forme ( Figure 2C ). À l'aide du microscope, confirmez que les trichoïdes sont visibles le long du bord latéral distal du troisième segment de l'antenne.
REMARQUE: Idéalement, la sensilla devrait être nettement décalée en arrière-plan, ce qui simplifie leur Identification et facilite l'enregistrement ( Figure 3 ). Dans cette préparation, la majorité des sensillas trichoïques accessibles sont du type at4. - Maintenir la préparation sous un flux d'air humidifié constant (2 L / min) délivré via un tube d'alimentation d'air séparé d'une distance d'environ 2 cm de la préparation ( Figure 4 ), comme décrit précédemment 2 , 15 .
4. Enregistrement de l'activité at4 Sensillum à partir d'or47b ORN dans les Trichoids at4 en réponse à l'acide palmitoleique
- Insérez l'électrode de référence dans le clypeus ( Figure 3A ). Pour éviter les dommages aux tissus, assurez-vous que l'électrode est insérée juste en dessous de la surface, où elle peut entrer en contact avec l'hémolymphe sous la cuticule, avec un mouvement rapide et lisse.
- Abaissez l'électrode d'enregistrement lentement jusqu'à ce qu'elle entre dans le même plan de vue que le sensillum cible (= "Xfig"> Figure 3B). Enregistrez sous un objectif objectif 50X.
NOTE: La cuticule tricoïdale dure nécessite l'insertion de l'électrode d'enregistrement dans la base sensible, dont la surface plus large fournit une cible plus grande qui réduit la probabilité que l'électrode soit déviée ( Figure 3B , insertion). - Avant d'appliquer des stimuli d'odeur à un sensillum, respecter les critères de sélection suivants; Tout échec de la trichoid ne répond pas à ces normes devrait être rejeté et un autre sensillum choisi à la place.
- Observez un rapport signal / bruit élevé (voir la Figure 3C pour un exemple).
- Observez les pointes identifiables des neurones at4A et at4C ( Figure 3C ).
REMARQUE: Il est à noter que l'amplitude de l'amplitude at4B apparaît très semblable à at4A 10 et ne peut être identifiée facilement sans stimulation des odeurs. - Observez que le taux de tir basal des neurones at4A estEnviron ou moins de 20 Hz.
NOTE: Ce critère est spécifique pour at4A car le taux de tir basal pour le neurone est supérieur à celui des ORN basiques 2 . Un tir basal beaucoup plus élevé indique que les neurones peuvent avoir été endommagés lors de l'insertion d'électrodes.
- Connectez la cartouche au tube de distribution d'odorant. Commencez par le contrôle du solvant et ensuite les odorants, des concentrations faibles à élevées. Utilisez le micromanipulateur pour manoeuvrer la cartouche vers la préparation tout en orientant la cartouche directement à la tête de la préparation. Confirmez visuellement que la cartouche est directement dirigée vers l'antenne ( Figure 4 ) à quelques millimètres.
REMARQUE: L'objectif est d'orienter l'ouverture de la cartouche directement sur l'antenne et de la positionner à proximité du tissu cible. - Assurez-vous que la cartouche odorante est séparée de l'électrode d'enregistrement sur sa droite de 1 à 2 mm et de la pré-P glisse en dessous d'environ 1 mm.
REMARQUE: Dans la configuration décrite ici, la cartouche odorante est étroitement liée à l'électrode d'enregistrement, à l'électrode de référence et à la diaphane ( Figure 4 ).
REMARQUE: Faites attention à la distance entre la cartouche et les électrodes d'enregistrement / référence. Une distance d'environ 4 mm est recommandée 1 . Un contact involontaire peut mettre fin au signal et briser l'extrémité de l'électrode d'enregistrement, endommager le neurone actuel et compliquer d'autres enregistrements.
REMARQUE: Considérez la distance séparant la cartouche et la diapositive à la mouche. Toucher le lamelle peut également déloger l'électrode d'enregistrement pour perturber l'enregistrement. - Appuyez sur "Enregistrer" dans le logiciel d'acquisition de données pour commencer l'enregistrement.
REMARQUE: pour chaque enregistrement de 10 s, une seule impulsion d'odeur de 500 ms est livrée directement à l'antenne, comme décrit à l'étape 1.9. - Après une application odorante,Retirez soigneusement la cartouche avant de la remplacer par une cartouche de la concentration la plus élevée suivante. Continuez jusqu'à ce que la gamme de dosage soit obtenue.
