Summary
Segmentering av tredimensionella data från många avbildningstekniker är en stor flaskhals i analys av komplexa biologiska system. Här, vi beskriver användningen av SuRVoS Workbench att halvautomatiskt segmentet volymetriska data vid olika längd-skalor med exempel datauppsättningar från cryo-elektron tomografi, cryo mjuk röntgen datortomografi och fas kontrast röntgen datortomografi tekniker.
Abstract
Segmentering är processen att isolera specifika regioner eller objekt inom en avbildad volym, så att ytterligare studier kan genomföras på dessa områden av intresse. När man överväger analys av komplexa biologiska system, är segmentering av tredimensionella bilddata ett tidskrävande och labor intensiv steg. Med den ökade tillgången på många avbildningsmetoder och automatiserad data insamlingssystem utgör detta en ökad utmaning för moderna experimentella biologen att flytta från data till kunskap. Denna publikation beskriver användningen av SuRVoS Workbench, ett program för att hantera dessa frågor genom att tillhandahålla metoder att halvautomatiskt segmentet komplexa biologiska volymetriska data. Tre datamängder av skilda förstoring och imaging villkoren presenteras här, var och en belyser olika strategier för segmentera med SuRVoS. Fas kontrast röntgen datortomografi (microCT) av fruiting kroppen av en växt som används för att demonstrera segmentering modell utbildning, cryo elektron tomografi (cryoET) av humana trombocyter används för att demonstrera segmentering super - och megavoxels och cryo mjuk Röntgen datortomografi (cryoSXT) av en cellinje används för att visa etiketten dela verktyg. Här presenteras också strategier och parametrar för varje datatyp. Genom att blanda ett urval av halvautomatiska processer i ett enda interaktiva verktyg, ger SuRVoS flera fördelar. Totala minskas tid att segmentera volymetriska data med en faktor fem jämfört manuell segmentering, en stöttepelare i många bild bearbetning områden. Detta är en betydande besparingar när fullständig manuell segmentering kan ta veckor av ansträngning. Dessutom riktar subjektivitet genom användning av beräkningsmässigt identifierade gränser och blixtra komplexa samlingar av föremål av deras beräknade egenskaper snarare än på en fall-till-fall-basis.
Introduction
SuRVoS arbetsbänken är en mjukvara som utformats för att forskarna extrahera vetenskapligt relevant information från volymetriska data från olika prover, oavsett strukturen på intresse, upplösning eller bildframställning modalitet1, 2. Volymetrisk data baserat såsom dessa samlas ofta med hjälp av röntgen eller electron tomografi system, rutinmässigt på stora laboratorier eller centraliserade anläggningar på grund av deras komplexitet. Båda dessa metoder, och andra tekniker, producerar stora, information rika datamängder som bevisar utmanande till segmentet antingen halvautomatiska metoder eller manuellt. Särskilt kräver nära-infödda statligt cryo-orörlig datamängder låg dos imaging villkoren, vilket resulterar i en låg signal-brus-förhållande och dålig kontrast, speciellt i cryo elektron tomografi (cryoET)3,4,5 . Ytterligare en faktor i vissa 3D datamängder är förekomsten av artefakter som infördes genom de utmanande experimentella villkor inblandade, till exempel saknade kil artefakter på grund av datainsamling över en begränsad luta utbud, vilket resulterar i information som saknas och töjning i riktning mot den balk3,4,5. När låg även signal-brus eller saknas kil artefakter är inte problematiska (t.ex. fokuserade ion beam SEM6 eller seriell block ansikte SEM7), komplexiteten och tredimensionella karaktären av provet och den stora mängden data menar analys skulle fortfarande nytta av en automatiserad process för data segmentering.
För närvarande, när man överväger biologiska volymer av celler, finns det många alternativ för att automatiskt eller halvautomatiskt identifierar mycket specifika cellulära funktioner, till exempel aktin, mikrotubuli eller specifikt proteinkomplex, med en mallbaserade sökning kan eller identifiera funktioner i specifika typer av datamängder (t.ex. hög kontrast, målat, harts-embedded prover)8,9,10,11,12. Dock i dessa fall en priori är information eller specifika prov förberedelse protokoll nödvändiga, att begränsa bred tillämpligheten av dessa strategier för segmentering. Det finns också verktyg tillgängliga som utför modell utbildning på att lära sig utseendet på olika strukturer av intresse när det ges användaren ingång13-nivå voxel. På denna nivå kan komplexitet utbildning och testa modeller dock felbenägen och beräkningsmässigt dyra. Med tanke på de utmanande bild-villkor, och bristen på allmänt tillämpliga, semi-automatisk segmentering strategier, är manuell segmentering vanligt, även när du arbetar med komplexa biologiska material14,15, 16 , 17. men det är allmänt accepterat att processen för manuell segmentering inte är bara tidskrävande, men också felbenägna, subjektiva och variabel4,5,18,19 ,20. Vissa segmentering program erbjuder verktyg för att underlätta manuell segmentering processen (dvs interpolation, lasso eller blås verktyg)21,22, men i fall av bullriga datamängder, de är svåra att tillämpa framgångsrikt, och processen även när de används framgångsrikt, och är fortfarande subjektiva och variabel.
Traditionellt, segmenteringar har använts på två olika sätt: kvalitativt eller kvantitativt. Som avbildningstekniker och segmentering strategier förbättras, har det blivit vanligare att använda segmentering som kvantitativa verktyg att besvara biologiska frågor och som en ”marken sanningen” för algoritm utveckling8,12, 15,23,24,25. För att göra detta, krävs detaljerade kontroller och avvägningar att minska variationen och subjektivitet i hela den process26. Dessa försiktighetsåtgärder ytterligare ökar dock tidskrävande beskaffenhet segmentering. På grund av detta är det viktigt att ge en snabbare och mindre rörliga segmenteringen strategi.
SuRVoS arbetsbänken börjar ta itu med dessa frågor genom att förse användaren med ett urval av maskininlärning och bildbehandling verktyg som hjälper användaren i segmentering processen, samtidigt som också vägleder användaren genom steg som krävs. För att uppnå detta genomförs två viktiga innovationer tillsammans i SuRVoS. Först, den använder en super regionen hierarki till grupp liknande, närliggande regioner av data baserat på sina inneboende egenskaper. Var och en av regionerna i hierarkin representerar samma volym med färre element, samtidigt som det ger starka gränsen följsamhet. Således, Super regioner minska komplexitet segmentera en volym med flera tiopotenser ännu fortfarande representerar data utan betydande förlust av information27. Det andra ger SuRVoS en halvautomatisk segmenteringen strategi som använder minimal manuell segmentering ingångar för att träna klassificerare, som används sedan för att segmentera de återstående volym28,29. Denna strategi minskar manuell segmentering, kraftigt minska mängden användartid på segmentera och när du använder super regioner, avlägsnar manuell avgränsning av gränser, potentiellt minska variabilitet och subjektivitet.
En ytterligare viktig funktion i SuRVoS är verktyget etikett Splitter, whereby en användare kan klassificera en serie redan segmenterade objekt baserat på deras inneboende egenskaper. Efter segmentering av olika objekt av intresse, detta verktyg kan användas för att dela upp uppsättningen i underklasser baserat på åtgärder såsom genomsnittliga objekt intensitet, varians, storlek, läge, etc. detta är användbart vid klassificering av stora grupper av objekt med hög komplexitet. Till exempel en grupp av cellulära organeller kan delas in i mitokondrierna, Tom blåsor, lipid droppar, etc.; eller en uppsättning av material inneslutningar kan separeras baserat på storlek eller form. När segmenterade enskilda etiketterna kan uppdelningen i grupper använda valfritt antal klassificerare, minska identifiering bias.
SuRVoS arbetsbänken har framgångsrikt använts för att segmentera data från flera avbildningstekniker. Här, används synchrotron röntgen fas kontrast tomografi (microCT) av fruiting kroppen av en växt som för att demonstrera segmentatipå med modell utbildning, cryo elektron tomografi (cryoET) av humana trombocyter används för att demonstrera segmentering super- och megavoxels och cryo mjuk röntgen datortomografi (cryoSXT) av en cellinje används för att visa etiketten dela verktyg
Protocol
Obs: allmänt användbar spänner av parametrar för varje bearbetningssteg och de specifika parametrarna för varje datatyp som visas här anges i tabell 1.
1. förbereda en arbetsyta och laddar Data
- Starta SuRVoS Workbench, klicka på knappen Öppna dataset, och den resulterande popupen, markera datafilen ska segmenteras. Välj en lämplig riktning på datamängden. Nästa, Välj eller skapa en mapp där de arbetsyta och associerade filer kommer att lagras. Det rekommenderas att mappen är tom när du startar en ny segmentering. När data har lästs in, arbetsbänken öppnas med panelen Plugins till vänster, visualiseringsfönstret till höger och en uppsättning verktyg genvägar mellan de två rutorna ( figur 1).
2. Förbehandling och datarepresentation
- i the Välj ROI på fliken indata z, y och x början och slutet koordinater för regionen av intresse och klicka på Lägg till. För att välja lämpliga y och x muspekaren koordinater över en punkt på bilden. Välj z koordinater med reglaget längst upp för visualiseringsfönstret. När en region har lagts till, kontrollera att den är markerad genom att markera rutan till höger. Alla efterföljande beräkningar kommer att utföras på den valda regionen. I allmänhet börjar med en liten, representativa regionen av intresse (ROI), optimera parametrar och sedan åter tillämpa dessa parametrar till hela området för att segmenteras rekommenderas.
- i fönstret funktionen kanaler på fliken använda droppa-ned menyn överst att välja en funktion/filter och lägga till det i kön (se diskussion för mer information om funktionen kanaler). När en funktion/filter har lagt till och valt genom att klicka på dess namn, ändra alternativ specifika för funktionen/filtret och välja ingående datamängden som ska köra funktionen/filtret. När alla alternativ har valts, klicka på kryssrutan till höger om funktionen/filternamnet att beräkna.
- För att optimera parametrar för en ny datamängd, lägga till flera filter/funktioner och välj parametrarna för dem, innan positionsbestämning i ordning, efter varandra. Att göra detta, Lägg till varje ny filter/funktion och välj parametrar, markera rutan till vänster om varje filter/funktion som ska köras och klicka på beräkna funktioner rutan överst i fönstret. Se diskussion för ytterligare information.
3. Skapa lämpliga Super regioner
- i the Super regioner på fliken i avsnittet Supervoxels Använd källa nedrullningsbara menyn för att välja filtrerade datamängden som supervoxels kommer att skapas. Ange sedan form, avstånd och kompakthet av den supervoxels (se diskussion och figur 2 för ytterligare information). Slutligen, klicka på knappen Verkställ för att generera supervoxels. När du har skapat supervoxels de kan ses i visualiseringsfönstret, aktiverad eller inaktiverad och deras öppenhet kontrollerad visualisering fliken och visningsfönstret genväg.
- i the Super regioner på fliken i avsnittet Megavoxels Använd källa droppa-ned menyn välja filtrerade datamängden som megavoxels kommer att skapas. Nästa, ange lambda, numBins och Gamma parametrarna för den megavoxels (se diskussion för ytterligare detaljer). När du har skapat megavoxels de kan ses i visualiseringsfönstret, aktiverad eller inaktiverad och deras öppenhet kontrollerad visualisering fliken och visningsfönstret genväg.
4. Introduktion till anteckning
- i the anteckningar fliken Använd knappen Lägg till nivå att lägga till en anteckning nivå. När en nivå har lagts till, Använd knappen Lägg till etikett i den nivån att lägga till en etikett för anteckningen. När till namnet och färgen på etiketten kan ändras för att underlätta annotation.
- Därefter för att börja kommentera, Välj ikonen penna från avsnittet verktyg genväg. När detta väljs visas en uppsättning alternativ överst för visualiseringsfönstret. Dessa alternativ styr penna bredd och huruvida voxlar, supervoxels eller megavoxels används för att kommentera.
- i syfte att modell utbildning, allmänt, Välj supervoxels i rutan anteckning nivå droppa-ned och en medelmåttig till stor penna bredd bör användas. Välj etiketten förses genom att markera kryssrutan längst till höger av etikettinformation i fliken anteckningar. Nästa, klicka i rutan visualisering att kommentera en enda supervoxel, eller klicka och dra för att kommentera många.
Obs: Voxlar och megavoxels kan väljas i rutan anteckning nivå droppa-ned och brukade kommentera på samma sätt som när det gäller megavoxels, kan aktivera många tusentals liknande voxlar att segmenteras med ett enda klick på musen.
- i syfte att modell utbildning, allmänt, Välj supervoxels i rutan anteckning nivå droppa-ned och en medelmåttig till stor penna bredd bör användas. Välj etiketten förses genom att markera kryssrutan längst till höger av etikettinformation i fliken anteckningar. Nästa, klicka i rutan visualisering att kommentera en enda supervoxel, eller klicka och dra för att kommentera många.
5. Segmentering använder modell utbildning visade med en microCT datamängd.
Obs: den första segmenteringen för många datamängder är att skilja flera stora regioner från varandra. Exempelvis skiljer kärnan från cytoplasman, eller cellen från externa is och stöd struktur. För denna typ av segmentering, med tydliga avgränsade gränser och stora regioner, är modell utbildning användbart. För att demonstrera detta, röntgen fas kontrast tomografiska data av Goosegrass ska användas.
- Ladda data, förbehandla med hjälp av filter och funktionen suite och fastställa lämpliga supervoxels eller megavoxels som beskrivs i avsnitten ovan med parametrar i tabell 1 som en guide. Fortsätta använda parametrarna från tabell 1 och instruktionerna i avsnitt 4, ungefär kommentera några stora områden av datamängden som visas i figur 3.
Obs: Datamängden behöver inte segmenteras helt på denna punkt.
Ange - i the modell utbildning fliken predict nivån till den nivå som innehåller användarhandbok Träning anteckningarna, och avsnittet Ange i deskriptorn regionen till Supervoxels. Nästa, Välj beskrivare som ska användas för att differentiera regioner av data genom att klicka på rullgardinsmenyn Välj källor och kontrollera rutorna av funktioner och filter av val (se tabell 1 och diskussion).
