Summary
Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe geurstoffen met lage volatiliteit voor single-sensillum-opname van Drosophila- olfactorische receptorneuronen kunnen optreden die reageren op lang-keten-cutulaire feromonen.
Abstract
Insecten vertrouwen op hun reukzin om een breed scala aan gedragingen te leiden die kritisch zijn voor hun overleving, zoals voedselzoekende, roofdier vermijding, ovipositie en paring. Veelvoudige chemische stoffen met wisselende volatiliteiten zijn geïdentificeerd als natuurlijke geurstoffen die insectenolfactor Receptor Neurons (ORN's) activeren. Het bestuderen van de geurfactorische reacties op luchtspuiten met een laag volatiliteit is echter belemmerd door een onvermogen om dergelijke stimuli effectief aan te bieden door gebruik te maken van conventionele reukafleveringsmethoden. Hier beschrijven we een procedure die de effectieve presentatie van geurstoffen met een lage vluchtigheid toelaat voor in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). Door de afstand tussen de geurbron en het doelweefsel te minimaliseren, kan deze methode de toepassing van biologisch opvallende maar tot nu toe ontoegankelijke geurstoffen, waaronder palmitoolzuur, een stimulerende feromoon met een aangetoond effect op ORN's die betrokken zijn bij het hof en het paren gedrag 1 .Onze procedure biedt dus een nieuwe weg om een gastheer van lage-vluchtige geurstoffen te analyseren voor het bestuderen van insuline- en feromooncommunicatie.
Introduction
Drosophila ORNs reageren op een groot aantal geurstoffen, met veel uiteenlopende koolstofketenslengten en een verscheidenheid aan functionele groepen, waaronder esters, alcoholen, ketonen, lactonen, aldehyden, terpenen, organische zuren, aminen, zwavelverbindingen, heterocyclische verbindingen en aromaten 2 , 3 . Geurstoffen die gevarieerd zijn in hun fysisch-chemische eigenschappen kunnen opmerkelijk verschillende volatiliteiten hebben, aangegeven door de dampdruk van de verbinding. Met name, biologisch relevante geurstoffen voor Drosophila melanogaster verschillen enorm in hun volatiliteit. Bijvoorbeeld reageren Ir92a ORN's op ammoniak 4 , die zeer vluchtig is, met een dampdruk van 6.432 mmHg bij 20 ° C. In tegenstelling hiermee reageren Or67d ORNs op een mannelijk feromoon, cis- va-acetaat ( c VA) 5 , 6 , waarvan de dampdruk 43 mmHg bij 20 ° C is.
Ove_content "> Het bestuderen van het olfactorische reactie op geurstoffen met een lage vluchtigheid is bijzonder uitdagend met conventionele geurafleveringsmethoden, waarbij geurstoffen via een dragerluchtstroom over een relatief lange afstand ( dwz enkele centimeter) worden afgeleverd. Als zodanig zijn de gerapporteerde olfactieve reacties Naar een gegeven volatiliteit geurmiddel kan sterk variëren, afhankelijk van het ontwerp van het geurafgifte-systeem. Bijvoorbeeld, de gerapporteerde respons van Or67d ORN's tot een hoge dosis c VA varieert van ~ 40 7 -> 200 spikes / s 6 . Bovendien is de ondoeltreffende levering van c VA met conventionele aflevermethoden waarschijnlijk toegeschreven aan valse negatieve resultaten, wat leidt tot de interpretatie die c VA op zichzelf niet volstaat om Or67d ORNs 8 te activeren. Deze interpretatie werd later uitgedaagd door een andere studie met behulp van een Luchtafgifte-methode 9. Het is dus imperaEen robuuste geurafleveringssysteem ontwikkelen voor de effectieve presentatie van geurstoffen met een lage vluchtigheid.Onlangs identificeerden we verscheidene lang-keten-cutulaire vetzuren als liganden voor Or47b ORN's. Ze zijn gehuisvest in het type 4 Antennale Trichoid Sensillum (at4). Onder de long-chain vetzuren geurstoffen, vonden we dat palmitolezuur functioneert als een afrodisiacale feromoon die mannelijke hofschap bevordert door Or47b ORNs 1 te activeren. In een andere studie die gebruik maakte van een gebruikelijke geurafleveringsmethode bleek methyllauraat echter reacties van Or47b ORNs op te wekken, terwijl palmitolezuur geen reactie opleverde bij dezelfde afstand 10 . Vergeleken met c VA zijn langzijdige vetzuren nog minder vluchtig, met dampdrukken minder dan 0.001 mmHg bij 25 ° C 11 . De inherente lage volatiliteit van long-chain vetzuur geurstoffen, waardoor de efficiënte presentatie van de antenne viaConventionele geurafleveringssystemen, die waarschijnlijk in aanmerking komen voor de valse negatieve resultaten 10 . Deze inconsistentie benadrukt de ontoereikendheid van conventionele geurafleveringssystemen bij het presenteren van laagvluchtige geurstoffen. Voorheen werd aangetoond dat de effectieve afgifte van vliegende kuticulaire geuren nauwe nabijheid vereist tussen de geurbron en het doelweefsel 6 . Om de effecten van biologisch actieve feromonen volledig te karakteriseren, terwijl ze de afstand waarna ze waarschijnlijk worden geconfronteerd met fruitvliegen in de natuur 12 , 13 , overeenstemmen, zijn we afgesproken dat minimale afstand in onze procedure een hoge prioriteit moet krijgen.
Onze methode bevat nog meer voordelen, waaronder compatibiliteit met standaard elektrofysiologie riggen en technieken. Pre-existing rig setups vereisen minimale aanpassing om dit protocol te behalen, en de meeste SSR-stappen vereisen slechts kleine aanpassingen. DezeMaakt onze techniek gemakkelijk toegankelijk voor onderzoekers die in SSR ervaren zijn. Bovendien staat onze techniek voor de presentatie van low-volatility odorants met een scherpe aanvang en offset, correlerende stimuluslevering met neuronale respons. Tenslotte vergemakkelijkt de hardware-indeling snelle uitwisseling tussen geurpatronen, waardoor gegevens verzamelen worden over een gewenst doseringsbereik.
We beginnen met het evalueren van de voorbereiding van referentie- en opnameelektroden, Volwassen Hemolymph-Like (AHL) -oplossing, Reukpatronen voor geurstoffen en de bijbehorende olfactometer. Vervolgens bespreken we de bereiding van de palmitolezuur-geuroplossingen, gevolgd door de voorbereiding van de vlieg voor opname. We gaan door naar de criteria voor het selecteren van een trichoid sensillum om de positionering van de geurcartridge te registreren en nauwkeuriger te onderzoeken alvorens de representatieve data die verkregen zijn met behulp van deze methode te presenteren. Tenslotte concluderen we nuttige toepassingen van deze techniekUe, sommige problemen, en hun oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de hardware voor at4 opname
- Gebruik een pipettrekinstrument om elektroden voor te bereiden met aluminosilicaatglas capillairen (OD 1.0 mm, ID 0.64 mm). Knop het uiteinde van de referentieelektrode lichtjes aan met een paar fijne tangen om de invoeging in de clypeus van de vlieg te vergemakkelijken ( dwz een afgeronde plaat aan de voorzijde van de vliegkop boven de monddelen).
OPMERKING: In deze studie werden 7-jarige WT-mannen (Berlijn) gebruikt. Gebruik AHL-zoutoplossing 14 als de elektrolyt voor beide elektroden. - Bereid 1 liter AHL door het mengen van 900 ml gedestilleerd water met 6,312 g NaCl, 0,373 g KCI, 0,337 g NaHCO3, 0,1120 g NaH 2PO 4, 1,892 g trehalose ּ 2 H2O, 3,423 g sucrose, 1.192 g HEPES en 8,2 ml 1 M MgCl2. Met gedestilleerd water breng het totale volume tot 1 liter. Breng de pH tot 7,4 met 1 N NaOH en steriliseer de oplossing met eenVacuümgedreven filtersysteem. Voor langdurige opslag, houd de AHL-porties bij 4 ° C.
OPMERKING: Consistente leveringen van palmitoolzuur zijn afhankelijk van uniformiteit tussen cartridges. Het is cruciaal dat elke cartridge op een reproduceerbare manier is samengesteld. - Gebruik een scheermesje, verwijder 0,9 cm van de punt van een 200 μL pipetpunt om de eerste patroon sectie te maken, met een lengte van 4,1 cm; Verwijzen naar de afmetingen die gedetailleerd zijn in figuur 1A . Gebruik nog eens 200 μL pipettip en verwijder 1,7 cm en 1,5 cm van de punt en de basis, respectievelijk, om de tweede patroon sectie te maken, 1,8 cm ( figuur 1A ). Gebruik een liniaal om reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Gebruik een ⅛ "hole puncher om discs uit filterpapier te snijden.
- Gebruik tangen om een filterpapierschijf aan de uiteinde van de tweede cartridge sectie te plaatsen. Bevestig visueel dat er een opening in de cartridge tip is, waardoor de lucht kan passeren.
- Bevestig de eerste en tweede cartridge secties, zoals weergegeven in Figuur 1A . Hoek de tweede patroon sectie naar beneden om het vierkant te richten op het prep ( figuur 1B ).
- Sluit de cartridge aan met de geurafgiftebuis, die op een micromanipulator is gemonteerd.
OPMERKING: Met dit ontwerp kunt u de cartridge naar buiten zwenken om uitwisseling te vergemakkelijken ( Figuur 1C ). - Stel de constante bevochtigde luchtstroom in op 2 L / min in één massa controller en de geurvloeistof stroomt tot 500 mL / min in een andere massa controller.
- Gebruik de software (zie de Tabel van Materialen ), programmeer de procedure om een 500 ms geurpuff te beheren.
2. Bereiding van Palmitoleenzure Oplosmiddeloplossingen voor Levering
OPMERKING: Or47b ORNs reageren op zowel cis- als trans- palmitoolzuur. Aangezien palmitolezuur onstabiel is bij RT, de voorraden worden opgeslagen bij -20 ° C en worden gebruikt binnen een maand na opening. Ethanol is het oplosmiddel van keuze voor palmitoolzuur.
- Gebruik een vortexmenger om 10 μl cis- of trans- palmitolzuurvoorraden of verdunningen met 90 μl 100% ethanol voor tienvoudige seriële verdunningen in 1,7 ml microtubes grondig te mengen. Bereid verse palmitoolzuurverdunningen dagelijks voor experimenten uit en gebruik binnen een dag.
OPMERKING: Voor geurstoffen die niet in ethanol oplosbaar zijn, wordt een glazen fles aanbevolen voor het bereiden van geurverdunningen met andere soorten organische oplosmiddelen. - Gebruik van een P10 micropipette 5 μl cis -palmitoolzuuroplossingen van de gewenste verdunningen aan het filterpapier in elke bijbehorende patroon.
OPMERKING: De hoogste dosering (10 -1 ) bevat 450 μg van de verbinding. Voor trans- palmitoolzuuroplossingen dient u in plaats daarvan 4,5 μl toe te passen, zodat de hoogste dosering (10 -1 ) ook 450 μg t bevatHij is samengesteld. - Om het oplosmiddel volledig te verdampen, plaats de palmitoolzuurcartridges in een vacuümdroogmiddel gedurende 1 uur bij RT en 7,59 mmHg druk.
OPMERKING: De cartridges kunnen maximaal 4 uur bij RT worden gebruikt.
3. Bereiding van Drosophila voor Klaar Toegang tot de At4 Sensilla voor In Vivo Electrofysiologische Opnamen
OPMERKING: WT vliegen (Berlijn) worden opgemaakt in standaard maïsmeelmedium bij 25 ° C in een 12:12 lichtdonkere cyclus. Bij eclosie worden vliegen gescheiden naar geslachten in groepen van tien, waardoor ze tot 7-jarige leeftijdsgroepen zijn. Or47b ORNs in zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen reageren op palmitoolzuur. Voor de eenvoud worden alleen mannelijke vliegen onderzocht in de huidige studie.
