Summary
Segmentering af tre-dimensionelle data fra mange Billeddannende teknikker er en stor flaskehals i analyse af komplekse biologiske systemer. Her, vi beskriver brugen af SuRVoS Workbench til semi-automatisk segment volumetriske data på forskellige længdeskalaer ved hjælp af eksempel datasæt fra cryo-elektron tomografi, cryo bløde X-ray computertomografi og fase kontrast X-ray computertomografi teknikker.
Abstract
Segmentering er processen med at isolere bestemte regioner eller objekter i en afbildet diskenhed, så yderligere undersøgelse kan foretages på disse områder af interesse. Når de overvejer analyse af komplekse biologiske systemer, er segmentering af tre-dimensionelle billeddata en tidskrævende og labor intensiv trin. Med den øgede tilgængelighed af mange billeddiagnostiske modaliteter og automatiseret data indsamlingsordninger udgør dette en øget udfordring for den moderne eksperimentelle biolog at flytte fra data til viden. Denne publikation beskriver brugen af SuRVoS Workbench, et program designet til at løse disse problemer ved at udvikle metoder til semi-automatisk segment komplekse biologiske volumetriske data. Tre serier af forskellige forstørrelse og imaging modaliteter er præsenteret her, hver fremhæver forskellige strategier for segmentering med SuRVoS. Fase kontrast X-ray computertomografi (microCT) af frugtsætning-liget af en plante der bruges til at påvise segmentering brug model uddannelse, cryo elektron tomografi (cryoET) af menneskelige blodplader bruges til at demonstrere segmentering ved hjælp af super - og megavoxels og cryo blød X-ray computertomografi (cryoSXT) af et pattedyr cellelinie bruges til at demonstrere etiketten opdeling værktøjer. Strategier og parametre for hver datatype er også præsenteret. Ved at blande et udvalg af semi-automatiske processer i en enkelt interaktivt værktøj, giver SuRVoS flere fordele. Samlet er tid til segment volumetriske data reduceret med en faktor på fem i forhold til manuel segmentering, en grundpille i mange image processing felter. Dette er en væsentlig besparelse når fuld manuel segmentering kan tage uger af indsats. Derudover er subjektivitet rettet ved hjælp af beregningsmæssigt identificerede grænser og opdeling komplekse samlinger af genstande af deres beregnede egenskaber og ikke på et sag til sag grundlag.
Introduction
SuRVoS Workbench er et stykke software designet til at give forskere til at udtrække videnskabeligt relevante oplysninger fra volumetriske data fra forskellige prøver, uanset struktur af interesse, opløsning eller af imaging modalitet1, 2. Volumetriske data baseret såsom disse ofte indsamles ved hjælp af røntgen eller electron tomografi systemer, rutinemæssigt på store laboratorier eller centraliseret faciliteter på grund af deres kompleksitet. Begge disse metoder, og andre teknikker, producere store, information rige datasæt som bevise udfordrende til segmentet med enten semi-automatiske metoder eller manuelt. Især kræver nær native state cryo-immobiliseret datasæt lav-dosis imaging betingelser, hvilket resulterer i et lavt signal / støj-forhold og dårlig kontrast, især i cryo elektron tomografi (cryoET)3,4,5 . En yderligere faktor i nogle 3D datasæt er tilstedeværelsen af artefakter indført af de udfordrende forsøgsbetingelser involveret, for eksempel manglende kile artefakter som følge af indsamling af data over en begrænset vippe rækkevidde, hvilket resulterer i manglende oplysninger og brudforlængelse i retning af bom3,4,5. Når lavt selv signal til støj eller mangler kile artefakter er ikke problematisk (f.eks. fokuseret ion beam SEM6 eller seriel blok ansigt SEM7), kompleksitet og tre-dimensionelle karakter af prøven, og den store mængde data medføre analyse ville stadig drage fordel af en automatiseret proces for data segmentering.
I øjeblikket, når de overvejer biologiske mængder af celler, er der mange muligheder for automatisk eller semi-automatisk identificerer meget specifikke cellulære funktioner, såsom actin, mikrotubuli eller specifikke proteinkomplekser, ved hjælp af en skabelon-baseret søgning, eller at identificere funktioner i specifikke typer af datasæt (f.eks. høj kontrast, farvet, harpiks-embedded prøver)8,9,10,11,12. Men i disse tilfælde på forhånd oplysninger eller specifikke prøve forberedelse protokoller er nødvendigt, begrænser den bred anvendelighed af disse strategier, segmentering. Der findes også værktøjer til rådighed, der udfører model uddannelse på voxel plan at lære udseendet af forskellige strukturer af interesse når det gives bruger input13. Dog på dette niveau kan kompleksiteten af træning og afprøvning af modeller være fejlbehæftet og beregningsmæssigt dyrt. Da de udfordrende billede forhold, og manglen på bredt gældende, semi-automatiske segmentering strategier, er manuel segmentering fælles, selv når du arbejder med komplekse biologiske materialer14,15, 16 , 17. dog er det generelt accepteret, at processen med manuel segmentering ikke er kun tidskrævende, men også fejlbehæftet, subjektive og variabel4,5,18,19 ,20. Nogle segmentering programmer tilbyder værktøjer til at lette manuel segmentering processen (dvs. interpolation, lasso eller slag værktøjer)21,22, men i tilfælde af støjende datasæt, de er vanskelige at anvende med succes, og selv når de er brugt med succes, er processen stadig subjektive og variabel.
Traditionelt, segmenter har været brugt på to måder: kvalitativt eller kvantitativt. Som billeddannelsesteknologier og segmentering strategier forbedre, er det blevet mere almindeligt at bruge segmentering som en kvantitativ værktøj til at besvare spørgsmål, biologiske og som et "ground truth" for algoritme udvikling8,12, 15,23,24,25. For at gøre dette, er detaljeret kontrol og balance forpligtet til at formindske variabilitet og subjektivitet i hele processen26. Men disse forholdsregler yderligere øge den tidskrævende karakter af segmentering. Derfor er det afgørende at give en hurtigere og mindre variable segmentering strategi.