- Klicka sedan på knappen förutsäga. När beräkningen är klar uppdateras visualiseringsfönstret med förutsägelser för alla de icke-märkt voxlar visar vilket av klasserna annotation de förutspås tillhöra. Generellt standardparametrar för varje klassificerare metod ger en bra utgångspunkt och användaren bara behöva växla mellan klassificerare att hitta en bra passform. Dock för expert eller erfarna användare alternativ för varje klassificerare finns tillgängliga och kan modifieras.
- Efter att bedöma effekten av metoderna som utbildning och att välja en, applicera ytterligare förfining genom att klicka på förfina rullgardinsmenyn i avsnittet förfining. Vid botten av modell utbildning fliken i den " uppdatera anteckningar " avsnitt, se till att visualisering droppa-ned menyn är inställd på Predictions. Använd skjutreglaget förtroende för att tilldela mer eller mindre av de arter utan not supervoxels för den valda anteckning dataetiketterna.
- Efter en lämplig nivå av förtroende har valts utifrån visuell inspektion, Använd knapparna Spara bredvid etiketterna längst ned i verktyget förtroende för att spara förutsägelser till specifika etiketter. Visualiseringsfönstret uppdateras för att visa ändringarna. Varje etikett kan sparas separat, och faktiskt etiketter kan sparas från mindre sub-regioner genom att mata in värden i från och till z, y och x rutor och klicka på knappen Spara för varje etikett.
- Adress mindre mislabeling genom att tillhandahålla ytterligare träningsdata som beskrivs i avsnitt 4. Efter lämplig förutsägelser läggs till etiketter, upprepa processen för modell utbildning med förfining och lägga högt förtroende förutsägelser förrän det finns inget mer omärkt supervoxels. Detta är effektivt eftersom varje gång modellen utbildningsprocessen körs det tilldelas mer supervoxels att träna med, och därmed processen blir mer robust eftersom iterationerna öka.
6. Segmentering Super regioner, visat med en CryoET Dataset.
Obs: eftersom super Region segmentering är användbart för mindre, diskret bundna områden, här kommer att inriktas på segmentering av organeller och mikrotubuli inom denna dataset. Modell utbildning användes att segmentera snabbt antalet trombocyter från bakgrunden is och kol; dessa parametrar diskuteras inte vidare, men presenteras i tabell 1.
- Ladda data, förbehandla med hjälp av filter och funktionen suite och fastställa lämpliga supervoxels eller megavoxels som beskrivs i avsnitten ovan med parametrar i tabell 1 som en guide.
- Lägg till lämpliga nivåer och etiketter till fliken anteckning, Välj en etikett och börja kommentera med hjälp av en medelmåttig penna bredd med supervoxels markerat. Vara uppmärksam på behovet av att välja olika etiketter för objekt i nära närhet till varandra för att undvika att märka dem med ett enda objekt.
- För att städa upp anteckningarna dessutom använda morfologiska förfining metoder (dilatation, erosion, öppning, stängning och fyll hål). Dessa alternativ kan hittas längst ned på fliken anteckningar. Använd dem, välja metoden segmentering etikett och förfining. Ange en radievärde och välja hur du vill tillämpa förfining. Klicka på förfina.
7. Klassificering och analys av Data objekt baserat på inneboende egenskaper, visat med en CryoSXT Dataset
Observera: i allmänhet är nästa steg efter segmentering analys av data. Verktyget etikett splitter i SuRVoS möjliggör klassificering av segmenterade objekt med hjälp av regler baserade på inneboende egenskaper objekt såsom genomsnittliga objekt intensitet, varians, volym eller position. Verktyget etikett statistiken möjliggör visualisering av relationer mellan dessa åtgärder för varje nytt objektklass. Dessa är nya kraftfulla verktyg för analys av komplexa 3D datamängder efter segmentering.
- Ladda data, förbehandla med hjälp av filter och funktionen suite, fastställa lämpliga supervoxels och/eller megavoxels och segment som beskrivs i avsnitten ovan med parametrar i tabell 1 som en guide.
- Efter segmentering, klicka på den andra fliken för visualiseringsfönstret, kallas etikett Splitter. Detta kommer att lägga ett nytt område till höger sida av fönstret - fönstret regel skapandet.
- På toppen av detta område, Välj en lämplig nivå och etiketter för etikett uppdelning. Välj sedan datamängden till fråga och klicka på etiketten. Alla objekt i valda etiketterna kommer nu att beskrivas i blått som separata objekt i rutan visualisering och en tomt som visar genomsnittliga intensiteten av objekten visas i fönstret regel skapande. Ändra den åtgärd som visas i handlingen, klicka på den nedrullningsbara listrutan högst upp på höger sida.
- Att börja dela objekt i relevanta klasser, klicka på Lägg till ny etikett längst ned i fönstret regel skapande. Namnet och färgen förknippas med denna nya etikett kan ändras som tidigare beskrivits.
- Klicka på Lägg till ny regel och använda drop down- och frihandsfigur inmatningsfälten definiera regeln ska tillämpas. Klicka på Verkställ för att se effekterna av den nya regeln i rutan visualisering och tomt i fönstret regel skapande. Flera regler kan tillämpas på en enda etikett och flera etiketter kan skapas inom samma datamängd.
Obs: För att samla alla omärkta objekt, skapa en ny etikett och istället för att lägga till en regel till det, klicka på Välj andra.
- Klicka på Lägg till ny regel och använda drop down- och frihandsfigur inmatningsfälten definiera regeln ska tillämpas. Klicka på Verkställ för att se effekterna av den nya regeln i rutan visualisering och tomt i fönstret regel skapande. Flera regler kan tillämpas på en enda etikett och flera etiketter kan skapas inom samma datamängd.
- När anmärker av intresserar har delats upp i nya etiketter, skapa en ny, tom nivå på fliken anteckningar. Sedan Välj den här nivån i regel skapande fliken och klicka på Spara etiketter. Detta kommer att spara de nya etiketterna till denna tomma nivå.
- På kanten för visualiseringsfönstret, klicka på fliken etikett statistik. Detta kommer att öppna en ny visualiseringsfönstret som kan användas för att börja förstå relationer mellan objektklasser i data. Högst upp, Välj en lämplig nivå och etiketter och datamängden till frågan.
- Välj ett par av åtgärderna av intresse genom att markera rutorna bredvid dem. Klicka på etikett. Detta kommer att producera parvisa jämförelsen tomter för var och en av de valda åtgärderna. För att uppdatera tomterna, markera eller avmarkera lämpliga åtgärder och klicka sedan uppdatera tomt.
8. Exportera Data och segmenteringar
- Exportera tomterna och rå mätdata genom att klicka på Exportera tomt och exportera data, respektive i fliken etikett statistik för visualiseringsfönstret.
- Exportera bilddata och segmenteringar genom att klicka på fliken Export i panelen Plugins. Klicka för att välja en mapp där data ska sparas. Nästa, Välj utdata (rådata, råa anteckningar, segmentering masker eller maskerade Data) och format (HDF5, MRC eller TIFF). Slutligen, Välj den anteckning nivå(er) exporteras med hjälp av kryssrutorna och klicka på Exportera. Data kan skalas och inverterad innan du exporterar vid behov. När du exporterar den maskerade data, datamängden som mask(s) kommer att tillämpas på kan väljas med en droppa-ned menyn.
Representative Results
Tre volym datamängder som samlats in från tre olika tekniker (microCT, cryoET och cryoSXT) användes för att visa tre viktiga funktioner av SuRVoS Workbench: modell utbildning, Super regionen segmentering och etikett uppdelning. Datamängderna representerar en mångskiftande grupp av experimentella resultat, för vilka fullständiga bearbetningsparametrar tillhandahålls (tabell 1).
För att demonstrera modell utbildning använda Workbench för SuRVoS, valdes en relativt hög kontrast datamängd med regionen definiera gränser. Denna datamängd av frukten från Galium aparine, eller goosegrass, samlades in med hjälp av röntgen fas kontrast tomografi på I13-2 Diamond-Manchester Imaging Beamline vid Diamond Light Source, Chilton, Oxfordshire, Storbritannien. Färska provet monterades i luften på en goniometer bas ovanpå rotation scenen, på prov-detektor avstånd på 30 mm. exponering gånger var 0.10 s med rosa beam spektrumet som har en genomsnittlig energi runt 22 keV. Prognoser samlades 180 ° med en stegstorlek på 0,1 °. Tomografiska rekonstruktioner utfördes med Savu30,31 med Paganin filter för förökning-baserade faskontrast bilder32 följt av filtrerade tillbaka projektion återuppbyggnad i de ASTRA toolkit33 , 34. denna data var sedan nedskurna med 2 x 2 x 2 binning för att minska filstorleken innan att mata in SuRVoS arbetsbänken.
Först, indata (figur 3A) var filtreras och spänns (ta bort övre och lägre intensitetsvärden i data) (figur 3B). På detta sätt bakgrunden och förgrunden gjordes mer lätt urskiljbara och strukturen på den interna strukturen av frukten accentueras. Nästa, supervoxels byggdes ovanpå de filtrerade datamängden (figur 3 c). För att bedöma kvaliteten på supervoxels, visades de utan data att kontrollera att relevanta Detaljer för datamängden var väl representerade av supervoxels (figur 3D). Nästa, manuell kommentarer med supervoxels tillhandahölls som träningsdata på tre skivor av volymen (figur 3E, mörka färger). Detta träningsdata var tillräcklig för att träna klassificeraren att förutsäga (ljusa färger) arealerna för bakgrund (grön), frukt borst (röd), utsäde material (lila), och omgivande köttet (blå). Morfologiska förfiningar användes att städa upp segmenteringar av fyllning hål, växer eller krymper som behövs (figur 3F). Den totala tiden som spenderas för att avgöra lämpliga parametrar och segmentera här datamängden var 2 h.