REMARQUE: Il est recommandé qu'un seul or47b ORN soit enregistré de chaque vol pour éviter tout effet possible de l'adaptation. - Rincer soigneusement l'électrode d'enregistrement avec de l'eau distillée après avoir fini l'enregistrement pour la journée.
- Analyser et tracer les données à l'aide d'un logiciel d'analyse hors ligne disponible dans le commerce.
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Representative Results
Notre technique a été appliquée avec succès pour déterminer l'efficacité relative des isomères trans ( Figure 5A ) versus cis ( Figure 5B ) de l'acide palmitoleique. Nos données représentatives démontrent que l'acide trans- palmititoleique est un ligand plus efficace pour les ORN Or47b par rapport à l'isoforme cis ( figure 5C ). Un seul neurone a été enregistré de chaque mouche, avec douze mouches enregistrées par courbe de dosage, pour un total de 24 mouches. Les données collectives ont été obtenues à partir de trois répétitions indépendantes des expériences, avec 8 mouches enregistrées chacune. Les barres d'erreur représentent le sem
Il est à noter que la distance entre l'ouverture de la cartouche d'odeur et la tête de la mouche a une influence significative sur le résultat de l'enregistrement. Pour susciter une réponse significative à pAcide amidoleique dans Or47b ORN, nous avons présenté l'odorant à proximité, à environ 4 mm de l'antenne 1 ( figure 6A ). Lorsque l'acide palmitoléique est plus éloigné de l'antenne (~ 11 mm), nous avons pu constater une réponse significative à partir des mêmes ORN Or47b ( Figure 6B ). Ces résultats mettent en évidence l'importance de la présentation à distance de l'acide palmitoleique ( figure 6C- D ). Les données ont été recueillies à partir d'expériences parallèles provenant de 6 mouches mâles (Berlin, 7 jours). Un seul Or47b ORN a été enregistré / volé. Les barres d'erreur représentent le sem
Figure 1: Configuration de la cartouche et de l'olfactomètre. ( A ) Préparation des cartouches d'odeur. De gauche à droite: une norme de 200 μLLa pointe de la pipette, les première et seconde sections de la cartouche et une cartouche odorante complétée. ( B ) La cartouche est connectée à l'olfactomètre, indiquant la descente vers le bas de la deuxième section. ( C ) Installation de l'olfactomètre représentant le tube de distribution d'odeur monté sur le micromanipulateur, avec une cartouche odorante attachée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Préparation de la drosophile . ( A ) Une préparation complète, montrant les positions relatives de la mouche, du couvre-lit et de la tige de retenue. ( B ) Vue rapprochée de la préparation, montrant le positionnement de la mouche, son orientation antenale et son clype. La tige de retenue est placée sur l'arista,Sécuriser le troisième segment antenal sur le ruban double face. ( C ) Configuration de la machine. Tous les composants principaux sont annotés. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Identification de l'at4 Sensillum pour SSR. ( A ) Vue 4X de la préparation, montrant l'électrode de référence insérée dans le clype, la barre de maintien au dessus de l'arista et l'électrode d'enregistrement positionnée près du troisième segment antenal. ( B ) vue 50X de l'électrode, mise en place pour l'insertion dans le trichoïde at4. Insertion: illustration de la position de l'électrode d'enregistrement. ( C ) Des traces SSR représentatives de l'activité des pointes de base, démontrant un signal (signal) bon (haut) ou médiocre (bas)E ratio. Un bon rapport signal sur bruit permet une identification fiable des pointes at4A et at4C. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Emplacement des cartouches. ( A ) La cartouche odorante est dirigée directement à la tête de la mouche à une distance de quelques mm. ( B ) Une autre vue de la préparation et de l'olfactomètre sous un angle différent. ( C ) Une vue rapprochée de la préparation et de l'olfactomètre, montrant la position de la cartouche odorante au-dessus de la glissière de préparation de la mouche. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: traces représentatives et courbes posologiques des ORN Or47b en réponse à l' acide cis - trans -palmitoleique. ( AB ) SSR des ORN at4A qui expriment le récepteur Or47b avec trans - ( A ) ou l'acide cis- palmititoleique ( B ). Des enregistrements ont été réalisés avec des mâles WT Berlin de 7 jours. Les histogrammes de pointage correspondants (moyen) et un histogramme de temps péri-stimulus (en bas, binated à 50 ms) sont présentés sous les traces de l'échantillon (n = 12). ( C ) Courbes dose-réponse comparant les réponses Or47b ORN à l'acide cis - trans -palmitoleique. Moyenne ± sem (* p <0,05; ** p <0,01; t -test). Ctrl: contrôle négatif sans acide palmitoleique. Cliquez ici s'il vous plaitPour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 6: L'activation de l'at4A par l'acide palmitoleique nécessite une stimulation à distance. ( AB ) SSR des ORN at4A chez les hommes de Berlin de 7 jours de style sauvage. L'acide cis- palmititolique a été livré à une distance proche (~ 4 mm) ou plus loin (~ 11 mm) (n = 6). ( C ) Comparaison des réponses de pointage correspondantes (binées à 50 ms, histogrammes de temps de péri-stimulus lissés). ( D ) Comparaison des réponses de pointes moyen correspondantes. Les réponses de at4A à l'acide palmitoléique diminuent considérablement à mesure que la distance de stimulation augmente. Reproduit avec la permission de la Figure S4 dans la référence 1 . Cliquez ici pour voir unPlus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons décrit une procédure par laquelle les réponses des ORS Or47b à l'acide palmitoleique peuvent être induites et enregistrées de manière robuste. Nous avons modifié une méthode conventionnelle de traitement des odeurs longue distance 2 , 7 , 10 pour dépanner le problème de l'apport insuffisant d'odorant à la phéromone. Nous avons abordé la question de la volatilité à faible teneur en odeur en fournissant le composé via des cartouches odorantes, dont l'ouverture est positionnée à des millimètres de la préparation. Lorsque l'on considère la construction et le placement cohérents de chaque cartouche odorante, ce protocole se manifeste comme une méthode efficace pour présenter des odeurs autrement inaccessibles de manière reproductible.
La procédure de présentation des odeurs proches de la description décrite ici est importante en ce qui concerne les méthodes existantes de distribution d'odeurs. Il permet une variété de futures applications, y compris la sélection d'autres lOw-volatility odorants pour les réponses dans non seulement les ORN hébergés dans Trichoid Sensilla 1 , mais ceux trouvés dans n'importe quel sensillum. La procédure permet de délivrer efficacement des odorants de phéromone via une impulsion d'air au lieu de déplacer physiquement un capillaire en verre portant les odorants vers les antennes 6 . Notre modification minimise la possibilité de toucher directement le tissu avec le capillaire en verre contenant des odeurs, tel que soutenu par les résultats expérimentaux dans lesquels nous avons observé des réponses obtenues par l'acide palmitoléique seulement après la délivrance de l'impulsion d'odeur. En outre, notre méthode offre un excellent contrôle temporel de l'apparition et de l'odeur des odeurs rapides.
Il convient de noter que, malgré le potentiel démontré de la procédure, ce n'est pas sans limites. Dans notre procédure, le positionnement de la cartouche dépend entièrement du réglage manuel, ce qui rend techniquement difficile de placer les cartouches de la cartouche.Se trouve au même endroit, d'un essai à l'autre. En outre, une attention particulière aux étapes critiques du protocole est nécessaire pour s'assurer qu'il est exécuté avec succès. Parfois, des réponses très variables à une concentration d'odeur donnée sont rencontrées. Dans la plupart des cas, la cause est attribuée au placement incohérent des cartouches. De plus, des critères de sélection stricts pour at4 sensilla doivent être observés avant l'enregistrement. Les tailles de pointes uniformes à 4A des rapports signal / bruit élevés ( Figure 3C ) sont un point de repère clé, alors qu'un modeste taux de tir basal indique l'absence de dégâts neuronaux. Le degré de difficulté technique de cette procédure est plus que compensé par sa capacité à fournir des odorants de phéromone à partir de gammes qui simulent de près la proximité observée entre un mâchisseur et la femme cible.
En résumé, notre méthode de présentation odorante offre l'accès à l'acide palmitoleique pour une utilisation en SSR à partir des ORN Or47b. Toutefois, l'application deCette technique n'est pas limitée à une seule phéromone, mais elle est facilement adaptable à tout autre élément d'odeur de faible volatilité de choix, ce qui en fait une technique analytique polyvalente lors du dosage d'odorants précédemment inaccessibles.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Ye Zhang pour l'aide avec les traces d'échantillons et Tin Ki Tsang pour l'aide avec les images. Ce travail a été soutenu par un prix de carrière précoce de la Fondation Ray Thomas Edwards et une subvention NIH (R01DC015519) aux subventions de C.-YS et NIH (R01DC009597 et R01DK092640) à JWW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
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