SuRVoS Workbench begynder at løse disse problemer ved at give brugeren med et udvalg af maskinen læring og billedbehandling værktøjer, der hjælper brugeren i forbindelse med segmentering, mens også vejlede brugeren gennem de nødvendige trin. For at opnå dette, er to vigtigste nyskabelser gennemført sammen i SuRVoS. Først, det bruger en super-regionen hierarki til gruppe samme, nærliggende områder af data baseret på deres iboende egenskaber. Hver af regionerne i hierarkiet repræsenterer samme rumfang ved hjælp af færre elementer, mens det stadig giver stærke grænse overholdes. Således, super-regioner reducere kompleksiteten af segmentering en diskenhed ved flere ordrer størrelsesorden endnu stadig repræsentere dataene uden betydelige tab af information27. Andet, SuRVoS giver en semi-automatiske segmentering strategi, der bruger minimal manuel segmentering indgange for at træne klassificører, som derefter anvendes til at inddele den resterende mængde28,29. Denne strategi reducerer manuel segmentering, stærkt faldende mængde Brugertid brugt på segmentering og når du bruger Super-regioner, fjerner manuel afgrænsning af grænser, potentielt reducere variabiliteten og subjektivitet.
Et yderligere centralt element i SuRVoS er Splitter etiketværktøj, hvor en bruger kan klassificere en række allerede segmenterede objekter baseret på deres iboende egenskaber. Efter segmentering af forskellige genstande af interesse, dette værktøj kan bruges til at opdele sæt i underklasser baseret på foranstaltninger såsom gennemsnitlige objekt intensitet, varians, størrelse, placering m.m. dette er nyttigt, når klassificering af store grupper af objekter med høj kompleksitet. For eksempel, en gruppe af cellulære organeller kan opdeles i mitokondrierne, Tom vesikler, lipid dråber, osv.; eller et sæt af materiale optagelser kan adskilles baseret på størrelse eller form. Når opdelt de enkelte etiketter kan være opdelt i grupper benytter et vilkårligt antal klassificeringer, reducere identifikation bias.
SuRVoS Workbench har held været anvendt til segment data fra flere Billeddannende teknikker. Her, der synkrotron X-ray fase kontrast tomografi (microCT) af frugtsætning-liget af en plante bruges til at vise segmentatiom brug af model uddannelse, cryo elektron tomografi (cryoET) af menneskelige blodplader bruges til at demonstrere segmentering ved hjælp af super- og megavoxels og cryo bløde X-ray computertomografi (cryoSXT) af et pattedyr cellelinie bruges til at demonstrere etiketten opdeling værktøjer
Protocol
Bemærk: generelt nyttige intervaller af parametre for hver behandlingstrin og de specifikke parametre for hver datatype, der er vist her er givet i tabel 1.
1. forberedelse af et arbejdsområde og indlæsning af Data
- Launch SuRVoS Workbench, klik på knappen Åbn datasæt, og i den resulterende popup, Marker datafilen til segmenteres. Vælg en passende orientering af datasættet. Næste, vælge eller oprette en mappe, hvor arbejdsområdet og tilknyttede filer vil blive gemt. Det anbefales, at denne mappe er tom, når du starter en ny segmentering. Når dataene er blevet indlæst, på bænken vil åbne med ruden Plugins til venstre, ruden visualisering på ret og et sæt værktøj genveje mellem de to ruder ( figur 1).
2. Forbehandling og Data repræsentation
- i the Vælg ROI under fanen input z, y, og x starten og slutningen koordinaterne for området af interesse, og klik på Tilføj. For at vælge passende y og x musen koordinater hen over et punkt på billedet. Vælge z koordinater ved hjælp af skyderen øverst i ruden visualisering. Når et område er blevet tilføjet, så sørg for det vælges ved at markere feltet til højre. Alle efterfølgende beregninger vil blive udført på det valgte område. Generelt, begyndende med en lille, repræsentative region af interesse (ROI), optimere parametre og derefter igen at anvende disse parametre til hele området for at være segmenteret tilrådes.
- i funktionen kanaler fane, bruge drop-down menuen i toppen til at vælge en funktion/filter og tilføje det til køen (Se diskussion for mere info om funktionen kanaler). Når en feature/filteret er tilføjet og valgt ved at klikke på dets navn, ændre indstillinger specifikt til funktion/filter og vælge den input datasæt at køre funktion/filteret. Når alle indstillinger er blevet valgt, skal du klikke i afkrydsningsfeltet til højre for navnet på funktionen/filter til at beregne.
- For at optimere parametre for et nyt datasæt, tilføje flere filtre/egenskaber og vælge parametrene for dem, før du bliver beregnet for, den ene efter den anden. Tilføje hver ny filterfunktionen for at gøre dette, og vælge passende parametre, afkrydsningsfeltet til venstre for hver filterfunktionen til at køre, og klik på boksen compute funktioner øverst i ruden. Se diskussion for at få yderligere oplysninger.
3. Skabe passende super-regioner
- i the Super regioner fane, i afsnittet Supervoxels Brug rullemenuen kilde til at vælge den filtrerede datasæt fra som supervoxels vil blive oprettet. Angiv derefter form, afstand og kompakthed af supervoxels (Se diskussion og figur 2 for yderligere oplysninger). Endelig, klik på knappen Anvend til at generere supervoxels. Når supervoxels har oprettet de kan ses i ruden visualisering, aktiveres eller deaktiveres og deres gennemsigtighed kontrolleret i visualisering fane og fremviservinduet genvej.
- i afsnittet Megavoxels under fanen i Super regioner Brug rullemenuen kilde til at vælge den filtrerede datasæt fra som megavoxels vil blive oprettet. Næste, angive lambda, numBins og Gamma parametre i megavoxels (Se diskussion for yderligere oplysninger). Når megavoxels har oprettet de kan ses i ruden visualisering, aktiveres eller deaktiveres og deres gennemsigtighed kontrolleret i visualisering fane og fremviservinduet genvej.
4. Introduktion til anmærkningen
- i anmærkninger fanen bruge knappen Tilføj niveau til at tilføje en anmærkning niveau. Når et niveau er blevet tilføjet, skal du bruge knappen Tilføj etiket i dette niveau til at tilføje en etiket for anmærkningen. Når først tilføjede, navnet og farven på etiketten kan ændres for at lette annotation.
- For at begynde at anmærke, vælg derefter ikonet pen fra afsnittet værktøj genvej. Når dette vælges et sæt indstillinger vises øverst i ruden visualisering. Disse indstillinger styrer pen bredden og om voxels, supervoxels eller megavoxels vil blive brugt til at anmærke.
- Med henblik på model uddannelse, generelt, Vælg supervoxels i rullelisten anmærkning niveau og en middelmådig til store pen bredde skal bruges. Vælg etiket til påtegnes af indskrivning boksen længst til højre på etiket information i fanen anmærkninger. Næste, klik på i ruden visualisering at anmærke en enkelt supervoxel, eller klik og træk for at anmærke mange.