För att demonstrera Super regionen segmentering SuRVoS Workbench, valdes en högljudd och komplexa datamängd15. Den här datamängden samlades med cryoET vid National Center för makromolekylära Imaging vid Baylor College of Medicine, Houston, TX USA. Kort, trombocyter var steget fryst på glow urladdat och guld relaterat-behandlade holey kol TEM rutnät. Tilt-serien samlades in från ±65 ° med en 2° increment. Tilt serien rekonstruerades sedan använder vägda tillbaka projektion i IMOD35.
Efter in data i SuRVoS (figur 4A), en region av intresse valdes och ett lämpligt filter set tillämpades. I det här fallet användes ett utslätande Gaussisk filter följt av en total variation filter med kontrasten fastklämd att accentuera kanterna och texturer av data (figur 4B). Nästa, modell utbildning med minimal supervoxel-baserade användarindata användes att segmentera antalet trombocyter från bakgrunden is och kol. Sedan, delvis manuell segmentering med megavoxels och supervoxels användes för att segmentera organeller. Slutligen, parametern supervoxel källa har ändrats till en svagare denoising filter och supervoxel form gjordes mindre (se tabell 1) för att bättre bevara mikrotubuli gränserna för segmentering (figur 4 c). För både organeller och mikrotubuli, snabb manuell anteckningar användes varje 5-10 skivor att välja den supervoxels som beskriver funktionen av intresse (figur 4 d & 4E). Den totala tiden som spenderas för att avgöra lämpliga parametrar och segmentera regionen sevärdheter presenterade var 6 h.
För att Visa etikett dela använda Workbench för SuRVoS, valdes en datamängd med många, varierade organeller. Den här datamängden samlades in med hjälp av cryoSXT på beamline B24 på Diamond Light Source, Chilton, Oxfordshire, Storbritannien36. Kort, HEK293 celler odlades på guld finder rutnät, lämplig storlek guld fiducials tillkom och rutnätet var steget fryst med en EM med back-sidig blotting. Tilt-serien samlades sedan på Mikroskop från ±65 ° med en 0,5 ° increment. Tilt serien rekonstruerades sedan använder vägda tillbaka projektion i IMOD35.
Efter in data i SuRVoS (figur 5A), en region av intresse valdes och ett lämpligt totala variationen filter användes för att förstärka gränserna för organeller i hela volymen (figur 5B). Nästa, organeller var semi manually segmenterad med hjälp av megavoxels och supervoxels, och sedan raffinerad med fyllning hål, stängning och dilatation att jämna kanter (bild 5 c). Den totala tiden att bestämma lämpliga parametrar och segmentera regionen sevärdheter presenterade var 4 h. När segmentering slutfördes användes etikett Splitter för att visualisera varje organell som objekt i datamängden (figur 5 d) och olika egenskaper om varje objekt på data tomt (figur 5E). Etiketten Splitter gränssnittet är interaktiva, uppdatera färgen förknippas med varje ny etikett klass i både visualisering och data tomt. Detta möjliggör skapandet av olika regler baserat på egenskaperna som är inneboende i de data som kan användas för att separera objekt i användbar klasser (figur 5F).
Figur 1. Layout och allmänna kännetecken för SuRVoS Workbench.
Det grafiska användargränssnittet är till vänster, medan visualiseringsfönstret är till höger. Dessa två områden skiljs åt av en kolonn av verktyg och genvägar. GUI är ordnad gå användaren genom de viktigaste stegen i förbehandling data, välja supervoxel och/eller megavoxel parametrar, segmentera data, och om det behövs använder modell utbildning, innan du exporterar segmenteringar. Visualiseringsfönstret kan användas i tre lägen: grundläggande visualisering och segmentering att visa dataoch någon har använt filter och att segmentera data, etikett splitter för att kategorisera objekt till nya etiketter utifrån aspekter inneboende till data, och slutligen etikett statistik för att mäta och visualisera egenskaper segmenterade objekt. Den nedrullningsbara menyn i övre vänster hörn kontroller som data visas för vart och ett av dessa lägen, och skjutreglaget överst styr z-axeln. Verktyg genvägar ger enkel tillgång kontroll över kontrast, insyn i lager, zoomning, panorering och återvänder till ”hem” i visualiseringsfönstret och öppning verktyg för annotering som beskrivs i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Super regionen hierarki minskar komplexiteten av bild segmentering.