- Monteer een fly-prep slide: op een glasplaatje, plaats een glazen dekglaasje (18 x 18 mm2) met een kleine hoeveelheid klei, die een ~ 3 ° hoek met de glasplaatje. Plaats dubbelzijdige tape op de binnenkant eDge van de deklaag en op het dia vlak onderaan. Vervang met verse tape voor elke dag van opname ( afbeelding 2A ).
- Gebruik een vliegasasier 15 om de vliegvlieg in de buis te verzamelen en past dan een 200-pipetip over het uiteinde van de buis. Tegelijkertijd de buis naar voren terwijl u lucht in de buis waait om de vlieg naar het einde van de pipetstip te duwen. Gebruik een scheermesje om net onder het lichaam van de vlieg en 2 hoofdlengtes boven de vlieg te snijden.
- Steek de bodem van de pipettip met modelleerklep aan, duw de vlieg naar boven totdat de antenne en de clypeus worden blootgesteld ( figuur 2B ). Om te vermijden dat de vliegen worden vermoord, voegt u alleen genoeg klei toe om de antenne en aristae bloot te stellen, omdat dit voorkomt dat de buik van de vlieg wordt gebroken. Voeg ook langzaam en zachtjes klei toe om eventuele plotselinge constrictie te voorkomen. Bevestig dat de vlieg levend is door te kijken naar antennesOf proboscisbeweging.
- Gebruik pincet om de pipet tip te manoeuvreren die de vlieg herbergt. Richt het hoofd zodanig dat de clypeus naar rechts van de waarnemer staat. Pas de prep langs de deklip aan met behulp van fijne tang tot de laterale zijde van de antenne tegen het tapijtoppervlak ligt ( Figuur 2B ).
- Plaats een houderstang op de arista om de antenne vast te zetten op de dubbelzijdige tape om beweging te voorkomen ( Figuur 2B ).
OPMERKING: De houderstang wordt getrokken uit een borosilicaatglazenkapillaire met een pipettrekker en in stand gehouden met modellerende klei ( figuur 2A ). - Plaats de prep op het podium van de tuig ( Figuur 2C ). Bevestig met behulp van de microscoop dat de trichoïden zichtbaar zijn langs de distale zijde van het derde segment van de antenne.
OPMERKING: Ideaal gezien, moet de sensilla duidelijk op de achtergrond worden gesilhouetteerd, wat hun eenvoud vereenvoudigt Identificatie en vergemakkelijkt opname ( figuur 3 ). In deze voorbereiding zijn de meeste toegankelijke trichoid sensilla van het type at4. - Houd de prep onder een constante bevochtigde luchtstroom (2 L / min), die via een aparte luchttoevoerbuis geleverd wordt op ongeveer 2 cm afstand van de prep ( Figuur 4 ), zoals eerder beschreven 2 , 15 .
4. Opname van at4 Sensillum Activiteit van Or47b ORNs in de at4 Trichoïden in reactie op Palmitoleenzuur
- Plaats de referentieelektrode in de clypeus ( Figuur 3A ). Om weefselbeschadiging te vermijden, zorg ervoor dat de elektrode net onder het oppervlak zit, waar het hemolymph onder de kutikula kan contacteren, met een snelle en soepele beweging.
- Laat de opnameelektrode langzaam zakken tot het in hetzelfde perspectief komt als het doel sensillum (= "Xfig"> Figuur 3B). Opnemen onder een 50X objectieflens.
OPMERKING: De zware trichoidale kutikula zorgt ervoor dat de opnameelektrode in de sensulaire basis wordt geplaatst, waarvan het bredere gebied een groter doelwit geeft, waardoor de kans op de elektrode wordt weggenomen ( Figuur 3B , inset) vermindert. - Voordat u geurstimulaties toepast op een sensillum, let op de volgende selectiecriteria; Elke trichoid die niet aan deze normen voldoet, moet worden afgewezen en in plaats daarvan een andere sensillum gekozen.
- Let op een hoge signaal-ruisverhouding (zie figuur 3C voor een voorbeeld).
- Let op identificeerbare spikes van at4A en at4C neuronen ( Figuur 3C ).
OPMERKING: Opmerking, de at4B spijker amplitude lijkt zeer vergelijkbaar met at4A 10 en kan niet gemakkelijk worden geïdentificeerd zonder geur stimulatie. - Let op dat de basale brandfrequentie van de at4A neuronen isRond of onder 20 Hz.
OPMERKING: Dit criterium is specifiek voor at4A omdat de basale brandfrequentie voor de neuron hoger is dan die van de basiconische ORNs 2 . Een veel hogere basale branding geeft aan dat de neuronen tijdens de elektrode-invoeging beschadigd kunnen zijn.
- Sluit de cartridge aan op de geurstofafgiftebuis. Begin met de oplosmiddelcontrole en vervolgens de geurstoffen, van lage tot hoge concentraties. Gebruik de micromanipulator om de cartridge naar de prep te manoeuvreren terwijl u de cartridge helemaal in de kop van de prep stuurt. Bevestig visueel dat de cartridge rechtstreeks op de antenne is gericht ( figuur 4 ) vanaf een paar millimeter weg.
OPMERKING: Het doel is de opening van de cartridge direct op de antenne te oriënteren en te plaatsen in de nabijheid van het doelweefsel. - Zorg ervoor dat de geurpatroon van de opnameelektrode aan de rechterkant is gescheiden van 1 - 2 mm en van de vliegvoorzijdeP onderaan met ongeveer 1 mm.
OPMERKING: In de hier beschreven beschrijving is de geurcartridge nauw begrensd door de opnamelektrode, de referentieelektrode en de vlieg-prep-dia ( Figuur 4 ).
OPMERKING: Let op de afstand tussen de cartridge en de opname- / referentieelektroden. Een afstand van ongeveer 4 mm wordt aanbevolen 1 . Onbedoeld contact kan het signaal stoppen en de punt van de opnameelektrode breken, de huidige neuron beschadigen en verdere opnames compliceren.
OPMERKING: Beschouw de afstand die de cartridge en de vliegende prep dia scheidt. Als u de coverlip aanraakt, kan de opname-elektrode ook worden ontworpen om de opname te storen. - Druk op "Record" in de data acquisition software om de opname te starten.
OPMERKING: Voor elke 10 s opname wordt een enkele 500 ms geurpuls direct aan de antenne geleverd, zoals beschreven in stap 1.9. - Na het toepassen van geurstoffen,Zet de cartridge voorzichtig terug voordat u hem vervangt met een patroon met de volgende hoogste concentratie. Ga door totdat het volledige doseringsbereik is verkregen.
OPMERKING: Het is aan te bevelen dat er slechts één Or47b ORN van elke vlieg wordt opgenomen om eventuele effecten van aanpassing te vermijden. - Spoel de opnamelektrode met gedestilleerd water grondig af nadat u de opname voor de dag hebt afgesloten.
- Analyseer en plot de gegevens met behulp van commercieel verkrijgbare offline analyse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze techniek werd succesvol toegepast om de relatieve werkzaamheid van de trans ( Figuur 5A ) versus cis ( Figuur 5B ) isomeren van palmitoolzuur te bepalen. De representatieve gegevens tonen aan dat trans -palmitoleic zuur een effectievere ligand voor Or47b ORNs vergeleken met het cis-isovorm (figuur 5C). Een enkele neuron werd geregistreerd van elke vlieg, met twaalf vliegen geregistreerd per doseringskurve, voor een totaal van 24 vliegen. De collectieve gegevens werden verkregen uit drie onafhankelijke herhalingen van de experimenten, met 8 vliegen opgenomen in elk van de experimenten. De foutbalkjes vertegenwoordigen de sem
Opvallend, de afstand tussen de opening van de geurcartridge en het hoofd van de vlieg heeft een belangrijke invloed op het resultaat van de opname. Om een significant antwoord op pAlmitoleïnezuur in Or47b ORNs, hebben we het geurmiddel op korte afstand, ongeveer 4 mm verwijderd van de antenne 1 ( Figuur 6A ) gepresenteerd. Wanneer palmitolezuur verder uit de antenne wordt gepresenteerd (~ 11 mm), kunnen we nauwelijks een significante reactie van dezelfde Or47b ORNs zien ( Figuur 6B ). Deze resultaten onderstrepen het belang van de close-range presentatie van palmitoolzuur ( Figuur 6C- D ). De gegevens werden verzameld uit parallelle experimenten van 6 mannelijke vliegen (Berlijn, 7 d oud). Een enkele Or47b ORN werd opgenomen / vliegen. De foutbalkjes vertegenwoordigen de sem
Figuur 1: Cartridge- en Olfactometer Setup. ( A ) Bereiding van geurpatronen. Van links naar rechts: een standaard 200 μlPipet tip, de eerste en tweede cartridge secties, en een ingevulde geurpatroon. ( B ) De patroon aangesloten op de olfactometer, waarbij de afwaartse hengel van de tweede sectie wordt weergegeven. ( C ) Olfactometer setup die de geurafgiftebuis op de micromanipulator toont, met een bijgevoegde geurcartridge. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Drosophila Preparation. ( A ) Een volledige voorbereiding, waarin de relatieve posities van de vlieg, deksel en de houder worden weergegeven. ( B ) Close-up van de prep, waarbij de positie van de vlieg, zijn antenne-oriëntatie en zijn clypeus wordt weergegeven. De houder wordt over de arista geplaatst,Het derde antennesegment vastzetten op de dubbelzijdige tape. ( C ) Rig setup. Alle belangrijke componenten worden geannoteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Identificatie van het at4 Sensillum voor SSR. ( A ) 4X-weergave van de prep, waarbij de referentieelektrode in de clypeus wordt geplaatst, de vasthoudstang bovenop de arista en de opnamelektrode die zich in de buurt van het derde antennesegment bevindt. ( B ) 50X aanzicht van de elektrode, gereed voor inbrengen in de at4 trichoid. Inset: Afbeelding van de positie van de opnamelektrode. ( C ) Representatieve SSR-sporen van de baseline spike-activiteit, waarbij goede (bovenste) of slechte (onderste) signaal-naar-nois wordt aangetoondE verhouding. Een goede signaal-ruisverhouding zorgt voor een betrouwbare identificatie van at4A en at4C spikes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Plaatsing van cartridges. ( A ) De geurcartridge is op een afstand van enkele mm helemaal in het hoofd van de vlieg gericht. ( B ) Een andere weergave van de prep en olfactometer vanuit een andere hoek. ( C ) Een close-up van de prep en olfactometer, waarbij de positie van de geurcartridge boven de vliegende prep dia wordt weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve Sporen en Dosering Curves van Or47b ORNs in reactie op cis- of trans- palmitoolzuur. ( AB ) SSR van de at4A ORNs die de Or47b receptor met trans- ( A ) of cis -palmitoolzuur ( B ) uitdrukken. Opnamen werden uitgevoerd met 7-jarige WT Berlijnse mannen. Corresponderende piekrasters (midden) en een peri-stimulus-tijdshistogram (bodem binnen 50 ms) worden hieronder weergegeven onder de steekproeven (n = 12). ( C ) Dosis-respons curves die de Or47b ORN piek antwoorden vergelijken op cis- of trans- palmitoolzuur. Gemiddelde ± sem (* p <0,05; ** p <0,01; t- test). Ctrl: Negatieve controle zonder palmitoolzuur. Klik hier alsjeblieftOm een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 6: De activatie van at4A door palmitoleenzuur vereist stimulatie op de korte afstand. ( AB ) SSR van de at4A ORNs in 7-jarige wildtype Berlijnse mannen. Cis -palmitoolzuur werd op een strak bereik (~ 4 mm) of verder weg geleverd (~ 11 mm) (n = 6). ( C ) Vergelijking van de bijbehorende piekreacties (binnen bij 50 ms, gladde peri-stimulus tijd histogrammen). ( D ) Vergelijking van de corresponderende gemiddelde piek responsen. De reacties van at4A tot palmitoleenzuur dalen duidelijk als de stimulusafstand toeneemt. Reprinted met toestemming van figuur S4 in referentie 1 . Klik hier om een te bekijkenGrotere versie van deze figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een procedure waarbij de reacties van Or47b ORNs op palmitolezuur robuust kunnen worden geïnduceerd en opgenomen. Wij hebben een conventionele methode voor afgifte van lange afstand geur 2 , 7 , 10 aangepast om het probleem van onvoldoende feromoongeurstofafgifte te oplossen. We hebben de kwestie van vluchtige luikantilatiteit aangepakt door de verbinding via geurpatronen te leveren, waarvan de opening binnen millimeter van de prep wordt gepositioneerd. Wanneer rekening wordt gehouden met de consistente constructie en plaatsing van elke geurcartridge, manifesteert dit protocol zich als een effectieve methode om anders ontoegankelijke geurstoffen op een reproduceerbare manier te presenteren.
De hier beschreven beschrijving van de luidsprekende geurpresentatie is significant met betrekking tot bestaande geurafleveringsmethoden. Het laat een verscheidenheid aan toekomstige toepassingen toe, met inbegrip van het screenen van andere lOw-vluchtige reukstoffen voor reacties in niet alleen ORN's gehuisvest in trichoid sensilla 1 , maar die gevonden in elk sensillum type. De procedure zorgt voor een efficiënte afgifte van feromon-geurstoffen via een luchtpuls in plaats van door een glazen capillair te verplaatsen die de geurstoffen naar de antennes 6 verplaatst. Onze modificatie minimaliseert de mogelijkheid om het weefsel direct aan te brengen met het geurstof-bevattende glazen capillaire, zoals ondersteund door de experimentele resultaten waarin we alleen palmitoleenzuurverwante reacties waargenomen hebben nadat we de geurpuls hebben afgeleverd. Daarnaast biedt onze methode uitstekende tijdelijke controle op snelle geur aanvang en offset.
Opgemerkt moet worden dat, ondanks het gedemonstreerde potentieel van de procedure, het niet zonder beperkingen is. In onze procedure vertrouwt de positionering van de cartridge helemaal op handmatige aanpassing, waardoor het technisch moeilijk is de cartridge preci te plaatsenOp dezelfde locatie van trial to trial. Daarnaast is speciale aandacht voor kritieke stappen van het protocol vereist om ervoor te zorgen dat het succesvol wordt uitgevoerd. Af en toe worden zeer variabele reacties op een bepaalde geurconcentratie aangetroffen. In de meeste gevallen wordt de oorzaak aangetroffen naar inconsistente cartridge-plaatsing. Daarnaast moeten stringente selectiecriteria voor at4 sensilla worden waargenomen voor opname. Uniforme at4A piekgroottes van hoge signaal-geluidsverhoudingen ( Figuur 3C ) zijn een belangrijke benchmark, terwijl een bescheiden basale brandfrequentie de afwezigheid van neuronale schade aangeeft. De mate van technische moeilijkheid van deze procedure wordt meer dan gecompenseerd door zijn vermogen om feromon-geurstoffen uit rangen te leveren die de waargenomen nabijheid simpelweg simuleren tussen een man en de doelwitvrouw.
Samengevat biedt onze methode van reukstofaanbieding toegang tot palmitoolzuur voor gebruik in SSR van Or47b ORNs. Echter, de toepassing vanDeze techniek is niet beperkt tot een enkele feromoon, maar is gemakkelijk aan te passen aan elke andere lage vluchtige geurstof, waardoor het een veelzijdige analytische techniek maakt bij het beoordelen van eerder ontoegankelijke geurstoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Ye Zhang voor de hulp met de voorbeeldsporen en Tin Ki Tsang voor de hulp met de foto's. Dit werk werd ondersteund door een Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award en een NIH-subsidie (R01DC015519) aan C.-YS en NIH subsidies (R01DC009597 en R01DK092640) aan JWW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
