Summary
O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como apresentar odorantes de baixa volatilidade para a gravação de sensibilidade única a partir de neurônios receptores olfativos de Drosophila que respondem a feromonas cuticulares de cadeia longa.
Abstract
Os insetos dependem do seu odor do sono para orientar uma ampla gama de comportamentos que são críticos para sua sobrevivência, como busca de alimentos, evasão de predadores, oviposição e acasalamento. Muitos produtos químicos de volatilidades variáveis foram identificados como odorantes naturais que ativam os neurônios de receptores olfatórios de insetos (ORNs). No entanto, o estudo das respostas olfativas a odorantes de baixa volatilidade foi dificultado pela incapacidade de apresentar efetivamente tais estímulos usando métodos convencionais de entrega de odor. Aqui, descrevemos um procedimento que permite a apresentação efetiva de odorantes de baixa volatilidade para a Gravação Single-Sensillum in vivo (SSR). Ao minimizar a distância entre a fonte de odor e o tecido alvo, este método permite a aplicação de odorantes biologicamente salientes, mas até então inacessíveis, incluindo o ácido palmitoleico, um feromônio estimulante com efeito demonstrado sobre ORN envolvidos no namoro e comportamento de acasalamento 1 .Nosso procedimento permite, assim, uma nova via para ensaiar uma série de odorantes de baixa volatilidade para o estudo da olfação de insetos e da comunicação de feromonas.
Introduction
As ORN de Drosophila respondem a um grande número de odorantes, com extensões de cadeia de carbono amplamente variadas e uma variedade de grupos funcionais, incluindo ésteres, álcoois, cetonas, lactonas, aldeídos, terpenos, ácidos orgânicos, aminas, compostos de enxofre, heterocíclicos e aromáticos 2 , 3 . Os odorantes variados em suas características físico-químicas podem ter volatilidades marcadamente diferentes, indicadas pela pressão de vapor do composto. Notavelmente, os odorantes biologicamente relevantes para Drosophila melanogaster diferem enormemente em sua volatilidade. Por exemplo, as ORN Ir92a respondem à amônia 4 , que é altamente volátil, com uma pressão de vapor de 6,432 mmHg a 20 ° C. Em contraste, Or67d ORN responde a um feromônio masculino, cis- acetato de vccencenilo ( c VA) 5 , 6 , cuja pressão de vapor é de 43 mmHg a 20 ° C.
Ove_content "> Estudar a resposta olfativa a odorantes de baixa volatilidade é particularmente desafiador com os métodos convencionais de entrega de odor, nos quais os odorantes são entregues através de um fluxo de ar transportador sobre uma distância relativamente longa ( ou seja, vários centímetros). Como tal, as respostas olfativas relatadas Para um determinado odorante de baixa volatilidade pode variar muito, dependendo do design do sistema de entrega de odor. Por exemplo, a resposta relatada de Or67d ORNs a uma dose elevada de c VA varia de ~ 40 7 -> 200 picos / s 6 Além disso, a entrega ineficaz de c VA com métodos de entrega convencionais provavelmente é atribuída a resultados falso-negativos, levando à interpretação de que c VA por si só não é suficiente para ativar Or67d ORNs 8. Essa interpretação foi posteriormente desafiada por outro estudo usando um odor método de entrega de curto alcance 9. é, por conseguinte, imperaPara desenvolver um sistema robusto de entrega de odor para a apresentação efetiva de odorantes de baixa volatilidade.Recentemente, identificamos vários ácidos graxos cuticulares de cadeia longa como ligandos para Or47b ORNs. Eles estão alojados no tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Entre os odorantes de ácidos graxos de cadeia longa, descobrimos que o ácido palmitoleico funciona como um feromônio afrodisíaco que promove o namoro masculino ativando Or47b ORNs 1 . No entanto, em outro estudo usando um método de entrega de odor convencional, o laurate de metilo mostrou provocar respostas de Or47b ORNs, enquanto que o ácido palmitoleico não provocou resposta quando apresentado a partir da mesma distância 10 . Em comparação com c VA, os ácidos gordurosos de cadeia longa são ainda menos voláteis, com pressões de vapor inferiores a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . A baixa volatilidade intrínseca de odorantes de ácidos graxos de cadeia longa, que impede a apresentação eficiente à antena viaSistemas convencionais de entrega de odor, provavelmente representaram os resultados falso-negativos 10 . Esta inconsistência destaca a inadequação dos sistemas convencionais de entrega de odor na apresentação de odorantes de baixa volatilidade. Foi anteriormente demonstrado que a entrega efetiva de odores cuticulares de mosca requer proximidade próxima entre a fonte de odor e o tecido alvo 6 . Assim, para caracterizar completamente os efeitos das feromonas biologicamente ativas, imitando a distância a partir da qual provavelmente são encontradas pelas moscas da fruta na natureza 12 , 13 , concordamos que a distância mínima deve ser dada prioridade em nosso procedimento.