En bild från Berkeley segmentering datamängden (BSDS50037) användes för att visa vilka egenskaper och effekter av Super regioner. Den ursprungliga bilden (vänster) består av tusentals voxlar, som samlas sedan i intilliggande, liknande grupperingar att skapa några hundra supervoxels (center). Supervoxels kan också samlas i intilliggande, liknande grupperingar att skapa några tiotals megavoxels (höger). Med varje gruppering, är komplexiteten i uppgiften segmentering minskade, både computational och manuell resurser. Ännu viktigare, ett 2D exempel visas här, men både supervoxels och megavoxels är 3D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Behandling av en microCT datamängd som använder en modell utbildningsstrategi för segmentering.
A. en 2D cirkelsektor av rådata. B. använda ett spänns totala variationen filter till rådata enhanced gränserna mellan de olika aspekterna av den fruiting kroppen. C. valdes lämpliga supervoxel parametrar. D. visas en region av intresse (röd ruta i C) att demonstrera att gränserna för uppgifterna som finns i supervoxels själva. E. tre skivor av volymen med manuell anteckningar av olika områden av datamängden visas i mörka färger (grön, röd, blå och lila) och förutsägelser efter kör modell utbildning visas i samma ljusa färger. F. de samma tre skivorna med den slutliga segmenteringen efter modell utbildning förutsägelser har godtagits. Skala barer är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. Behandling av en cryoET Dataset med en super region segmenteringen strategi.
A. en 2D cirkelsektor av rådata. B. en region av intresse (röd ruta i A) med en skiktad filter tillämpas för att accentuera gränserna för organeller. C. exempel på kommentera en organell som använder super regioner. En enda organell visas med supervoxels överdrog med användarverifiering anteckningen visas i svart (vänster) och den supervoxels som valt med denna anteckning visas i blått (höger). D. exempel på kommentera en mikrotubulära som använder super regioner. En enda region av mikrotubuli visas med användarverifiering anteckningen visas i svart (vänster) och den supervoxels som valt med denna anteckning visas i grönt (höger). E. den slutliga segmentering med antalet trombocyter segmenterad från bakgrunden med modell utbildning (se tabell 1 för detaljer), och olika organeller och mikrotubuli segmenterad med en super regionen segmenteringen strategi. Färgerna anger inte specifika organell typer som de visas här innan klassificering. Skala barer i A, B och E är 1 μm och i C och D är 0,5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Analys av en cryoSXT Dataset med verktyget etikett Splitter.
A. en 2D cirkelsektor av rådata. B. en region av intresse (röd ruta i A) med en total variation filter används för att framhäva organeller. C. den slutliga segmenteringen med supervoxels överdras. D. Visualisering portion av etikett splitter med de organeller som klassificeras med hjälp av regler som visas i F. E. den tomt del av etiketten splitter visar den genomsnittliga intensiteten inuti varje objekt, med de regler som visas i F tillämpas. Varje vertikal linje längs x-axeln representerar ett enskilt objekt och är färgkodade för att matcha den klass som det har tilldelats. F. exempel klassificeringsregler att separera olika objekt baserat på deras inneboende egenskaper. Skala barer är 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn / datamängd | Källa | P1 | P2 | P3 | P4 |
| Gaussiska filtret | Sigma | ||||
| Range / standard | - | [0,5, 10] / 1 | |||
| (G1) cryoET | RAW-data | 1 | |||
| (G2) cryoET | RAW-data | 2 | |||
| Totala variationen | Lambda | Avstånd | # Iter | Klämma | |
| Range / standard | - | [0,1, 30] / 10 | [0,1, 10] / 1 | [50, 500] / 100 | - |
| (TV1) microCT | RAW-data | 10 | 1 | 100 | (1,-) |
| (TV2) cryoET | G1 | 7 | 1 | 200 | - |
| (TV3) cryoET | G2 | 10 | 1 | 100 | - |
| (TV4) cryoSXR | RAW-data | 7 | 1 | 100 | - |
| Tröskelvärde | Vmin | Vmax | |||
| Range / standard |
Tabell 1. Optimerade parametrar används för att behandla var och en av de tre datamängder (microCT, cryoET och cryoSXT).>
För varje parameter ges en generell räckvidd och standard. I många fall används filtrerade data som en källa för nedströms behandling. I dessa fall används en förkortning för att beteckna den nya datamängden till källa. Till exempel G1 (Gaussisk filtrerade cryoET rådata) användes som underlag under en total variation filter för att skapa TV2. Information presenteras endast för aspekter av arbetsbänken som användes för att bearbeta varje datamängd. Till exempel modell utbildning användes inte under bearbetning av cryoSXT datamängden presenteras här, därför inga parametrar ges för detta.
Discussion
SuRVoS Workbench som skiljer från andra segmentering program optimering av parametrar är ett nödvändigt och viktigt steg innan du påbörjar den riktiga segmenteringen. I en del manuell eller semi manuell segmentering program börjar användaren segmentera inom stunder av att öppna ett nytt projekt. Med SuRVoS, eftersom stora mängder volymen kommer att vara segmenterade med mycket lite användarindata och gränser är avgränsad av programmet, är optimera parametrarna avgörande för en framgångsrik segmentering. Specifikt är funktionen kanaler och Super regionen byggnad två områden där uppmärksamhet bör ägnas.