Bemærk: Voxels og megavoxels kan vælges i rullelisten anmærkning niveau og bruges til at anmærke på samme måde som for megavoxels, kan give mange tusinder af lignende voxels at blive opdelt med et enkelt klik med musen.
- Med henblik på model uddannelse, generelt, Vælg supervoxels i rullelisten anmærkning niveau og en middelmådig til store pen bredde skal bruges. Vælg etiket til påtegnes af indskrivning boksen længst til højre på etiket information i fanen anmærkninger. Næste, klik på i ruden visualisering at anmærke en enkelt supervoxel, eller klik og træk for at anmærke mange.
5. Segmentering ved hjælp af Model uddannelse påvist med en microCT dataset.
Bemærk: den første segmentering for mange datasæt er at differentiere flere store regioner fra hinanden. For eksempel, adskille kernen fra cytoplasmaet eller cellen fra den eksterne is og støtte struktur. For denne type af segmentering, med klart afgrænsede grænser og store regioner, er model uddannelse nyttige. For at demonstrere dette, vil blive anvendt X-ray fase kontrast tomografisk data for Goosegrass.
- Indlæses data, forbehandle bruge filter og funktion suite og fastlægge passende supervoxels og/eller megavoxels som beskrevet i ovenstående afsnit ved hjælp af parametrene i tabel 1 som guide. Fortsætter med at bruge parametre fra tabel 1 og vejledningen i afsnit 4, groft anmærke nogle store områder af datasættet, som vist i figur 3.
Bemærk: Datasættet behøver ikke at være helt segmenteret på dette punkt. - i the Model uddannelse under fanen predict indstilles til det niveau, der indeholder brugervejledning træning anmærkninger, og i descriptor afsnittet angive regionen til Supervoxels. Dernæst skal du vælge de deskriptorer, der skal bruges til at differentiere regioner af data ved at klikke på Vælg kilder drop-down og kontrollere kasser med funktionerne og filtre af valg (Se tabel 1 og diskussion).
- Næste, klik på knappen predict. Når beregningen er færdig, opdateres ruden visualisering med forudsigelser for alle de ikke-mærket voxels viser hvilke af anmærkning klasser de er forudsagt til at tilhøre. Generelt, standardparametrene for hver klassificering metode giver et godt udgangspunkt, og brugeren bør kun nødt til at skifte mellem klassificeringer, at finde en god pasform. Men for ekspert eller erfarne brugere muligheder for hver klassificering er tilgængelige og kan blive ændret.
- Efter vurdering af virkningen af uddannelsesmetoder og vælge en, anvende yderligere finjustering ved at klikke på Præciser rullemenuen i afsnittet raffinement. På bunden af den Model uddannelse fanen, i den " opdatering anmærkninger " afdeling, Sørg for at visualisering drop-down menuen er indstillet til Predictions. Brug skyderen tillid til at tildele mere eller mindre af den unannotated supervoxels etiketter på udvalgte annotation.
- Efter et passende niveau af tillid er blevet udvalgt baseret på visuel inspektion, bruge knapperne Gem ved siden af etiketterne nederst i værktøjet tillid til at gemme forudsigelser i specifikke etiketter. Ruden visualisering vil opdatere for at få vist ændringerne. Hver etiket kan gemmes separat, og faktisk etiketter kan gemmes fra mindre subregioner ved indtastning af værdier i fra og til z, y, og x kasser og klikke på knappen Gem for hver etiket.
- Adresse mindre fejlmærkning ved at yde yderligere uddannelse data som beskrevet i afsnit 4. Efter passende forudsigelser er føjet til etiketter, Gentag processen med model træning med raffinement og tilføje høj genkendelsessikkerhed forudsigelser, indtil der er ikke flere umærket supervoxels. Det er effektiv, fordi hver gang model uddannelse proces køres der tildeles mere supervoxels at træne med, og dermed processen bliver mere robuste som gentagelser øge.
6. Segmentering ved hjælp af super-regioner, vist med en CryoET Dataset.
NOTE: da super-regionen segmentering er nyttigt for mindre, diskret bundne områder, fokus her vil være på segmentering af organeller og mikrotubuli inden dette dataset. Model uddannelse blev brugt til at hurtigt segment trombocyt fra baggrunden is og kulstof; disse parametre er ikke drøftet yderligere, men præsenteres i tabel 1.
- Indlæses data, forbehandle bruge filter og funktion suite og fastlægge passende supervoxels og/eller megavoxels som beskrevet i ovenstående afsnit ved hjælp af parametrene i tabel 1 som guide.
- Tilføj relevante niveauer og etiketter til fanen anmærkning, vælge en etiket og begynde udfyldelse ved hjælp af en middelmådig pen bredde med supervoxels valgt. Være opmærksomme på behovet for at vælge forskellige etiketter for objekter i umiddelbar nærhed af hinanden for at undgå mærkning dem som et enkelt objekt.
- For at rense anmærkninger yderligere, bruge morfologiske raffinement metoder (dilatation, erosion, åbning, lukning og fyld huller). Disse muligheder kan findes i bunden af fanen anmærkninger. For at bruge dem, Vælg den segmentering etiket og raffinement. Angiv en radiusværdi og vælge, hvordan at anvende forfinelse. Klik på Præciser.
7. Klassificering og analyse af Data objekter baseret på iboende egenskaber, vist med en CryoSXT Dataset
Bemærk: generelt, det næste skridt efter segmentering er analyse af data. Splitter etiketværktøj i SuRVoS giver mulighed for klassificering af segmenterede objekter ved hjælp af regler baseret på iboende egenskaber af genstande som gennemsnitlige objekt intensitet, varians, volumen eller holdning. Label statistikværktøj giver mulighed for visualisering af relationer mellem disse foranstaltninger for hvert nyt objektklasse. Disse er effektive nye værktøjer til analyse af komplekse 3D datasæt efter segmentering.
- Indlæses data, forbehandle bruge filter og funktion suite, fastlægge passende supervoxels og/eller megavoxels og segment som beskrevet i ovenstående afsnit ved hjælp af parametrene i tabel 1 som guide.
- Efter segmentering, klik på fanen andet i ruden visualisering kaldet etiket Splitter. Dette vil tilføje et nyt område til højre side af vinduet - ruden oprettelse af regel.
- På toppen af dette område, skal du vælge et passende niveau og etiketter for etiketten opdeling. Vælg derefter datasæt til at forespørge og klikke på etiketten. Alle objekter i de markerede etiketter vil nu blive skitseret i blå som separate objekter i ruden visualisering og et plot viser den gennemsnitlige intensitet af objekterne, der vises i ruden oprettelse af reglen. Klik på rullelisten øverst i højre side for at ændre foranstaltningen bliver vist i plottet,.
- Til at begynde at opdele objekterne i relevante klasser, klik på Tilføj ny etiket i bunden af ruden oprettelse af reglen. Navn og farve der er forbundet med denne nye etiket kan ændres som beskrevet tidligere.
- Skal du klikke på Tilføj ny regel og ved hjælp af drop-down og freeform post kasser definere reglen skal anvendes. Klik på Anvend for at se effekten af den nye regel i ruden visualisering og plot i ruden oprettelse af reglen. Flere regler kan anvendes til en enkelt etiket og flere etiketter kan oprettes inden for den samme datasæt.
Bemærk: For at indsamle enhver umærkede objekter, oprette en ny etiket og i stedet for at føje en regel til den, skal du klikke på Vælg andre.
- Skal du klikke på Tilføj ny regel og ved hjælp af drop-down og freeform post kasser definere reglen skal anvendes. Klik på Anvend for at se effekten af den nye regel i ruden visualisering og plot i ruden oprettelse af reglen. Flere regler kan anvendes til en enkelt etiket og flere etiketter kan oprettes inden for den samme datasæt.
- Når genstande af interesse er blevet opdelt i nye etiketter, oprette et nyt, tomt niveau under fanen anmærkninger. Derefter Vælg dette niveau i reglen oprettelsen fanen og klik på Gem etiketter. Dette vil gemme de nye etiketter til denne tomme niveau.
- På kanten af ruden visualisering, klik på fanen etiket statistik. Dette vil åbne en ny visualisering ruden, der kan bruges til at begynde at forstå relationer mellem objektklasser i dataene. Øverst, skal du vælge et passende niveau og etiketter og datasæt til forespørgslen.
- Vælg et par af foranstaltningerne af interesse ved at markere afkrydsningsfelterne ud for dem. Klik derefter på etiket. Dette vil producere parvise sammenligning parceller for hver af de valgte foranstaltninger. For at opdatere parceller, Vælg eller fravælg passende foranstaltninger og klik på Update plot.
8. Eksportere Data og segmenter
- eksportere parceller og rå måledata ved at klikke på Eksporter plot og eksportere data, henholdsvis, under fanen etiket statistikker i ruden visualisering.
- Eksporterer billeddataene og segmenter ved at klikke på fanen eksport i ruden Plugins. Først skal du klikke for at vælge en mappe, hvor data vil blive gemt. Dernæst skal du vælge output (rå Data, rå anmærkninger, segmentering masker eller maskerede Data) og format (HDF5, MRC eller TIFF). Endelig, Vælg anmærkning omsætningsled skal udføres ved hjælp af afkrydsningsfelterne, og klik på Eksporter. Dataene kan skaleres og omvendt forud for eksport efter behov. Når du eksporterer den maskerede data, det datasæt, der mask(s) vil blive anvendt til kan vælges ved hjælp af en drop-down menuen.
Representative Results
Tre bind datasæt indsamlet fra tre forskellige teknikker (microCT, cryoET og cryoSXT) blev brugt til at vise tre vigtige funktioner i SuRVoS Workbench: Model uddannelse, super-regionen segmentering og etiket opdeling. Datasæt repræsenterer en forskelligartet gruppe af eksperimentelle resultater, for hver især tilbydes fuld behandling parametre (tabel 1).
For at demonstrere model uddannelse ved hjælp af SuRVoS Workbench, blev en relativt høj kontrast datasæt med regionen definere grænserne valgt. Dette datasæt af frugten af Galium aparineeller goosegrass, blev indsamlet ved hjælp af X-ray fase kontrast tomografi på I13-2 diamant-Manchester Imaging Beamline på Diamond lyskilde, Chilton, Oxfordshire, UK. Frisk prøven blev monteret i luft på en base på stadiet rotation goniometer, på prøve-detektor afstand af 30 mm. eksponering gange var 0,10 s med pink beam spektrum, som har en gennemsnitlig energi omkring 22 keV. Fremskrivninger blev indsamlet gennem 180° med en trin størrelse på 0,1 °. Tomografisk rekonstruktioner blev udført ved hjælp af Savu30,31 med Paganin filter til formering-baserede fasekontrast billeder32 efterfulgt af filtrerede back projektion genopbygning i ASTRA toolkit33 , 34. denne data blev derefter reduceret med 2 x 2 x 2 binning for at reducere filstørrelsen før at være inddata i SuRVoS Workbench.
Først, den input data (figur 3A) blev filtreret og fastspændt (for at fjerne øvre og nedre intensitetsværdierne i data) (figur 3B). På denne måde, baggrund og forgrund blev gjort mere let identificerbar og teksturen af den interne struktur af frugten blev forstærket. Næste, supervoxels blev bygget oven på den filtrerede datasæt (figur 3 c). For at vurdere kvaliteten af supervoxels, var de vises uden data til at bekræfte, at relevante oplysninger om datasættet var godt repræsenteret ved supervoxels (figur 3D). Næste, manuel anmærkninger ved hjælp af supervoxels blev fremlagt som træningsdata på tre skiver af volumen (figur 3E, mørke farver). Denne uddannelse data var tilstrækkeligt til at træne klassificering til at forudsige (lyse farver) områder svarende til baggrund (grøn), frugt stritter (rød), frø materiale (lilla), og omkring kødet (blå). Morfologisk raffinementer blev brugt til at rydde op i segmenter ved at fylde huller, stigende eller faldende som nødvendige (figur 3F). Det samlede tidsforbrug for at bestemme relevante parametre og segmentere dette dataset var 2 h.
For at demonstrere super-regionen segmentering ved hjælp af SuRVoS Workbench, var et larmende og kompleks datasæt valgt15. Dette dataset blev indsamlet ved hjælp af cryoET på det nationale Center for makromolekylære Imaging på Baylor College of Medicine, Houston, TX USA. Kort, blodplader var springet frosset på glød udledes og guld fiducial-behandlede holey carbon TEM gitre. Tilt serien blev indsamlet fra ±65 ° med en 2° tilvækst. Tilt-serien blev derefter ombygget ved hjælp af vejede back projektion i IMOD35.
Efter indlæsning af data i SuRVoS (figur 4A), en region af interesse blev valgt og en passende filtersæt blev anvendt. I dette tilfælde blev en udjævning Gaussisk filter efterfulgt af en samlede variation filter med kontrasten fastspændt brugt til at fremhæve kanter og teksturer af data (figur 4B). Næste, model uddannelse med minimal supervoxel-baseret brugerinput blev brugt til at segmentere trombocyt fra baggrunden is og carbon. Derefter, semi-manuel segmentering med megavoxels og supervoxels blev brugt til at segmentere organeller. Endelig, supervoxel kilde parameter blev ændret til en svagere denoising filter og supervoxel figur blev gjort mindre (Se tabel 1) for at bedre bevare mikrotubuli grænserne for segmentering (figur 4 c). For både organeller og mikrotubuli, hurtig manuel anmærkninger blev brugt hver 5-10 skiver til at vælge den supervoxels, der beskriver funktionen af interesse (figur 4D & 4E). Det samlede tidsforbrug for at bestemme relevante parametre og segmentere region af interesse præsenteret var 6 h.
For at demonstrere etiket opdeling ved hjælp af SuRVoS Workbench, blev et datasæt med mange, forskellige organeller valgt. Dette dataset blev indsamlet ved hjælp af cryoSXT på beamline B24 på Diamond lyskilde, Chilton, Oxfordshire, UK36. Kort, HEK293 celler blev dyrket på guld finder gitre, passende størrelse guld fiducials blev tilføjet og gitteret var springet frosset ved hjælp af en EM med back-sidet blotting. Tilt serien blev derefter indsamlet på mikroskop fra ±65 ° med en 0,5 ° tilvækst. Tilt-serien blev derefter ombygget ved hjælp af vejede back projektion i IMOD35.
Efter indlæsning af data i SuRVoS (figur 5A), en region af interesse blev valgt og en passende samlede variation filter blev brugt til at øge grænserne for organeller hele volumen (figur 5B). Næste, organeller var semi-manually segmenteres ved hjælp af megavoxels og supervoxels, og derefter raffineret med fyld huller, lukning og dilatation til at udjævne kanter (figur 5 c). Den samlede tid til at bestemme relevante parametre og segmentere region af interesse præsenteret var 4 h. Når segmenteringen blev afsluttet, blev etiket Splitter brugt til at visualisere hvert organelle som et objekt i datasæt (fig. 5 d) og forskellige karakteristika om hvert objekt i data plot (figur 5E). Grænsefladen etiket Splitter er interaktive, opdaterer den farve der er forbundet med hver ny etiket klasse i både visualisering og data plot. Dette giver mulighed for oprettelse af forskellige regler baseret på egenskaber forbundet med de data, der kan bruges til at opdele objekterne i nyttige klasser (figur 5F).
Figur 1. Layout og generelle træk ved SuRVoS Workbench.
GUI interface er til venstre, mens ruden visualisering er til højre. Disse to områder er adskilt af en kolonne af værktøjer og genveje. GUI er arrangeret at gå brugeren gennem de vigtigste trin i forbehandlingen af data, at vælge supervoxel og/eller megavoxel parametre, segmentere data, og om nødvendigt ved hjælp af model kurser, eksportere segmenter. Ruden visualisering kan bruges i tre tilstande: grundlæggende visualisering og segmentering vist dataeneog nogen har anvendt filtre og at segmentere data, etiket splitter for at kategorisere objekter til nye etiketter baseret på aspekter forbundet til dataene, og endelig mærke statistikker for at måle og visualisere Karakteristik af de segmenterede objekter. For hver af disse tilstande, drop-down menuen i øverste venstre hjørne kontrol hvilke data er vist, og skyderen øverst styrer z-aksen. Værktøj genveje giver nem adgangskontrol over kontrasten, gennemsigtigheden af lag, zoom, panorering og vende tilbage til "hjem" i visualisering rude og åbning værktøjer til anmærkning som beskrevet i protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Super-regionen hierarki reducerer kompleksiteten af billedsegmentering.
Et billede fra Berkeley segmentering datasæt (BSDS50037) blev brugt til at vise egenskaberne ved og virkningerne af super-regioner. Det originale billede (til venstre) består af tusindvis af voxels, som samles derefter i tilstødende, lignende grupperinger til at oprette et par hundrede supervoxels (center). Supervoxels kan også blive indsamlet i tilstødende, lignende grupperinger til at oprette et par snese megavoxels (til højre). Med hver gruppering, er segmentering opgavens kompleksitet faldet, for både beregningsmæssige og manuel ressourcer. Vigtigere er, en 2D eksempel er vist her, men både supervoxels og megavoxels er 3D. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Behandling af en microCT datasæt ved hjælp af en modellen oplæringsstrategi segmentering.
A. en enkelt 2D udsnit af de rå data. B. anvender en fastspændt samlede variation filter på rådata udvidet grænserne mellem de forskellige aspekter af selve frugtsætning. C. passende supervoxel parametre blev valgt. D. en region af interesse (rød boks c) er vist at demonstrere, at grænserne for dataene, der findes i supervoxels, sig selv. E. tre skiver af lydstyrken med manuel anmærkninger af forskellige områder af datasættet vises i mørke farver (grøn, rød, blå og lilla) og forudsigelser efter kører model uddannelse vises i de samme lyse farver. F. de samme tre skiver med den endelige segmentering efter model uddannelse forudsigelser er blevet accepteret. Skala barer er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Behandling af en cryoET datasæt ved hjælp af en super-regionen segmentering strategi.
A. en enkelt 2D udsnit af de rå data. B. en region af interesse (rød boks i A) med en lagdelt filtersæt anvendes til at forstærke grænserne for organeller. C. eksempel for udfyldelse af en organelle ved hjælp af super-regioner. En enkelt organelle er vist med supervoxels belagt med manuel brugergodkendelse anmærkning vises i sort (venstre) og supervoxels valgt med denne anmærkning, vist i blåt (til højre). D. eksempel for udfyldelse af en mikrotubulus, brug af super-regioner. En enkelt region af mikrotubulus er vist med manuel brugergodkendelse anmærkning vises i sort (venstre) og supervoxels valgt med denne anmærkning, vist i grøn (til højre). E. den endelige segmentering byder trombocyt segmenteret fra baggrunden ved hjælp af model uddannelse (se tabel 1 for detaljer), og forskellige organeller og mikrotubuli segmenteres ved hjælp af en super-regionen segmentering strategi. Farver angiver ikke specifikke organelle typer som de er vist her før klassificeringen. Skalere barer i A, B og E er 1 μm og i C og D er 0,5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Analyse af en cryoSXT datasæt ved hjælp af værktøjet etiket Splitter.
A. en enkelt 2D udsnit af de rå data. B. en region af interesse (rød boks i A) med en samlede variation filter anvendes til at fremhæve organeller. C. den endelige segmentering med supervoxels belagt. D. Visualisering del af etiketten splitter med organeller klassificeres ved hjælp af de regler, der vises i F. E. plot del af etiketten splitter viser den gennemsnitlige intensitet inde hvert objekt med de regler, der vises i F anvendes. Hver lodret linje langs x-aksen repræsenterer et enkelt objekt og er farve-kodet til at matche den klasse, det har fået tildelt. F. eksempel klassificeringsreglerne at adskille forskellige objekter baseret på deres iboende egenskaber. Skala barer er 1 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn / datasæt | Kilde | P1 | P2 | P3 | P4 |
| Gaussisk Filter | Sigma | ||||
| Range / Default | - | [0.5, 10] / 1 | |||
| (G1) cryoET | RAW-data | 1 | |||
| (G2) cryoET | RAW-data | 2 | |||
| Samlede Variation | Lambda | Afstand | # Iter | Klemme | |
| Range / Default | - | [0,1, 30] / 10 | [0,1, 10] / 1 | [50, 500] / 100 | - |
| (TV1) microCT | RAW-data | 10 | 1 | 100 | (1,-) |
| (TV2) cryoET | G1 | 7 | 1 | 200 | - |
| (TV3) cryoET | G2 | 10 | 1 | 100 | - |
| (TV4) cryoSXR | RAW-data | 7 | 1 | 100 | - |
| Tærskel | Vmin | Vmax | |||
| Range / Default |
Tabel 1. Optimerede parametre bruges til at behandle hver af de tre datasæt (microCT, cryoET og cryoSXT).>
For hver parameter gives et generelt formål vifte og standard. I mange tilfælde bruges filtrerede data som en kilde til downstream forarbejdning. I disse tilfælde anvendes en forkortelse til at betegne den nye kilde datasæt. For eksempel, G1 (de Gaussian filtrerede cryoET rå data) blev brugt som input under en samlede variation filter til at oprette TV2. Oplysninger er kun præsenteres for aspekter af Workbench, der blev brugt til at behandle hvert datasæt. For eksempel, Model uddannelse blev ikke brugt under behandling af cryoSXT datasættet præsenteres her, derfor ingen parametre er givet for dette.
Discussion
SuRVoS Workbench adskiller sig fra andre programmer, segmentering, optimering af parametre er et nødvendigt og vigtigt skridt forud for begyndelsen af faktiske segmentering. I nogle programmer, manuel eller semi-manuel segmentering begynder brugeren segmentering inden øjeblikke af åbning af et nyt projekt. Med SuRVoS, fordi store mængder af diskenheden vil blive segmenteret med meget lidt brugerinput og grænser er afgrænset af programmet, er optimere parametrene, der afgørende for en vellykket segmentering. Specifikt, er funktion kanaler og super-regionen bygning to områder, hvor der bør lægges vægt på.
Funktionen kanaler og model uddannelse
Ud over de rå data tillader SuRVoS brugeren at oprette ekstra datasæt eller kanaler stammer fra en eksisterende datasæt. Disse kanaler kan oprettes ved hjælp af et udvalg af beregningsmæssige metoder eller funktion udsugningsanlæg. Hver af data repræsentationerne findes parallelt, og kan være individuelt vises, for at vurdere resultaterne af funktion eller filter ansøgningen. På grund af disse karakteristika omtales de som funktion kanaler i SuRVoS. Der er mange funktion kanal mulighederne inden for SuRVoS. Oplysninger om indstillinger og parametre, der anvendes her, se tabel 1, for en komplet liste og beskrivelse af tilgængelige funktion kanaler besøg https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ 2. Første, støjende datasæt vil drage fordel af denoising med enten de Gaussian eller samlede variation filter. Det anbefales, at yderligere funktion kanal og supervoxel/megavoxel beregninger udføres ved hjælp af en af disse denoised datasæt som datakilde. Generelt, den samlede variation denoised dataset bruges som kildedata for funktionen kanal og supervoxel/megavoxel beregninger. Det foreslås, at først køre med standardværdierne, vurdere resultatet i 3D og endelig iterativt optimere parametre for datasættet. Derudover funktion kanaler kan bygges i "filter sæt" til specifikt isolere aspekter af datasættet, og disse kan derefter bruges som datakilder til at oprette supervoxels og megavoxels. Mens denne strategi er yderst datasæt afhængige, kan det være gavnligt.
Funktionen kanaler bruges også som kilder til at træne klassificeringen i model uddannelse. Når det besluttes, på hvilke funktion kanaler til brug, anbefales det, at et par robust funktion kanaler (f.eks.fra blob påvisning, tekstur og struktur eller robuste funktioner kategorier) bruges når du arbejder med en lille mængde af anmærkninger til at træne de klassificeringen. Når du arbejder med en stor mængde af træningsdata, det anbefales at bruge mere funktion kanaler generelt, fra nogen af kategorierne, så længe de giver varieret oplysninger til klassificeringen (f.eks.tilføje til ovennævnte liste funktion kanaler fra local funktioner og Gaussisk funktioner kategorier).
Der er tre vigtigste dele at modellere uddannelse: at give input datakilder, der beskriver data, ved hjælp af disse indgange til at træne en klassificering og endelig raffinering output forudsigelser. Generelt vil mindre regioner af dataene kræve flere bruger anmærkninger til præcist tog klassificeringen, mens større regioner i data vil kræve færre bruger anmærkninger. Model uddannelse kan først uden at vælge en forfinelse bruges til at finde de bedste forudsigelser. Derefter omfatter forfinelse og optimere parameteren lambda efter behov for at løse problemer med forudsigelser som huller eller takkede kanter.
Supervoxels og megavoxels
Supervoxels er klynger af flere i nærheden lignende voxels38,39. Supervoxels begynder som en standard 3D grid overlejret på de data, der er så iterativt deformeret for at overholde de underliggende grænser, og dermed bedre at repræsentere dataene. Supervoxel oprettelse og deformation er styret af fire bruger input: datakilde, superpixel form, afstand og kompakthed. Datakilden indeholder de data input, der spørges under oprettelsen af supervoxel. Hvilken som helst kilde kan bruges herunder filtrerede datakilder. Superpixel figur parametre afgør 3D startfeltet og den omtrentlige ønskede form af den resulterende supervoxels. Ændre disse parametre kan forøge eller formindske størrelsen af supervoxels før deformation. Afstand mellem parametrene angiver betydningen af grænser i hver retning. Ændre disse parametre kan fremhæve grænser i en eller to retninger på bekostning af den anden (s), hvilket betyder, at den resulterende supervoxels vil deformere for at bedre følge data grænser i en given retning (r). Den sidste parameter, kompakthed, styrer, hvor meget supervoxels kan deformeres. En lav kompakthed nummer tillader supervoxels at deformere mere. Disse parametre skal være optimeret til at give supervoxels, der repræsenterer grænserne for data af interesse. Bemærk: I øjeblikket supervoxel figur parametre skal være lig med 1024 eller mindre, når multipliceret sammen.
På nogle måder, supervoxel parametre kan kompensere for hinanden, hvilket betyder, at der ingen er "rigtige svar" når de beslutter på parametre. For eksempel, en stor startfeltet (f.eks. superpixel form: 10 x 10 x 10) og en lav kompakthed nummer (ex. 20) kan give supervoxels med lignende grænse overholdes i forhold til en lille startfeltet (f.eks. superpixel figur 5 x 5 x 5) og en højere kompakthed nummer (f.eks. 50). Fordi der er mere, mindre supervoxels i det andet scenario, de ikke behøver at deformere så meget til at repræsentere grænser. Begge sæt af parametre, der kunne være relevante for segmentering af datasættet.
Den største overvejelse, når de vælger supervoxel parametre er, hvor godt supervoxels repræsenterer data. Vise supervoxels alene, uden at data nedenunder dem, som i figur 2D, er en god måde at vurdere supervoxel parametre. Når vises på denne måde, bør kanter og konturer af figurerne findes i dataene stadig være synlig i supervoxels.
Megavoxels er konglomerater af flere nærliggende, lignende supervoxels38,39. De er igen kontrolleret af fire bruger input: datakilde, lambda, numbins og gamma. Som med supervoxels, giver datakilden de data input, der spørges under oprettelsen af megavoxel. Både lambda og numbins indvirkning af størrelse og afgrænsning overholdelsen af megavoxels. Som megavoxels vokse større (høj lambda, lave numbins), nedsætter deres overholdelse af grænsen. Modsatte er også sandt, overholdelsen af grænsen vil stige med mindre megavoxels (lav lambda, høj numbins), men som megavoxel størrelse falder, så gør deres anvendelighed i segmentering af store mængder af voxels hurtigt. Valgfri gamma parameteren styrer glathed faktor versus omkostningerne ved fletning to supervoxels sammen. Små værdier af gamma kan forbedre ligheden mellem to supervoxels, på bekostning af at have færre megavoxels samlet.
Som med supervoxels, er den største overvejelse, når du vælger og optimere megavoxel parametre, hvor godt megavoxels repræsenterer data. Vise megavoxels alene som beskrevet for supervoxels kan igen bruges til at vurdere parametre. Men, fordi megavoxels vil generelt være meget større og er tre-dimensionelle, ved hjælp af annotation værktøjer to vælge enkelt megavoxels at sikre, at grænsen mellem regioner af interesse er stram anbefales også.
Anmærkning strategi
To generelle anmærkning strategier er blevet beskrevet: en model uddannelse metode er nyttig til at adskille store områder af et datasæt, mens en super-regionen segmentering tilgang er nyttigt for mindre, mere forskelligartede funktioner såsom individuelle organeller. Anmærkninger kan organiseret i en hierarkisk måde, således at det er muligt at anmærke store regioner først, så opdele dem i mere specifikke områder ved hjælp af en overordnet-underordnet relation. Den overordnede etiket for en etiket kan tildeles ved at klikke på området til højre for etiketten farvevalg og vælge en passende overordnede etiket fra et tidligere niveau. I praksis bruger de fleste datasæt både model uddannelse og super-regionen segmentering strategier for at segmentere specifikke regioner/funktioner af interesse.
I den model uddannelse eksempel her, blev et par uddannelse input (i form af manuel brugergodkendelse supervoxel-baserede anmærkninger) brugt på tre jævnt fordelt udsnit af data. På denne måde øger model uddannelse aspekt af SuRVoS langt den hastighed, hvormed segmentering er muligt, især når de arbejder med store, opdelte regioner som kløften mellem regioner i selve goosegrass frugtsætning som det understreges i Figur 3.
Når model kan uddannelse, hvis forudsigelserne ikke kan ses, det være nødvendigt at gå til fanen visualisering og sørg for, at laget forudsigelser er tændt og indstillet til en passende mængde af gennemsigtighed. Også, en tillid på 0 vil tildele hver umærkede supervoxel til en etiket, baseret på hvad den tætteste match er. Tillid på 100 vil kun tildele en etiket, hvis kun én kategori af etiket har nogen proportional match. Alt i mellem er en afvejning af disse to yderpunkter. Når du vælger et konfidensniveau foreslås det for at kontrollere et par skiver til at visuelt inspicere, at der er ingen forkert forudsagte voxels inden gemmer forudsigelsen i en etiket.
En god strategi til udfyldelse ved hjælp af super-regioner er at bruge værktøjet forstørrelse til at zoome ind på data, anmærke et par organeller på én gang på en skive, ved hjælp af en "hurtig, rodet" strategi første (fig. 4 c). Næste, flytte op eller ned et par skiver i Z og gentage denne proces. Fordi supervoxels er tre-dimensionelle, er mange af fejlene af metoden "rodet" lovbunden anmærkninger foretaget ovenfor eller nedenfor skiver. På denne måde, segmentering er drønede og grænserne er fastsat af supervoxels, snarere end manuelt.
For at rydde op i en etiket, er standard segmentering raffinement indstillinger tilvejebragt. Dilatation årsager valgte segmentering etiket til at vokse ved given radius, erosion får den til at skrumpe. Åbning og lukning er anvendelsen af første erosion og derefter, dilatation, eller vice-versa, henholdsvis. Og udfylde huller gør netop dette. Rækkefølgen af disse operationer betyder noget. Generelt, udfører fyld huller, så åbning, derefter dilatation fungerer godt. Hver raffinement metode kan anvendes på en enkelt skive ("denne skive"), på alle skiver i 2D ("alle skiver (2D)") eller i 3D ("hele volumen (3D)"). Alle skiver (2D) anbefales.
Betydning og fremtidige retninger
Effektiv og præcis segmentering er den næste flaskehals i behandlingen af 3D datasæt, især med den rutinemæssige automatiseret indsamling af terabytes af billeddata under lange løb sessioner. SuRVoS Workbench kan fremskynde segmentering processen med en faktor på 5 i forhold til manuel segmentering. Også, fordi grænserne er afgrænset af supervoxels, variation af de deraf følgende segmenter skal forbedre. I fremtiden håber vi at udforske måder at bruge segmenteringen af en repræsentativ 3D region af interesse som uddannelse data til at anvende resten af den, eller endda en separat diskenhed, med høj genkendelsessikkerhed. Dette fremskridt vil yderligere reducere mængden af Brugertid og input nødvendigt at målgruppen selv komplekse biologiske diskenheder, hjælpe med at lindre image processing og segmentering flaskehals. Dette, igen, vil give en kvantitativ sammenligning af biologiske data i forskellige stater (f.eks. ikke-sygdom, sygdom, behandlet) med robust eksperimentelle numre.
Disclosures
Forfatterne erklærer, de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende og takke Rui Wang og Wah Chiu fra Baylor College of Medicine for at give cryoET datasæt og Andrew Bodey fra Diamond lyskilde for at bistå med I13 beamtime. Dele af denne forskning blev støttet af National Institutes of Health (NIH) grant nummer (P41GM103832) vi anerkender Diamond lyskilde i fællesskab støtte Imanol Luengo under ph.d.-STU0079.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| computer | n/a | n/a | Must be running Linux operating system and have an NVidia GPU with at least 4 GB of memory |
References
- DiamondLightSource/SuRVoS: Version 1.0. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/247547 (2017).
- SuRVoS Workbench - Super Region Volume Segmentation. , Available from: https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ (2017).
- Frangakis, A. S., Förster, F. Computational exploration of structural information from cryo-electron tomograms. Curr Opin Struct Biol. 14 (3), 325-331 (2004).
- Lucić, V., Förster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Lučič, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Milani, M., Drobne, D. Focused ion beam manipulation and ultramicroscopy of unprepared cells. Scanning. 28 (3), 148-154 (2006).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), (2004).
- Rigort, A., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 135-144 (2012).
- Förster, F., Han, B. -G., Beck, M. Visual Proteomics. Meth Enzymolb. 483, 215-243 (2010).
- Liu, Y., Sigworth, F. J. Automatic cryo-EM particle selection for membrane proteins in spherical liposomes. J Struct Biol. 185 (3), 295-302 (2014).
- Asano, S., et al. A molecular census of 26S proteasomes in intact neurons. Science. 347 (6220), 439-442 (2015).
- Garduño, E., Wong-Barnum, M., Volkmann, N., Ellisman, M. H. Segmentation of electron tomographic data sets using fuzzy set theory principles. J Struct Biol. 162 (3), 368-379 (2008).
- Sommer, C., Straehle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE Int Symp Biomed Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Darrow, M. C., et al. Structural Mechanisms of Mutant Huntingtin Aggregation Suppression by the Synthetic Chaperonin-like CCT5 Complex Explained by Cryoelectron Tomography. J Biol Chem. 290 (28), 17451-17461 (2015).
- Wang, R., et al. Electron cryotomography reveals ultrastructure alterations in platelets from patients with ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (46), 14266-14271 (2015).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. eLife. 2, (2013).
- Dai, W., et al. Visualizing virus assembly intermediates inside marine cyanobacteria. Nature. 502 (7473), 707-710 (2013).
- Sandberg, K. Methods for Image Segmentation in Cellular Tomography. Methods Cell Biol. 79, 769-798 (2007).
- Volkmann, N. Methods for Segmentation and Interpretation of Electron Tomographic Reconstructions. Methods Enzymol. 483, 31-46 (2010).
- Tsai, W. -T., et al. From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data. J Vis Exp. (90), (2014).
- FEI. Amira & Avizo 3D: Software for Scientific and Industrial Data. , Available from: https://www.fei.com/software/amira-avizo/ (2016).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Nguyen, H., Ji, Q. Shape-driven three-dimensional watersnake segmentation of biological membranes in electron tomography. IEEE trans med imaging. 27 (5), 616-628 (2008).
- Rusu, M., Starosolski, Z., Wahle, M., Rigort, A., Wriggers, W. Automated tracing of filaments in 3D electron tomography reconstructions using Sculptor and Situs. J Struct Biol. 178 (2), 121-128 (2012).
- Moussavi, F., Heitz, G., Amat, F., Comolli, L. R., Koller, D., Horowitz, M. 3D segmentation of cell boundaries from whole cell cryogenic electron tomography volumes. J Struct Biol. 170 (1), 134-145 (2010).
- Hecksel, C. W., et al. Quantifying Variability of Manual Annotation in Cryo-Electron Tomograms. Microsc Mpicroanal. 22 (3), 487-496 (2016).
- Achanta, R., Shaji, A., Smith, K., Lucchi, A., Fua, P., Süsstrunk, S. SLIC superpixels compared to state-of-the-art superpixel methods. IEEE trans pattern anal mach intell. 34 (11), 2274-2282 (2012).
- Luengo, I., Basham, M., French, A. P. Fast global interactive volume segmentation with regional supervoxel descriptors. Proc. SPIE. 9784, (2016).
- Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation Workbench. J Struct Biol. 198 (1), 43-53 (2017).
- Wadeson, N., Basham, M. Savu: A Python-based, MPI Framework for Simultaneous Processing of Multiple, N-dimensional, Large Tomography Datasets. arXiv:1610.08015 [cs]. , Available from: http://arxiv.org/abs/1610.08015 (2016).
- DiamondLightSource/Savu: Version 1.2. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/198726 (2014).
- Paganin, D., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. J Microsc. 206 (Pt 1), 33-40 (2002).
- van Aarle, W., et al. Fast and flexible X-ray tomography using the ASTRA toolbox. Opt Express. 24 (22), 25129-25147 (2016).
- Palenstijn, W. J., Batenburg, K. J., Sijbers, J. Performance improvements for iterative electron tomography reconstruction using graphics processing units (GPUs). J Struct Biol. 176 (2), 250-253 (2011).
- Mastronarde, D. N. Dual-Axis Tomography: An Approach with Alignment Methods That Preserve Resolution. J Struct Biol. 120 (3), 343-352 (1997).
- Duke, E., Dent, K., Razi, M., Collinson, L. M. Biological applications of cryo-soft X-ray tomography. J Microsc. 255 (2), 65-70 (2014).
- Arbeláez, P., Maire, M., Fowlkes, C., Malik, J. Contour detection and hierarchical image segmentation. IEEE trans pattern anal mach intell. 33 (5), 898-916 (2011).
- Luengo, I., Basham, M., French, A. P. Hierarchical Piecewise-Constant Super-regions. arXiv:1605.05937 [cs]. , Available from: http://arxiv.org/abs/1605.05937 (2016).
- Luengo, I., Basham, M., French, A. P. SMURFS: superpixels from multi-scale refinement of super-regions. , Available from: http://www.bmva.org/bmvc/2016/papers/paper004/index.html 1-12 (2016).