Nosso método possui outras vantagens, incluindo a compatibilidade com plataformas e técnicas de eletrofisiologia padrão. Configurações de plataforma pré-existentes requerem modificações mínimas para acomodar este protocolo, e a maioria das etapas de SSR requerem apenas pequenos ajustes. esteTorna nossa técnica prontamente acessível para pesquisadores experientes em SSR. Além disso, nossa técnica permite a apresentação de odorantes de baixa volatilidade com início e deslocamento nítidos, correlacionando o estímulo com a resposta neuronal. Finalmente, o layout de hardware facilita trocas rápidas entre cartuchos odorantes, agilizando a coleta de dados em uma faixa de dosagem desejada.
Começamos por revisar a preparação de eletrodos de referência e de gravação, solução de Hemolinflamadinha Adulto (AHL), cartuchos de entrega de odorantes e o correspondente olfatômetro. Em seguida, discutimos a preparação das soluções de odorantes com ácido palmitoleico, seguido da preparação da mosca para gravação. Continuamos a considerar os critérios para a seleção de um sensil trichoid para registrar e examinar mais de perto o posicionamento do cartucho odorante antes de apresentar dados representativos adquiridos usando este método. Finalmente, concluimos explorando aplicações úteis desta técnicaAlguns problemas encontrados e suas soluções.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação do hardware para a gravação at4
- Use um instrumento de extração de pipeta para preparar eletrodos com capilares de vidro de aluminossilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Destrua ligeiramente a ponta do eletrodo de referência com um par de pinças finas para facilitar a inserção no clypeus da mosca ( ou seja, uma placa arredondada na frente da cabeça da mosca, acima das partes bucais).
NOTA: os homens WT de 7 dias de idade (Berlim) foram utilizados neste estudo. Use a solução salina AHL 14 como o eletrólito para ambos os eletrodos. - Prepare 1 L de AHL através da mistura de 900 ml de água destilada, com 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO3, 0,1120 g de NaH 2 PO 4, 1,892 g de trealose ּ 2 H 2 O, 3,423 g de sacarose, 1,192 g de HEPES e 8,2 mL de 1 M de MgCl2. Usando água destilada, coloque o volume total até 1 L. Traga o pH para 7,4 usando 1 N de NaOH e esterilize a solução com umSistema de filtro a vácuo. Para armazenamento a longo prazo, mantenha as alíquotas de AHL a 4 ° C.
NOTA: Entregas consistentes de ácido palmitoleico dependem da uniformidade entre cartuchos. É fundamental que cada cartucho seja montado de forma reprodutível. - Usando uma lâmina de barbear, remova 0,9 cm da ponta de uma dica de pipeta de 200 μL para criar a primeira seção do cartucho, medindo 4,1 cm; Consulte as dimensões detalhadas na Figura 1A . Use outra ponta de pipeta de 200 μL e remova 1,7 cm e 1,5 cm da ponta e da base, respectivamente, para criar a segunda seção de cartucho, medindo 1,8 cm ( Figura 1A ). Use uma régua para garantir a reprodutibilidade.
- Use um perfurador de orifício ⅛ para cortar discos de papel de filtro.
- Use fórceps para colocar um disco de papel de filtro na ponta da segunda seção do cartucho. Confirme visualmente que há uma abertura na ponta do cartucho através da qual o ar pode passar.
- Conecte as seções de cartucho primeiro e segundo juntas, como mostrado na Figura 1A . Aumente a segunda seção do cartucho para baixo para facilitar o apontar quadrado para a preparação ( Figura 1B ).
- Conecte o cartucho com o tubo de fornecimento de odor, que é montado em um micromanipulador.
NOTA: Este design permite que o cartucho seja girado para fora para facilitar a troca ( Figura 1C ). - Defina o fluxo de ar humidificado constante para 2 L / min em um controlador de massa e o fluxo de odorantes para 500 mL / min em outro controlador de massa.
- Usando o software (veja a Tabela de Materiais ), programe o procedimento para administrar um sopro de odor de 500 ms.
2. Preparação de Soluções de Odorante de Ácido Palmitoleico para Entrega
NOTA: Or47b ORNs respondem tanto ao ácido cis como ao trans -palmitoleico. Como o ácido palmitoleico é instável em RT, os estoques são armazenados a -20 ° C e utilizados dentro de um mês após a abertura. O etanol é o solvente de escolha para o ácido palmitoleico.
- Use um misturador de vórtice para misturar completamente 10 μL de estoques de ácido cis- ou trans- palmitoleico ou diluições com 90 μL de etanol a 100% para diluições em série de dez vezes em microtubos de 1,7 mL. Prepare diluições frescas de ácido palmitoleico diariamente antes de experiências e use em um dia.
NOTA: Para os odorantes que não são solúveis em etanol, recomenda-se um frasco de vidro para a preparação de diluições de odor com outros tipos de solventes orgânicos. - Usando uma micropipeta P10, aplique 5 μL de soluções de ácido cis- palmitolico das diluições desejadas no papel de filtro em cada cartucho correspondente.
NOTA: A dose mais alta (10 -1 ) contém 450 μg do composto. Para as soluções de trans- palmititoleico, aplique 4,5 μL em vez disso, de modo que a dosagem mais alta (10 -1 ) também contém 450 μg de tEle compôs. - Para evaporar completamente o solvente, coloque os cartuchos de ácido palmitoleico em um dessecador de vácuo durante 1 h à RT e 7,59 mmHg de pressão.
NOTA: Os cartuchos podem ser usados por até 4 h na RT.
3. Preparação da Drosophila para o Acesso Prático ao At4 Sensilla para Gravação Eletrofisiológica In Vivo
NOTA: As moscas WT (Berlim) são criadas em meio de farinha de milho padrão a 25 ° C em um ciclo luz-escuro de 12:12. Após a eclosão, as moscas são separadas por sexo em grupos de dez, pelo que são alojados em grupo até 7 d de idade. Or47b ORNs em moscas masculinas e femininas respondem ao ácido palmitoleico. Por simplicidade, apenas as moscas do sexo masculino são examinadas no estudo atual.
- Montar um slide de preparação de moscas: em uma lâmina de vidro, coloque uma lamínula de vidro (18 x 18 mm 2 ) em uma pequena quantidade de argila de modelagem, formando um ângulo de ~ 3 ° com a lâmina de vidro. Coloque fita dupla face no interior eDge do lamínula e na área do slide imediatamente abaixo. Substitua por fita fresca por cada dia de gravação ( Figura 2A ).
- Use um aspirador de mosca 15 para coletar a mosca de interesse na tubulação e, em seguida, coloque uma ponta de pipeta de 200 μL sobre o final da tubulação. Simultaneamente, mova o tubo para a frente enquanto sopra ar para dentro do tubo para empurrar a mosca até o final da ponta da pipeta. Use uma lâmina de barbear para cortar logo abaixo do corpo da mosca e 2 cabeças acima da mosca.
- Tampue a parte inferior da ponta da pipeta com argila de modelagem, empurrando a mosca para cima até que as antenas e o clypeus sejam expostos ( Figura 2B ). Para evitar matar a mosca, adicione apenas argila suficiente para expor as antenas e aristae, pois isso evita que o abdômen da mosca seja esmagado. Além disso, adicione argila lentamente e suavemente para evitar qualquer constrição súbita. Confirme se a mosca está viva procurando por antennalOu movimento de probóscis.
- Use fórceps para manobrar a ponta da pipeta que abriga a mosca. Oriente a cabeça de modo que o clypeus esteja virado para a direita do observador. Ajuste a preparação ao longo da lamínula usando fórceps finos até o lado lateral da antena ficar de encontro à superfície do coxiforme gravado ( Figura 2B ).
- Coloque uma haste de retenção no arista para proteger a antena da fita dupla face para evitar o movimento ( Figura 2B ).
NOTA: A haste de retenção é puxada de um capilar de vidro de borosilicato com um extrator de pipeta e mantida em posição com argila de modelagem ( Figura 2A ). - Coloque a preparação no palco da plataforma ( Figura 2C ). Usando o microscópio, confirme que os trichoides são visíveis ao longo da borda distal-lateral do terceiro segmento da antena.
NOTA: Idealmente, a sensilla deve ser claramente mostrada em silhueta em segundo plano, o que simplifica a sua Identifica e facilita a gravação ( Figura 3 ). Nesta preparação, a maioria da sensilla trichóide acessível é do tipo at4. - Mantenha a preparação sob fluxo de ar humidificado constante (2 L / min) entregue através de um tubo de distribuição de ar separado a uma distância de cerca de 2 cm da preparação ( Figura 4 ), conforme descrito anteriormente 2 , 15 .
4. Gravação da atividade de At4 Sensillum a partir de Or47b ORNs nos Trichoids at4 em Resposta ao Ácido Palmitoleico
- Insira o eletrodo de referência no clypeus ( Figura 3A ). Para evitar danos nos tecidos, assegure-se de que o eletrodo esteja inserido logo abaixo da superfície, onde pode entrar em contato com a hemolinfa sob a cutícula, com um movimento rápido e suave.
- Abaixe o eletrodo de gravação lentamente até que ele entre no mesmo plano de visão que o sensículo alvo (= "Xfig"> Figura 3B). Gravar sob uma lente objetiva 50X.
NOTA: A cutícula tricoide resistente necessita de inserir o eletrodo de gravação na base sensilar, cuja área mais ampla fornece um alvo maior que reduz a probabilidade de o eletrodo ser desviado ( Figura 3B , inserção). - Antes de aplicar estímulos de odor ao sensilum, observe os seguintes critérios de seleção; Qualquer trichoide que não atinja esses padrões deve ser rejeitado e outro sensilum escolhido em vez disso.
- Observe uma alta relação sinal-ruído (veja a Figura 3C para um exemplo).
- Observe os picos identificáveis dos neurônios at4A e at4C ( Figura 3C ).
NOTA: De notar, a amplitude de espiga at4B parece muito semelhante a at4A 10 e não pode ser facilmente identificada sem estimulação de odor. - Observe que a taxa de disparo basal dos neurônios at4A éEm torno ou abaixo de 20 Hz.
NOTA: Este critério é específico para at4A porque a taxa de disparo basal para o neurônio é maior que a das ORN básicas 2 . Um disparo basal muito maior indica que os neurônios podem ter sido danificados durante a inserção do eletrodo.
- Conecte o cartucho ao tubo de entrega de odorantes. Comece com o controle do solvente e depois os odorantes, de baixas a altas concentrações. Use o micromanipulador para manobrar o cartucho em direção à preparação, ao mesmo tempo que apontar o cartucho diretamente na cabeça da preparação. Confirme visualmente que o cartucho é apontado diretamente para a antena ( Figura 4 ) a partir de alguns milímetros de distância.
NOTA: O objetivo é orientar a abertura do cartucho diretamente na antena e posicioná-lo próximo ao tecido alvo. - Certifique-se de que o cartucho odorante esteja separado do eletrodo de gravação à direita por 1 - 2 mm e do pré da moscaP desliza abaixo por aproximadamente 1 mm.
NOTA: Na instalação descrita aqui, o cartucho odorante está estreitamente alinhado pelo eletrodo de gravação, o eletrodo de referência e o slide de preparação de moscas ( Figura 4 ).
NOTA: Preste atenção na distância entre o cartucho e os eletrodos de gravação / referência. Recomenda-se uma distância de cerca de 4 mm 1 . O contato involuntário pode terminar o sinal e quebrar a ponta do eletrodo de gravação, danificando o neurônio atual e complicando outras gravações.
NOTA: Considere a distância que separa o cartucho e o slide de preparação da mosca. Tocar a lamínula também pode desalojar o eletrodo de gravação para interromper a gravação. - Pressione "Gravar" no software de aquisição de dados para iniciar a gravação.
NOTA: Para cada gravação de 10 s, um único pulso de odor de 500 ms é entregue diretamente à antena, conforme descrito no passo 1.9. - Após aplicação odorante,Retire cuidadosamente o cartucho antes de substituí-lo por um cartucho da próxima concentração mais alta. Continue até que toda a gama de dosagem seja obtida.
NOTA: Recomenda-se que apenas um Or47b ORN seja gravado de cada mosca para evitar possíveis efeitos de adaptação. - Enxaguar completamente o eletrodo de gravação com água destilada depois de terminar a gravação durante o dia.
- Analise e trate os dados usando o software de análise off-line comercialmente disponível.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nossa técnica foi aplicada com sucesso para determinar a eficácia relativa dos isómeros trans ( Figura 5A ) versus cis ( Figura 5B ) do ácido palmitoleico. Nossos dados representativos demonstram que o ácido trans -palmitoleico é um ligando mais efetivo para Or47b ORNs quando comparado à isoforma cis ( Figura 5C ). Um único neurônio foi registrado de cada mosca, com doze moscas registradas por curva de dosagem, para um total de 24 moscas. Os dados coletivos foram obtidos a partir de três repetições independentes dos experimentos, com 8 moscas registradas em cada um. As barras de erro representam o sem
É importante notar que a distância entre a abertura do cartucho de odor e a cabeça da mosca tem uma influência significativa no resultado da gravação. Para obter uma resposta significativa para pÁcido almitoleico em Or47b ORNs, apresentamos odorante a curta distância, a cerca de 4 mm da antena 1 ( Figura 6A ). Quando o ácido palmitoleico é apresentado mais longe da antena (~ 11 mm), dificilmente poderíamos observar qualquer resposta significativa dos mesmos Or47b ORNs ( Figura 6B ). Esses resultados destacam a importância da apresentação de ácido palmitoleico em estreita faixa ( Figura 6C- D ). Os dados foram coletados de experiências paralelas de 6 moscas do sexo masculino (Berlim, 7 d. De idade). Um único Or47b ORN foi gravado / voador. As barras de erro representam o sem
Figura 1: Configuração do cartucho e olfactômetro. ( A ) Preparação de cartuchos de odor. Da esquerda para a direita: um padrão de 200 μLPonta de pipeta, primeira e segunda secções de cartucho e um cartucho de odorante completo. ( B ) O cartucho conectado ao olfatômetro, mostrando a inclinação para baixo da segunda seção. ( C ) Configuração de olfactômetro que representa o tubo de fornecimento de odor montado no micromanipulador, com um cartucho odorante anexado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação de Drosophila . ( A ) Uma preparação completa, mostrando as posições relativas da mosca, lamínula e barra de retenção. ( B ) Vista de close-up da preparação, mostrando o posicionamento da mosca, sua orientação antenal e seu clypeus. A haste de retenção é colocada sobre o arista,Protegendo o terceiro segmento antenal na fita dupla face. ( C ) Configuração do equipamento. Todos os principais componentes são anotados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Identificação do At4 Sensillum para SSR. ( A ) Vista 4X da preparação, mostrando o eletrodo de referência inserido no clypeus, a haste de retenção sobre o arista e o eletrodo de gravação posicionado perto do terceiro segmento antenal. ( B ) Vista 50X do eletrodo, pronta para inserção no tricoide at4. Inserção: Ilustração da posição do eletrodo de gravação. ( C ) Riscos de SSR representativos da atividade de espira basal, demonstrando boa (superior) ou ruim (baixo) sinal-para-ruídoE ratio. Uma boa relação sinal-ruído permite a identificação confiável de picos at4A e at4C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Colocação do cartucho. ( A ) O cartucho odorante é direcionado diretamente na cabeça da mosca a uma distância de alguns milímetros. ( B ) Outra visão do pré e olfactômetro de um ângulo diferente. ( C ) Uma visão em close do pré e olfactômetro, mostrando a posição do cartucho odorante acima do slide de preparação da mosca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Riscos representativos e curvas de dosagem de Or47b ORNs em resposta ao ácido cis - trans -palmitoleico. ( AB ) SSR a partir de OR4 at4A que expressam o receptor Or47b com trans - ( A ) ou ácido cis -palmitoleico ( B ). As gravações foram realizadas com machos WT Berlin de 7 dias de idade. Os rasters correspondentes (ponto médio) e um histograma do tempo de peri-estímulo (inferior, binário a 50 ms) são mostrados abaixo dos traços da amostra (n = 12). ( C ) Curvas de resposta de dose que comparam as respostas de pico Or47b ORN ao ácido cis - trans -palmitoleico. Média ± sem (* p <0,05; ** p <0,01; teste- t ). Ctrl: Controle negativo sem ácido palmitoleico. Por favor, clique aquiPara ver uma versão maior dessa figura.
Figura 6: A ativação de at4A pelo ácido palmitoleico requer estimulação de curto alcance. ( AB ) SSR dos ORN at4A em machos de Berlim Wildtype de 7 dias de idade. O ácido cis -palmitoleico foi administrado a uma distância próxima (~ 4 mm) ou mais longe (~ 11 mm) (n = 6). ( C ) Comparação das respostas de espiga correspondentes (binadas a 50 ms, histogramas de tempo de peri-estímulo suavizados). ( D ) Comparação das respostas de espiga médias correspondentes. As respostas de at4A ao ácido palmitoleico caem acentuadamente à medida que a distância do estímulo aumenta. Reimpresso com permissão da Figura S4 na referência 1 . Clique aqui para ver umVersão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, descrevemos um procedimento pelo qual as respostas de Or47b ORNs ao ácido palmitoleico podem ser induzidas e registradas de forma robusta. Modificamos um método convencional de entrega de odor de longa distância 2 , 7 , 10 para solucionar o problema da entrega insuficiente de odorantes de feromonas. Abordamos a questão da baixa volatilidade odorante através da entrega do composto através de cartuchos odorantes, cuja abertura está posicionada dentro dos milímetros da preparação. Quando se considera a consistente construção e colocação de cada cartucho odorante, este protocolo manifesta-se como um método efetivo de apresentar os odorantes de outra forma inacessíveis de maneira reprodutível.
O procedimento de apresentação de odor de curto alcance descrito aqui é significativo em relação aos métodos de entrega de odor existentes. Permite uma variedade de aplicações futuras, incluindo a seleção de outros lOw-volatility odorants para respostas em não apenas ORNs alojados em tryloid sensilla 1 , mas aqueles encontrados em qualquer sensillum tipo. O procedimento permite a entrega eficiente de odorantes de feromonas através de um pulso de ar em vez de mover fisicamente um capilar de vidro que transporta os odorantes para as antenas 6 . Nossa modificação minimiza a possibilidade de tocar o tecido diretamente com o capilar de vidro que contém odorantes, como sustentado pelos resultados experimentais em que observamos respostas induzidas pelo ácido palmitoleico somente depois que entregamos o pulso de odor. Além disso, nosso método fornece um excelente controle temporal do início rápido do odor e do deslocamento.
Deve-se notar que, apesar do potencial demonstrado do procedimento, não é sem limitações. No nosso procedimento, o posicionamento do cartucho depende inteiramente do ajuste manual, o que torna tecnicamente difícil colocar o cartucho de precisãoSente no mesmo local do ensaio ao julgamento. Além disso, é necessária uma atenção especial às etapas críticas do protocolo para garantir que ele seja executado com sucesso. Ocasionalmente, são encontradas respostas altamente variáveis a uma determinada concentração de odor. Na maioria dos casos, a causa é atribuída ao posicionamento de cartucho inconsistente. Além disso, os critérios de seleção rigorosos para at4 sensilla devem ser observados antes da gravação. Os tamanhos de espessura uniforme de at4A de altas relações de sinal para ruído ( Figura 3C ) são um ponto de referência chave, enquanto uma taxa de disparo basal modesta indica a ausência de dano neuronal. O grau de dificuldade técnica deste procedimento é mais do que compensado pela sua capacidade de fornecer odorantes de feromonas a partir de intervalos que simulam de perto a proximidade observada entre um macho de cortejo e a fêmea alvo.
Em resumo, nosso método de apresentação odorante oferece acesso a ácido palmitoleico para uso em SSR de Or47b ORNs. No entanto, a aplicação deEsta técnica não se limita a uma única feromona, mas é facilmente adaptável a qualquer outro odorante de baixa volatilidade de escolha, tornando-se uma técnica analítica versátil ao testar odorantes previamente inacessíveis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Ye Zhang pela ajuda com os traços da amostra e Tin Ki Tsang pela ajuda com as imagens. Este trabalho foi apoiado por um Prêmio de Carreira Antecipada da Fundação Ray Thomas Edwards e uma concessão NIH (R01DC015519) para concessões de C.-YS e NIH (R01DC009597 e R01DK092640) para JWW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