Funktionen kanaler och modell utbildning
Förutom raw-data tillåter SuRVoS användaren att skapa ytterligare datamängder eller kanaler som härrör från en befintlig datamängd. Dessa kanaler kan skapas med ett urval av beräkningsvetenskapliga metoder eller funktionen utsug. Alla data representationer finns parallellt, och kan visas individuellt för att bedöma resultaten av funktionen eller filter ansökan. På grund av dessa egenskaper kallas de till funktionen kanaler i SuRVoS. I området i närheten finns det många Kanalalternativ inom SuRVoS. För information om alternativ och parametrar som används här, se tabell 1, för en fullständig lista och beskrivning av tillgänglig funktion kanaler besök https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ 2. Första, bullriga datamängder kommer att gynnas av denoising med Gaussisk eller totalt variation filter. Det rekommenderas att ytterligare funktionen kanal och supervoxel/megavoxel beräkningar utföras med en av dessa denoised datamängder som datakälla. Generellt, den totala variation denoised datamängden används som källdata för funktionen kanal och supervoxel/megavoxel beräkningar. Det föreslås att först köra med standardvärden, bedöma resultatet i 3D och slutligen iterativt optimera parametrarna för datamängden. Dessutom funktionen kanaler kan byggas upp i ”filteruppsättningar” to specifikt isolera aspekter av datamängden, och dessa kan sedan användas som datakällor för att skapa supervoxels och megavoxels. Denna strategi är mycket datamängd beroende, kan det vara fördelaktigt.
Funktionen kanaler används också som källor till tåg klassificeraren i modell utbildning. När du bestämmer på vilka funktionen kanaler att använda, det rekommenderas att några robusta funktionen kanaler (t.ex., från blob upptäckt, textur och struktur eller robusta funktioner kategorier) används när du arbetar med en liten mängd anteckningar för att träna den klassificerare. När du arbetar med en stor mängd utbildning data, det rekommenderas att använda mer funktionen kanaler totalt, från någon av kategorierna så länge de ger varierad information till klassificeraren (t.ex.lägga till ovanstående lista funktionen kanaler från lokala funktioner och Gaussisk funktioner kategorier).
Det finns tre delar till modell utbildning: tillhandahåller indata källor som beskriver data, använder dessa ingångar för att utbilda en klassificerare och slutligen raffinering utdata förutsägelser. I allmänhet kommer att mindre regioner av data kräva mer användaranteckningar korrekt utbilda klassificeraren, medan större regioner av data kräver färre användaranteckningar. Modell utbildning kan först utan att välja en förfining användas för att hitta bästa förutsägelser. Då inkluderar förfining och optimera parametern lambda som behövs för att åtgärda problem med förutsägelser såsom hål eller ojämna kanter.
Supervoxels och megavoxels
Supervoxels är kluster av flera i närheten av liknande voxlar38,39. Supervoxels börjar som ett standard 3D rutnät överlagrade på data som sedan iterativt deformeras för att hålla sig till de underliggande gränserna, och därmed bättre representera data. Supervoxel skapande och deformation styrs av fyra användare ingångar: datakälla, superpixel form, avstånd och kompakthet. Datakällan innehåller de indata som efterfrågas under supervoxel skapande. Någon källa kan användas inklusive filtrerade datakällor. Superpixel form parametrarna avgör 3D startfältet och ungefärliga önskad form av den resulterande supervoxels. Ändra dessa parametrar kan öka eller minska storleken på supervoxels innan deformation. Avstånd parametrar definiera betydelsen av gränser i vardera riktningen. Ändra dessa parametrar kan framhäva gränser i en eller två riktningar på bekostnad av den andra (s), vilket innebär att den resulterande supervoxels kommer att deformeras för att bättre följa data gränser i en viss riktning (s). Den sista parametern, kompakthet, styr hur mycket supervoxels kan deformeras. En låg kompakthet nummer tillåter supervoxels deformeras mer. Dessa parametrar bör optimeras för att ge supervoxels som representerar gränserna för data av intresse. Obs: För närvarande supervoxel form parametrar måste vara lika med 1024 eller mindre när den multiplicerats ihop.
På vissa sätt, supervoxel parametrar kan kompensera för varandra, vilket betyder att det ingen finns ”rätt svar” när beslut fattas om parametrar. Exempelvis en stora startfältet (t.ex. superpixel form: 10 x 10 x 10) och en låg kompakthet nummer (ex. 20) kan ge supervoxels med liknande gräns vidhäftning jämfört med en liten startfältet (t.ex. superpixel form 5 x 5 x 5) och en högre kompakthet nummer (t.ex. 50). