Summary
多くのイメージング技術から三次元データのセグメンテーションは、複雑な生物システムの分析の主要なボトルネックです。ここでは、さまざまな長さのスケールで半自動的にセグメント体積データを SuRVoS ワークベンチの使用について述べる低温電子線トモグラフィー、クライオ軟 x 線トモグラフィー、および位相コントラスト x 線断層撮影技術からのデータセットの例を使用して。
Abstract
セグメンテーションは、興味のこれらの領域をそれ以上の調査を引き受けることができるため、特定の地域またはイメージのボリューム内でオブジェクトを分離するプロセスです。複雑な生物システムの分析を考慮するときは、時間のかかり、労働集約的なステップがある三次元画像データのセグメンテーション。多くのイメージ投射様相の可用性の向上と自動化されたデータ収集方式で、これはモダンな実験データから知識に移動する生物学者の大きな課題を引き起こします。この文書では、SuRVoS ワークベンチでは、半自動的に複雑な生物学的体積データをセグメント化メソッドを提供することでこれらの問題に対処するために設計されたプログラムの使用について説明します。倍率が異なると画像診断の 3 つのデータセットご紹介、各 SuRVoS にセグメントのさまざまな戦略を強調表示します。位相コントラスト x 線 ct により植物の子実体を使用してモデルのトレーニングを用いた領域分割を示します、ひと血小板の低温電子トモグラフィー (cryoET) を使用してソフト スーパー - と megavoxels、および低温を使用して分割を示します哺乳類の細胞ラインの x 線トモグラフィー (cryoSXT) を使用して、ツールを分割ラベルをデモンストレーションします。戦略とそれぞれのデータ型のパラメーターも掲載されています。半自動のプロセスを単一のインタラクティブ ツールの選択をブレンド、SuRVoS は、いくつかの利点を提供します。全体的な手動分割、多くの画像処理の分野での主力と比較して 5 倍で体積データをセグメント化時間を短縮します。これは、完全な手動分割は努力の週を取ることができる大幅な節約です。また、主観は計算識別境界とケースバイ ケース単位ではなく、計算されたプロパティでオブジェクトの分割の複雑なコレクションを使用して解決されます。
Introduction
SuRVoS ワークベンチは興味、解像度や画像モダリティ1の構造に関係なく、さまざまなサンプルから体積のデータから科学的に関連する情報を抽出する研究者を許可するように設計されているソフトウェアの一部 2。体積データなど、これらは多くの場合 x 線または電子断層レントゲン写真撮影システムを使用して収集されます定期的に基づく大規模で研究室やその複雑さのため設備の集中化。両方これらのメソッドと他の技術、大規模な生産、情報豊かなデータセットのセグメントまたは手動で半自動のいずれとする挑戦的な証明します。特に、ネイティブに近い状態の低温固定データセット必要低線量撮影条件、低い信号対雑音比とコントラストが悪い、特に低温電子断層レントゲン写真撮影 (cryoET)3,4,5 の結果.いくつかの 3 D データセットの他の要因が関与する挑戦的な実験条件によって導入されたアーティファクトの存在、たとえば限られた data collection のため行方不明のくさびアーティファクト チルト範囲、不足している情報の結果、ビーム3,4、5の方向に伸長。でも low 信号対雑音のときまたは (例えば集束イオンビーム SEM6または連続ブロックに直面する SEM7) 行方不明のくさびアーティファクトは問題ではない、複雑さとサンプル、および大量のデータの三次元性質意味解析まだデータのセグメンテーションのための自動化されたプロセスの恩恵します。
現在、細胞の生物学的ボリュームを検討する場合、自動または半自動識別するアクチン、微小管、またはテンプレート ベースの検索を使用して、特定の蛋白質複合体などの非常に特定の細胞機能の多くのオプションまたは、特定の種類のデータセット (例えば高コントラスト、染色、樹脂包埋試料)8,9,10、11,12の機能を識別します。ただし、これらの場合事前情報または特定のサンプル準備のプロトコル、必要、これらセグメンテーション戦略の広範な適用性を制限することです。ボクセル レベルを与えられたユーザー入力13興味の様々 な構造物の外観を学ぶためのモデル トレーニングを実行する使用可能なツールもあります。ただし、このレベルでは、トレーニングとモデルのテストの複雑さはエラーを起こしやすい、負荷にすることができます。挑戦的な画像条件と広く適用可能な半自動セグメンテーション戦略の欠如を考えると、マニュアルでのセグメンテーションは、一般的な複雑な生物学的材料14,15、で作業する場合でも16,17. しかし、それは一般に認められるマニュアルでのセグメンテーションのプロセスがのみ時間がかかりが、またエラーが発生しやすい、主観的、変数4,5,18,19 ではないこと ,20。いくつかの分割プログラム マニュアルでのセグメンテーションのプロセス (すなわち補間、投げ縄、または打撃ツール) を容易にするツールを提供して21,22, しかし、騒々しいデータセットの場合、彼らが正常に適用することは困難と使用時にも彼らは、正常に、プロセスはまだ主観と変数です。
伝統的に、区切りが 2 つの異なる方法で使用されている: 質的または量的。イメージング技術とセグメンテーション戦略を向上させる、アルゴリズム開発8,12、生物的質問に答えるため定量的なツールとして、「地上の真理」としてセグメンテーションを使用してより共通となっている 15,23,24,25。これを行うには、詳細なチェック アンド バランスが変動とプロセス26を通して主体性を減少させる必要があります。ただし、これらの予防措置をさらには、セグメンテーションの時間がかかる自然を増加します。このためより速くより少なく可変セグメンテーション戦略を提供するために重要です。
SuRVoS ワークベンチは、機械学習および画像処理も必要な手順を介してユーザーを指導しながら分割プロセスでユーザーを支援するツールの選択とユーザーを提供することでこれらの問題に対処するため開始されます。そのためには、2 つの重要な革新を一緒に SuRVoS で実装されています。最初に、グループと同様に、固有プロパティに基づいてデータの近隣地域に超領域階層を使用します。各階層の地域はまだ厳密な境界の付着を提供しながら以下の要素を使用して同じボリュームを表します。したがって、超領域は数桁のオーダーでボリュームのセグメント化の複雑さを軽減まだまだ情報27の重要な損失することがなくデータを表します。第二に、SuRVoS は残りのボリューム28,29をセグメントに使用される分類子を訓練する最小限の手動分割入力を使用して半自動セグメンテーション戦略を提供します。この戦略はユーザーのセグメント化に費やした時間の量が大幅に低減、手動分割を減少し、超領域を使用して境界の変動と主観を可能性のある削減マニュアルの描写が削除されます。
さらに SuRVoS の主な機能は、ユーザーことができます一連の固有プロパティに基づいて既にセグメント化されたオブジェクトを分類するというラベルの分割ツール。興味のさまざまなオブジェクトの分割後、サイズ、分散オブジェクトの平均強度などのメジャーに基づいてサブクラスにセットを分割するこのツールを使用できます、オブジェクトの大規模なグループを分類するときこれが役の場所等高い複雑さ。たとえば、細胞小器官のグループがミトコンドリア、空胞、脂肪滴などに分割できます;。またはサイズや形状に基づいて介在物を分けることができる材料のセット。個々 のラベルを分割後ことができますグループに分割を使用する任意の数の分類、同定バイアスを減らすこと。
SuRVoS ワークベンチは、いくつかの画像処理技術からセグメント データに正常に使用されています。ここでは、放射光 x 線位相コントラスト ct により植物の子実体の segmentati を示すためモデルのトレーニングを使用して、スーパーと megavoxels を使用して分割を示すためひと血小板の低温電子トモグラフィー (cryoET) を使用し、哺乳類セルラインの低温ソフト x 線トモグラフィー (cryoSXT) を使用してツールを分割ラベルを示します
Protocol
注: 表 1 のパラメーター処理ステップごとに、次に示すデータ型ごとに特定のパラメーターの有用な範囲を提供する一般的に
。1。 ワークスペースとデータのロード準備
- SuRVoS Workbench の起動、開いているデータセット ボタンをクリックして、結果のポップアップで分割するデータ ファイルを選択します。データセットの適切な向きを選択します。次に、[ワークスペースと関連ファイルを格納するフォルダーを作成します。新しい分割を開始するとき、このフォルダーが空であることをお勧めします。データが読み込まれた後ワークベンチが左側のプラグイン、左右 2 つのペイン ( 図 1) 間ツールのショートカットのセットで、視覚エフェクト ペインを開きます 。
2。前処理とデータ表現
- ROI の選択] タブで、入力 x、y、z との関心とクリック領域の終了座標を追加します。適切な y と x を選択するには、座標は画像上のポイントにマウスを置きます。視覚エフェクト ペインの上部にスライダーを使用して z 座標を選択します。領域を追加すると、それが右側にボックスをチェックして選択されていることを確認します。選択した領域の下流のすべての計算を行います。一般に、小さいから始まる、利益率 (ROI) パラメーターを最適化し、セグメント化が全域にこれらのパラメーターを再適用の代表的な地域をお勧めします 。
- 機能チャンネルのタブ機能/フィルターを選択し、キューに追加する上部のドロップ ダウン メニューを使用して、(機能チャンネルについての詳細情報の説明を参照)。機能/フィルターを追加し、その名前をクリックして選択した後、機能/フィルターに固有のオプションを変更し、機能/フィルターを実行する入力データセットを選択します。すべてのオプションを選択すると、計算する機能/フィルター名の右側にあるチェック ボックスをクリックします。
- 新しいデータセットのパラメーターを最適化するために
- 複数フィルター/機能を追加し、順序で計算されている、他の後の 1 つの前に、それらのパラメーターを選択します。これを行うには、各新しいフィルター/機能を追加し適切なパラメーターを選択し、実行する各フィルター/機能の左側にあるチェック ボックス、計算機能ボックス、ウィンドウの上部をクリックします。追加情報のディスカッションを参照してください 。
3。適切な超領域を生成する
- スーパー地域] タブの [Supervoxels] セクションで supervoxels が作成するフィルター処理されたデータセットを選択するソース ドロップダウン ・ メニューを使用します。形状、間隔および supervoxels (詳細については更なる議論と 図 2 を参照) の小型化を指定します。最後に、supervoxels を生成する [適用] ボタンをクリックします。オンまたはオフ、視覚エフェクト ペインとその透明性可視化タブとビューアー ウィンドウのショートカットで制御で表示できる、supervoxels を作成します 。
- スーパー地域] タブで、[Megavoxels] セクションは、megavoxels が作成するフィルター処理されたデータセットを選択するのにソースのドロップ ダウン メニューを使用します。次に、ラムダ、numBins、ガンマ megavoxels (さらに詳細説明を参照) のパラメーターを指定します。オンまたはオフ、視覚エフェクト ペインとその透明性可視化タブとビューアー ウィンドウのショートカットで制御で表示できる、megavoxels を作成します 。
4。注釈の概要
- で、注釈タブ レベルの追加ボタンを使用してアノテーション レベルを追加。レベルを追加した後、注釈のラベルを追加するのにレベルのラベルの追加ボタンを使用します。アノテーションの容易さのため追加すると、名前とラベルの色を変更できます 。 次に、注釈を始めるための
- は、ペンのアイコンがツールのショートカット」セクションから選択します。これが選択されている視覚エフェクト ペインの上部にオプションのセットが表示されます。これらのオプションは、ペンの幅と注釈を付けるためのボクセル、supervoxels または megavoxels の使用かどうかを制御します。
- モデルの学習を目的として一般に、アノテーション レベル ドロップダウン ボックスで supervoxels を選択し、大規模なペンの幅に並を使用する必要があります。[注釈] タブでラベル情報の一番右にあるボックスをチェックすることによって注釈を付ける、ラベルを選択します。次に、注釈を単一の supervoxel またはクリックして多くの注釈にドラッグする可視化ウィンドウでをクリックします
。 注: ボクセルと megavoxels アノテーション レベル ドロップ ダウン ボックスで選択して使用できる megavoxels の場合はマウスのシングル クリックで類似したボクセル分割の何千もを有効にできますが、同じ方法で注釈を付けることです 。
- モデルの学習を目的として一般に、アノテーション レベル ドロップダウン ボックスで supervoxels を選択し、大規模なペンの幅に並を使用する必要があります。[注釈] タブでラベル情報の一番右にあるボックスをチェックすることによって注釈を付ける、ラベルを選択します。次に、注釈を単一の supervoxel またはクリックして多くの注釈にドラッグする可視化ウィンドウでをクリックします
5。セグメンテーションを使用してモデルのトレーニングを:microct データセットを示した
。注: 多くのデータセットの最初分割は複数の大きい地域を区別するために。たとえば、細胞質、または外部の氷とサポート構造から細胞から核を分離します。セグメンテーションは、明確な線引きの境界および大きい地域のこのタイプのモデルのトレーニングは、便利です。これを示すためには、x 線位相コントラスト交配型のトモグラフィのデータが使用されます
。- データを読み込み、前処理フィルターと機能のスイートを使用して、適切な supervoxels や megavoxels のガイドとして 表 1 のパラメーターを使用して上記のセクションで説明するように決定します。 図 3 に示すように、データセットのいくつかの大きい区域を注釈セクション 4 で テーブル 1 の手順からのパラメーターを使用し続けること約
。 メモ: データセットは、この時点で完全に分割する必要はありません 。
- モデル トレーニング] タブの [予測レベルを育成マニュアル注釈を含むレベルに設定して記述子のセクションは Supervoxels に地域を設定します。次に、ソースの選択ドロップダウンをクリックし、チェック機能のボックスと選択のフィルター データの領域を区別するために使用される記述子を選択 (表 1 との議論を参照).
- は次に予測ボタンをクリックします。計算が完了したら後、に属している予測は、すべてのアノテーション クラスを示す非標識ボクセルの予測で、視覚エフェクト ペインが更新されます。一般的に、各分類の方法論の既定のパラメーターは、良い出発点を提供、ユーザーする必要があります良いフィットを検索する分類子間で切り替える必要があります。しかし、専門家や経験豊富なユーザーの各分類のオプションあり、変更することができます 。
- トレーニングの方法論の効果を評価する、1 つを選択したら、[絞り込み] セクションで絞り込みドロップダウンをクリックして追加の絞り込みを適用します。At モデル訓練の下部タブで、" 更新注釈 " セクションで、可視化のドロップ ダウン メニューが Predictio に設定されていることを確認ns。もっとまたはより少なく割り当てる信頼スライダーを使用して選択したアノテーションのラベルに unannotated supervoxels の 。
- 信頼の適切なレベルを選択した後は、信頼ツールの下部にラベルの横にある [保存] ボタンを使用して、特定のラベルに予測を保存目視検査に基づきます。変更を表示する視覚エフェクト ペインが更新されます。各ラベルを個別に保存できるし、および x、y、z のボックスに値を入力すると、ラベルごとに [保存] ボタンをクリックすると小さい地域からのラベルを保存ことができます確かに、.
- アドレスのセクション 4 で説明したよう、さらにトレーニング データを提供してマイナーな偽装します。後ラベルに適切な予測を追加すると、モデルの洗練されたトレーニングとはこれ以上ありませんまで精度の高い予測を追加するプロセスを繰り返す supervoxels ラベルが付いていません。あるモデル トレーニング プロセスを実行するたびにより、訓練する supervoxels を割り当てられるために、これは効果的なそれ故にプロセスとなります反復を増やすとより堅牢な 。
6。超領域を用いた領域分割 CryoET データセットを示した
。注: 以来の超領域分割はより小さく、個別にバインドされた区域のために便利、細胞小器官、このデータセット内微小管のセグメンテーションに関するここでの焦点になります。モデルのトレーニングは、迅速に背景氷と炭素から血小板をセグメントに使用されました。これらのパラメーターは、さらには触れませんが、表 1 に示した
。- データを読み込み、前処理フィルターと機能のスイートを使用して、適切な supervoxels および megavoxels のガイドとして 表 1 のパラメーターを使用して上記のセクションで説明するよう決定します 。
- 追加、適切なレベルおよびラベルの [アノテーション] タブで、ラベルを選択し、並を使用して注釈を付ける開始ペン幅は supervoxels を選択します。留意して単一のオブジェクトとしてラベル付けを避けるために互いに近接オブジェクトごとに異なるラベルを選択する必要があります 。 さらに、注釈をクリーンアップするために
- は、形態学的改良法 (膨張、侵食、オープニング、クロージング、塗りつぶし穴) を使用します。これらのオプションは、[注釈] タブの下部に見つけることが。それらを使用するには、ラベルと絞り込みの切り出しを選択します。半径の値を入力し、絞り込みを適用する方法を選択します。[絞り込む] をクリックします 。
7。CryoSXT データセットの分類と分析のデータに基づくオブジェクト固有の特性を示した
注: 一般的に、分割後の次のステップはデータの分析。SuRVoS [ラベル] 分割ツールはオブジェクトの平均強度、分散、ボリューム、位置などのオブジェクトの本質的な特性に基づくルールを使用して分割オブジェクトを分類するためことができます。ラベルの統計情報ツールは、新しいオブジェクト クラスごとにこれらの対策の間の関係を可視化できます。これらは複雑な 3 D データセットの分析のための強力な新しいツールを分割後
。- データを読み込む、前処理フィルターと機能のスイートを使用して、適切な supervoxels や megavoxels とセグメントのガイドとして 表 1 のパラメーターを使用して上記のセクションで説明するよう決定します 。
- 分割、視覚エフェクト ペインの 2 番目のタブをクリックして呼び出されたラベル分割後。これはウィンドウ - ルールの作成ウィンドウの右側にあるに新しい領域を追加します 。
- このエリアの上部には、適切なレベルとラベルを分割するためのラベルを選択します。[データセット クエリを実行し、[ラベル] を選択します。選択したラベル内のオブジェクトのすべて今の枠になりますブルー [ルールの作成] ペインで、視覚エフェクト ペインとオブジェクトの平均強度を示すプロットで別のオブジェクトが表示されるようです。右側の上部にドロップ ダウン ボックスをクリックして、プロットに表示されているメジャーを変更する 。 関連するクラスにオブジェクトを分割するのには
- をクリックして [ルールの作成] ウィンドウの下部に新しいラベルを追加します。この新しいラベルに関連付けられている色の名前とは、前述のように変更できます。
- の追加をクリックして新しいルールとドロップダウンとフリー フォームのエントリ ボックスを使用して、ルールを適用するを定義します。可視化ウィンドウで新しいルールとルールの作成ウィンドウでのプロットの効果を確認する適用をクリックします。1 つのラベルに複数のルールを適用できる、同じデータセット内に複数のラベルを作成できます
。 注: 任意のラベル付けされていないオブジェクトを収集するために新しいラベルを作成してにルールを追加する、代わりに他の選択をクリックします 。
- の追加をクリックして新しいルールとドロップダウンとフリー フォームのエントリ ボックスを使用して、ルールを適用するを定義します。可視化ウィンドウで新しいルールとルールの作成ウィンドウでのプロットの効果を確認する適用をクリックします。1 つのラベルに複数のルールを適用できる、同じデータセット内に複数のラベルを作成できます
- 興味の目的は、新しいラベルに分割されて、新しい、空のレベル、[注釈] タブで作成します。ルール作成」タブでこのレベルを選択し、ラベルの保存] をクリックします。これはこの空のレベルに新しいラベルが保存されます 。
- ラベルの統計情報タブをクリックして、視覚エフェクト ペインの端に。これは、データのオブジェクト クラス間の関係を理解するのには使用することができます新しい視覚エフェクト ペインが開きます。上部で、適切なレベルとラベル、およびクエリするデータセットを選択します。
- は、それらの横にあるボックスをチェックしてのメジャーのいくつか
- を選択します。ラベルをクリックします。これは、各選択したメジャーの一対比較プロットが生成されます。プロットを更新するには、選択または適切な措置の選択を解除し、更新プロットをクリックします 。
8。データと区切りのエクスポート
- 可視化ウィンドウのラベルの統計情報] タブで、それぞれエクスポートの印刷とエクスポート データをクリックして、プロットとの生の測定データをエクスポートします 。
- は、プラグイン ウィンドウで [エクスポート] タブをクリックして画像データと区切りをエクスポートします。最初に、データを保存するフォルダーを選択するをクリックします。次に、出力 (生データ、生コメント、セグメンテーション マスクまたはマスクされたデータ) と (HDF5、MRC、または TIFF) 形式を選択します。最後に、チェック ボックスを使用してエクスポートするアノテーション レベルを選択し、[エクスポート] をクリックします。データを拡大/縮小し、必要に応じて書き出す前に反転できます。ドロップ ダウン メニューを使用して、mask(s) を適用するデータセットを選択ことができますマスクのデータをエクスポートするとき 。
Representative Results
3 のボリューム データを 3 つの異なる技術 (:microct、cryoET、および cryoSXT) から収集した SuRVoS ワークベンチの 3 つの重要な機能を示すため使用された: モデルのトレーニング、超領域分割およびラベルを分割します。データセットは、実験の結果, それぞれの完全処理パラメーターを示します (表 1) の多様なグループを表します。
SuRVoS ワークベンチを使用してモデルのトレーニングを示すためには、境界を定義する領域で比較的高コントラスト データセットが選ばれました。ガリウム aparine、または交配型のフルーツのこのデータセットは、I13 2 ダイヤモンド マンチェスター イメージング ビームライン ダイヤモンド光源、チルトン、オックスフォード、イギリスでの x 線位相コントラスト断層レントゲン写真撮影を使用して収集しました。ゴニオ回転ステージの上にベースに空気でマウントされた新鮮なサンプル、サンプル検出器距離の 30 mm. 露出時間が 0.10 秒約 22 の平均エネルギーを持っているピンクのビーム スペクトル、keV。予測は、0.1 ° のステップ サイズの 180 ° から収集されました。断層の復元は、スモーカーを使用して行われた伝搬に基づく位相差用 Paganin フィルターで30,31画像32アストラ ツールキット33でフィルター処理逆投影術,34します。 このデータは、2 × 2 × 2 SuRVoS ワークベンチに入力する前にファイルのサイズを減らすためにビニングと縮小しました。
まず、入力データ (図 3 a) をフィルター処理され、(データの上限と下限の濃度値を削除) に固定 (図 3 b)。このように、背景と前景をより簡単に区別に作られた、果実の内部構造の質感が強調されました。次に、supervoxels は、フィルター処理されたデータセット (図 3) の上に造られました。Supervoxels の品質を評価するために、データセットの関係の詳細がよく supervoxels (図 3 D) で表されることを確認するデータなしで表示された彼ら。Supervoxels を使用して、次に、手動の注釈は、ボリューム (図 3E、暗い色) の 3 つのスライスをトレーニング データとして提供されました。この学習データ (光の色) 背景 (緑)、フルーツ毛 (赤) (紫)、種子の材料に対応する領域を予測する分類子を訓練するのに十分だったとその周辺の肉 (青)。形態の改良は、元をクリーンアップする充填穴、拡張または縮小として必要な (図 3 f) によって使用されました。適切なパラメーターを決定し、このデータセットをセグメントに費やした合計時間 2 時間であった。
SuRVoS ワークベンチを使用して超領域分割を示すために、騒々しく、複雑なデータセットは15を選ばれました。このデータセットは、ベイラー医科大学、ヒューストン、テキサス州アメリカ合衆国、高分子イメージング センターで cryoET を使用して収集しました。簡単に言えば、血小板がグロー放電時に固定プランジとゴールドの基準治療ホーリーファイバー カーボン TEM グリッド。フルティルト シリーズは、立上がり ° と 2 ° 増分から収集されました。フルティルト シリーズは、IMOD35で加重の逆投影を使用して、再建されました。
SuRVoS (図 4 a) にデータをロードした後の関心の領域を選択、適切なフィルター設定が適用されました。この場合、続いて全変動フィルター クランプ コントラスト、平滑化ガウス フィルターはエッジとデータ (図 4 b) のテクスチャを強調するために使用されました。次に、最小限の supervoxel ベースのユーザー入力をモデルのトレーニングは、背景の氷と炭素から血小板をセグメントに使用されました。その後、megavoxels と supervoxels 半手動分割は、細胞小器官をセグメントに使用されました。最後に、supervoxel ソース パラメーターが弱いノイズ除去フィルターに変更されました、supervoxel 形状がより良い分割 (図 4) の微小管の境界を維持するために小さい (テーブル 1を参照) をつくった。クイック マニュアル注釈が使用された細胞小器官と微小管の両方について関心がある機能を記述する supervoxels を選択するすべての 5-10 のスライス (図 4 & 4E)。適切なパラメーターを決定し、発表した関心領域をセグメントにかかった時間の合計 6 時間であった。
ラベルを分割 SuRVoS ワークベンチを使用して示すために、多くの様々 な細胞小器官を持つデータセットが選ばれました。このデータセットは、ビームライン B24 ダイヤモンド光源、チルトン、オックスフォード、イギリス36の cryoSXT を使用して収集しました。簡潔に、HEK293 細胞は金のファインダーのグリッド上に成長した、適切なサイズの金一方加え、グリッドは思い切って両面を吸い取り、EM を使用して冷凍します。フルティルト シリーズは、立上がり ° 0.5 ° 増分から顕微鏡を収集しました。フルティルト シリーズは、IMOD35で加重の逆投影を使用して、再建されました。
SuRVoS (図 5 a) にデータをロードした後関心領域が選ばれ、全変動の適切なフィルターを用いて細胞小器官 (図 5 b) のボリューム全体の境界を強化します。次に、細胞内小器官は、megavoxels と supervoxels を使用して分割し、穴をふさぐ、閉じる (図 5) のエッジを滑らかにするための拡張と洗練された半 manually でした。適切なパラメーターを決定し、発表した関心領域をセグメント合計時間 4 時間であった。分割が確定され、ラベル分割されたデータセット (図 5) とデータ プロット (図 5 e) の各オブジェクトのさまざまな特性でオブジェクトとして各オルガネラを視覚化する使用。ラベル分割インターフェイスはインタラクティブな可視化とデータ プロットの両方で新しいラベル クラスのそれぞれに関連付けられた色を更新します。これは便利なクラス (図 5 階) にオブジェクトを分割する使用ことができますデータの固有の特性にもとづく諸規則の作成できます。
図 1。SuRVoS ワークベンチの一般的な機能とレイアウト。
GUI インターフェイスは、視覚エフェクト ペインは右側、左側に。これらの 2 つの領域は、ツールとショートカットの列で区切られます。GUI から選択する supervoxel および/または megavoxel パラメーター データをセグメント化、データの事前処理の主な手順をユーザーに配置し、必要なら、区切りをエクスポートする前に、モデルのトレーニングに使用します。3 つのモードで、視覚エフェクト ペインを使用できます: 基本的な可視化と分割データを表示するにはいずれかフィルターを適用し、データをセグメントにラベルを新しいラベル、データに固有の側面に基づいてオブジェクトに分類するスプリッターと最後に計測し、セグメント化されたオブジェクトの特性を可視化する統計情報をラベルします。これらのモードごとに、上にあるドロップ ダウン メニュー左上隅コントロール データが表示し、上部のスライダーを z 軸を制御します。ツールのショートカットは、注釈プロトコルで説明されているように可視化ウィンドウ、および開口部ツール レイヤー、ズーミング、パニング、「ホーム」に戻っての透明度、コントラストを簡単にアクセス制御を提供します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。超領域階層には、画像の領域分割の複雑さが軽減されます。
バークレー セグメンテーションの Dataset (BSDS50037) からイメージだった使用特性と超領域の効果をデモンストレーションします。元のイメージ (左) は、数百 supervoxels (センター) を作成するのと同様、隣接するグループに集まって、ボクセルの数千人で構成されます。Supervoxels は、megavoxels (右) の数十を作成するのと同様、隣接するグループに収集できます。各グループの計算および手動の両方のリソースのため、分割タスクの複雑さが減少します。重要なは、2 D の例を示しますが、しかし、supervoxels と megavoxels の両方が 3 D。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。:Microct モデル トレーニング セグメンテーション戦略を使用して、データセットの処理します。
A.生データの 1 つの 2D スライス。B.は、子実体のさまざまな側面間の境界を強化固定全変動フィルターを raw データに適用します。C.適切な supervoxel パラメーターが選ばれました。D.データの境界が supervoxels 自身にあることを実証する領域 ( Cの赤い枠) が表示されます。E.データセットのさまざまな分野のマニュアル注釈付きボリュームの 3 つのスライスは暗い色 (緑、赤、青、紫) で表示され、予測モデルのトレーニングを実行した後は光と同じ色で表示されます。F.最終的なセグメンテーション モデル トレーニング予測が受け付けられた後と同じ 3 スライス。スケール バーは、1 ミリメートルこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 4。CryoET 超地域セグメンテーション戦略を使用して、データセットの処理します。
A.生データの 1 つの 2D スライス。B.細胞小器官の境界を強調するために適用される層状のフィルター セットと利子 ( Aの赤いボックス) の地域。C.超領域を用いた細胞小器官を注釈の例です。単一細胞小器官は、黒 (左) に表示される手動ユーザー注釈をかぶせた supervoxels とブルー (右) に表示されるそのアノテーションを選択 supervoxels を示しています。D.超領域を使用して微小管を注釈の例です。微小管の 1 つの領域は、黒 (左) と緑 (右) に表示されるそのアノテーションを選択 supervoxels の表示手動ユーザー注釈で示されます。E.血小板の特徴最終的なセグメンテーション モデル訓練 (詳細については表 1 を参照) と様々 な細胞内小器官と微小管の超地域セグメンテーション戦略を使用して分割を使用して背景から分割されます。色は、彼らが分類する前にここに示すように、特定の細胞小器官の種類を示していません。スケール バーで A、B、および E は 1 μ m と C と D が 0.5 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。CryoSXT ラベル分割ツールを使用して、データセットの分析。
A.生データの 1 つの 2D スライス。B.全変動フィルターが細胞小器官を強調するために適用された (A の赤いボックス) 関心領域。C.オーバーレイ supervoxels で最終的なセグメンテーション。+ Fに表示されている規則を使用して分類される細胞内小器官とラベル スプリッターの可視部分。E. F適用表示ルールと各オブジェクト内の平均強度を表示するラベル スプリッターのプロット部分。X 軸に沿った縦の線は単一オブジェクトを表すに割り当てられているクラスに合わせて色分けされました。F.固有プロパティに基づいてさまざまなオブジェクトを分離する分類ルールの例。スケール バーは、1 μ m です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 名前/データセット | ソース | P1 | P2 | P3 | P4 |
| ガウス フィルター | シグマ | ||||
| 範囲/デフォルト | - | [0.5] 10/1 | |||
| (G1) cryoET | 生データ | 1 | |||
| (G2) cryoET | 生データ | 2 | |||
| 全変動 | ラムダ | 間隔 | # Iter | クランプ | |
| 範囲/デフォルト | - | [0.1] 30/10 | [0.1] 10/1 | [50, 500]/100 | - |
| (TV1):microct | 生データ | 10 | 1 | 100 | (1、-) |
| (TV2) cryoET | G1 | 7 | 1 | 200 | - |
| (TV3) cryoET | G2 | 10 | 1 | 100 | - |
| (TV4) cryoSXR | 生データ | 7 | 1 | 100 | - |
| しきい値 | Vmin | Vmax | |||
| 範囲/デフォルト |
表 1。最適化されたパラメーター (:microct、cryoET、および cryoSXT) の 3 つのデータセットの各行を処理するために使用します。>
パラメーターごとに、一般目的の範囲と既定値が与えられます。多くの場合、フィルター処理されたデータは下流の処理のソースとして使用されます。これらの場合、省略形を使用して、新しいソース データセットを示すために。たとえば、G1 (ガウス フィルター cryoET 生データ) は全変動フィルターの中に TV2 を作成する入力として使用されました。情報は、各データセットの処理に使用されたワークベンチの側面にのみ表示されます。たとえば、ここで紹介 cryoSXT データセットの処理中にモデルのトレーニングがされていない、したがってこのないパラメーターが指定します。
Discussion
SuRVoS ワークベンチは、他の分割プログラムと異なり、パラメーターの最適化が実際の分割を開始する前に必要な重要なステップができます。手動または半手動分割プログラムによっては、ユーザーが新しいプロジェクトを開く瞬間にセグメント化を開始します。SuRVoS、大量のボリュームは非常に少ないユーザー入力とセグメント化されの境界は、プログラムで区切られるのでパラメーターを最適化する重要です成功したセグメンテーション。具体的には、機能はチャンネル、超地域建物 2 つの領域が注意を要するです。
チャンネル機能、モデル トレーニング
生データに加えて SuRVoS は、追加のデータセットまたは既存のデータセットから派生したチャネルを作成するユーザーをことができます。これらのチャネルは、計算方法や特徴抽出器の選択を使用して作成できます。データ表現のそれぞれは並行して、利用可能な機能またはフィルター アプリケーションの成果を評価するために個別に表示することができます。これらの特性によりは、彼らを SuRVoS で機能チャンネルと呼びます。SuRVoS 内で提供される多くの機能チャネル オプションがあります。オプション、ここで使用されているパラメーターについては、表 1の一覧と利用可能な機能チャンネルの説明訪問 https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ 2を参照してください。最初、騒々しいデータセットお越しのガウスまたは合計でノイズ除去フィルター バリエーション。お勧めしますさらに機能チャネルと supervoxel/megavoxel の計算はデータ ソースとしてこれらのノイズ除去されたデータセットのいずれかを使用してを実行します。一般的に、denoised 全変動データセットは機能チャネルと supervoxel/megavoxel 計算のソース データとして使用されます。それは最初にデフォルト値で実行、3 D で結果を評価し、最後に、繰り返しデータセットのパラメーターを最適化する勧めします。さらに、チャンネル造り上げることができる「フィルター セット」に特に機能はデータセット、およびこれらの缶の側面を分離し、supervoxels および megavoxels を作成するデータのソースとして使用します。この戦略は高い依存データセットが、有益なことができます。
機能チャネルは、モデルのトレーニングにおける分類子を訓練するソースとしても使用されます。使用する機能チャネル、それはお勧めします学習に注釈の少量を使用する場合をいくつかの堅牢な機能チャンネル (例えば検出、テクスチャと構造、または堅牢な機能カテゴリから) 使用されるを決定する際、分類子。彼らは分類子に様々 な情報を提供する限り、カテゴリのいずれかからの全体的なより多くの特徴チャネルを使用する勧めします大量のトレーニング データを操作する場合 (例えば、ローカルから上記のチャネルの一覧機能を追加機能とガウス機能カテゴリ)。
トレーニングをモデルに 3 つの主要な部分があります: データを説明する入力データ ソースを提供する、分類子を訓練するこれらの入力を使用して、最後に出力予測を精製します。一般に、データのより小さい領域データのより大きい地域は少数のユーザの注釈を必要としながら、正確に分類子を訓練するより多くのユーザーの注釈が必要になります。モデルのトレーニング最初の洗練を選択せず使用できますの最善の予測を見つける。洗練を含めるし、必要に応じて穴やギザギザなど予測と問題を修正するラムダ パラメーターを最適化します。
Supervoxels と megavoxels
Supervoxels は、複数のクラスターと同様ボクセル38,39近隣。Supervoxels は基になる境界に準拠するためには繰り返し変形しデータに重ねて標準 3 D グリッドとして開始し、従ってよりよいデータを表します。Supervoxel の作成と変形 4 つのユーザー入力によって制御されます: データ ソース、付け形状、間隔、および小型化。データ ソースは、supervoxel の作成中に、照会するデータ入力を提供します。フィルター選択されたデータ ソースを含む、任意のソースを使用できます。付け形状パラメーターは、3 D グリッドと結果 supervoxels のおおよその形状を決定します。これらのパラメーターを変更すると、増加したり、変形する前に supervoxels のサイズを小さきます。間隔のパラメーターは、各方向の境界の重要性を定義します。1 つの境界を強調するこれらのパラメーターを変更するまたは (s)、結果として得られる supervoxels 意味と他を犠牲にして 2 つの方向が特定方向にデータの境界をよりに変形します。最後のパラメーターは、コンパクトさは、どのくらいの supervoxels が変形することができますを制御します。低コンパクト数より多くを変形する supervoxels ことができます。これらのパラメーターは、関心のあるデータの境界を表す supervoxels を提供するために最適化する必要があります。注: 現在のところ、supervoxel 形状パラメーターと等しくなければならない 1024 以下一緒に乗算されるとき。
いくつかの方法で supervoxel パラメーターが互いを補うため、「正解」誰を意味パラメーターを決定するとき。たとえば、大規模なスターティング グリッド (例えば付け形状: 10 x 10 x 10) 低コンパクト数 (例: 20) は、小さなスターティング グリッド (例えば付け形状 5 x 5 x 5) と比較して同じような境界遵守と高い supervoxels を与える可能性があります小型数 (例えば50)。多くがある、ので 2 つ目のシナリオより小さい supervoxels 彼ら持っていない境界を表すほど変形します。両方のパラメーターのセットは、データセットの領域分割のために適切かもしれない。
Supervoxel パラメーターを選ぶ際に最大です、supervoxels は、データを表す方法も。図 2 Dのように、それらの下にデータがない、一人での supervoxels の表示は、supervoxel パラメーターを評価するために良い方法です。この方法で表示と、エッジとデータ内で見つかった図形のアウトラインは、supervoxels に表示されますまだする必要があります。
Megavoxels は、複数と同様、隣接 supervoxels38,39のコングロマリットです。彼らは再び 4 つのユーザー入力によって制御される: データ ソース、ラムダ、numbins、およびガンマ。Supervoxels と同様、データ ソースは megavoxel の作成中に、照会するデータ入力を提供します。ラムダと numbins、megavoxels のサイズと境界の付着に影響を与えます。Megavoxels が大きい (高いラムダ、低 numbins) につれ、境界の付着性が低下します。逆は真でも、境界の付着は、増えるより小さい megavoxels (低ラムダ、高 numbins)、しかし megavoxel サイズが減少すると、そう大量のボクセルをすばやくセグメント化の有用性。オプションのガンマ パラメーターは、2 つの supervoxels を一緒にマージのコスト対滑らかさの要因を制御します。ガンマの値が小さいは、少ない megavoxels 全体のコストの 2 つの supervoxels 間の類似性を高めることができます。
Supervoxels と同様、最も大きい考察を選択して、megavoxel パラメーターを最適化するときは、megavoxels がデータを表す方法も。単独で supervoxels の説明どおりの megavoxels を表示するもう一度パラメーターを評価するために使用できます。しかし、megavoxels は一般的に大きくなります、三次元、ので使用するアノテーション ツール tオは、関心領域の境界がタイトなことを確認する 1 つの megavoxels を選択してお勧めします。
注釈戦略
一般的な注釈の 2 つの戦略が記載されている: モデルのトレーニング アプローチは超地域細分化のアプローチは個々 の細胞内小器官などのより小さくより多様な機能を便利に、データセットの大きい地域を分割するのに役立ちます。注釈は、親子関係を使用して特定の領域にそれらを分割し、最初に、大規模な領域に注釈を付けることが可能で、階層形式で編成できます。ラベルの親ラベルは、ラベルの色の選択の右のエリアをクリックして、以前のレベルから適切な親ラベルを選択して割り当てることができます。実際には、ほとんどのデータセットは関心の特定の領域/機能をセグメント化するのにモデル トレーニングと超地域セグメンテーション戦略の両方を使用します。
モデル トレーニング例では、(手動ユーザー supervoxel ベースの注釈の形) で、いくつかのトレーニング入力データの 3 つの均等に間隔をあけられたスライスに使用されていました。この方法で SuRVoS のモデルの訓練の側面は、大幅に交配型子実体で強調されているように地域間の格差などの地域は区別される大規模な使用場合は特に、セグメンテーションが可能な速度を増加させる図 3。
モデル トレーニング、予測を見ることができない場合それが [可視化] タブに移動し、予測層がオンになっていることを確認しなければならないし、透明性の適切な量に設定。また、0 の自信はどのような最も近いものは、に基づいて、ラベルにすべてのラベルのない supervoxel を割り当てます。ラベルの 1 つのカテゴリは任意の比例の一致のみの場合、100 の信頼はラベルを割り当てるだけ。間のすべては、これらの 2 つの両極端のトレードオフです。信頼レベルを選択する際は、予測をラベルに保存する前に誤って予測されたボクセルがないことを目視で確認するためのいくつかのスライスを確認することをお勧めします。
超領域を使用して注釈を付けるための良い戦略拡大ツールを使用してデータのズームでは、一度に 1 つのスライスは、最初「クイック、厄介な」アプローチを使用して (図 4) にいくつか器官に注釈を付けることです。次に、Z のいくつかのスライスの上下に移動し、このプロセスを繰り返します。Supervoxels は三次元なので「汚い」のアプローチの欠点の多くは上記またはスライスの下の注釈で固定されます。この方法でセグメンテーションをスピードアップし、境界は、手動ではなく、supervoxels によって提供されます。
ラベルをクリーンアップするには、標準的なセグメンテーション絞り込みオプションが提供されています。拡張により、指定した半径で成長する選択した分割ラベル、侵食により縮小します。カバーの開閉は、それぞれ最初の侵食と、拡張、または逆のアプリケーションです。穴をふさぐはまさにそれ。これらの操作の順序は問題では。オープニング、その後、拡張がうまく機能し、一般的には、穴をふさぐを実行します。すべてのスライス (」すべてのスライス (2 D)」) 2 D または 3D (「ボリューム全体 (3 D)」) に (「このスライス」)、単一のスライス上それぞれの洗練された方法を適用できます。 されますすべてのスライス (2 D) をお勧めします。
意義と今後の方向性
効率的かつ正確なセグメンテーションは、特に長期的なセッション中にイメージ データのテラバイトのルーチンの自動収集と 3 D データセットの処理で次のボトルネックです。SuRVoS ワークベンチは、マニュアルでのセグメンテーションと比べて 5 倍、セグメンテーションのプロセスを短縮できます。また、境界は、supervoxels で区切られる、ために、結果を元の可変性は改善すべき。将来的には、トレーニング データとして信頼性の高さがボリューム、または別のボリュームもの残りの部分に適用する金利の代表的な 3次元領域の分割を使用する方法を模索してまいります。この事前のユーザー時間と入力セグメントも複雑な生物学的ボリューム、画像処理と領域分割のボトルネックを軽減するために支援する必要量さらに減少するでしょう。これは、順番と可能にするさまざまな状態 (例えば非-病、疾患、治療) の生物学的データの定量的比較堅牢な実験的数値。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があるを宣言します。
Acknowledgments
認め、I13 採択を支援するためルイ王と cryoET データセットを提供するため薬の Baylor の大学から華チウとダイヤモンドの光源からアンドリュー ボディーを感謝したいと思います。本研究の一部は、博士 STU0079 下イマノル Luengo を共同で資金調達のため国立衛生研究所 (NIH) グラント号 (P41GM103832) 我々 はダイヤモンドの光の源を認めるによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| computer | n/a | n/a | Must be running Linux operating system and have an NVidia GPU with at least 4 GB of memory |
References
- DiamondLightSource/SuRVoS: Version 1.0. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/247547 (2017).
- SuRVoS Workbench - Super Region Volume Segmentation. , Available from: https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ (2017).
- Frangakis, A. S., Förster, F. Computational exploration of structural information from cryo-electron tomograms. Curr Opin Struct Biol. 14 (3), 325-331 (2004).
- Lucić, V., Förster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Lučič, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Milani, M., Drobne, D. Focused ion beam manipulation and ultramicroscopy of unprepared cells. Scanning. 28 (3), 148-154 (2006).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), (2004).
- Rigort, A., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 135-144 (2012).
- Förster, F., Han, B. -G., Beck, M. Visual Proteomics. Meth Enzymolb. 483, 215-243 (2010).
- Liu, Y., Sigworth, F. J. Automatic cryo-EM particle selection for membrane proteins in spherical liposomes. J Struct Biol. 185 (3), 295-302 (2014).
- Asano, S., et al. A molecular census of 26S proteasomes in intact neurons. Science. 347 (6220), 439-442 (2015).
- Garduño, E., Wong-Barnum, M., Volkmann, N., Ellisman, M. H. Segmentation of electron tomographic data sets using fuzzy set theory principles. J Struct Biol. 162 (3), 368-379 (2008).
- Sommer, C., Straehle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE Int Symp Biomed Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Darrow, M. C., et al. Structural Mechanisms of Mutant Huntingtin Aggregation Suppression by the Synthetic Chaperonin-like CCT5 Complex Explained by Cryoelectron Tomography. J Biol Chem. 290 (28), 17451-17461 (2015).
- Wang, R., et al. Electron cryotomography reveals ultrastructure alterations in platelets from patients with ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (46), 14266-14271 (2015).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. eLife. 2, (2013).
- Dai, W., et al. Visualizing virus assembly intermediates inside marine cyanobacteria. Nature. 502 (7473), 707-710 (2013).
- Sandberg, K. Methods for Image Segmentation in Cellular Tomography. Methods Cell Biol. 79, 769-798 (2007).
- Volkmann, N. Methods for Segmentation and Interpretation of Electron Tomographic Reconstructions. Methods Enzymol. 483, 31-46 (2010).
- Tsai, W. -T., et al. From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data. J Vis Exp. (90), (2014).
- FEI. Amira & Avizo 3D: Software for Scientific and Industrial Data. , Available from: https://www.fei.com/software/amira-avizo/ (2016).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Nguyen, H., Ji, Q. Shape-driven three-dimensional watersnake segmentation of biological membranes in electron tomography. IEEE trans med imaging. 27 (5), 616-628 (2008).
- Rusu, M., Starosolski, Z., Wahle, M., Rigort, A., Wriggers, W. Automated tracing of filaments in 3D electron tomography reconstructions using Sculptor and Situs. J Struct Biol. 178 (2), 121-128 (2012).
- Moussavi, F., Heitz, G., Amat, F., Comolli, L. R., Koller, D., Horowitz, M. 3D segmentation of cell boundaries from whole cell cryogenic electron tomography volumes. J Struct Biol. 170 (1), 134-145 (2010).
- Hecksel, C. W., et al. Quantifying Variability of Manual Annotation in Cryo-Electron Tomograms. Microsc Mpicroanal. 22 (3), 487-496 (2016).
- Achanta, R., Shaji, A., Smith, K., Lucchi, A., Fua, P., Süsstrunk, S. SLIC superpixels compared to state-of-the-art superpixel methods. IEEE trans pattern anal mach intell. 34 (11), 2274-2282 (2012).
- Luengo, I., Basham, M., French, A. P. Fast global interactive volume segmentation with regional supervoxel descriptors. Proc. SPIE. 9784, (2016).
- Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation Workbench. J Struct Biol. 198 (1), 43-53 (2017).
- Wadeson, N., Basham, M. Savu: A Python-based, MPI Framework for Simultaneous Processing of Multiple, N-dimensional, Large Tomography Datasets. arXiv:1610.08015 [cs]. , Available from: http://arxiv.org/abs/1610.08015 (2016).
- DiamondLightSource/Savu: Version 1.2. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/198726 (2014).
- Paganin, D., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. J Microsc. 206 (Pt 1), 33-40 (2002).
- van Aarle, W., et al. Fast and flexible X-ray tomography using the ASTRA toolbox. Opt Express. 24 (22), 25129-25147 (2016).
- Palenstijn, W. J., Batenburg, K. J., Sijbers, J. Performance improvements for iterative electron tomography reconstruction using graphics processing units (GPUs). J Struct Biol. 176 (2), 250-253 (2011).
- Mastronarde, D. N. Dual-Axis Tomography: An Approach with Alignment Methods That Preserve Resolution. J Struct Biol. 120 (3), 343-352 (1997).
- Duke, E., Dent, K., Razi, M., Collinson, L. M. Biological applications of cryo-soft X-ray tomography. J Microsc. 255 (2), 65-70 (2014).
- Arbeláez, P., Maire, M., Fowlkes, C., Malik, J. Contour detection and hierarchical image segmentation. IEEE trans pattern anal mach intell. 33 (5), 898-916 (2011).
- Luengo, I., Basham, M., French, A. P. Hierarchical Piecewise-Constant Super-regions. arXiv:1605.05937 [cs]. , Available from: http://arxiv.org/abs/1605.05937 (2016).
- Luengo, I., Basham, M., French, A. P. SMURFS: superpixels from multi-scale refinement of super-regions. , Available from: http://www.bmva.org/bmvc/2016/papers/paper004/index.html 1-12 (2016).
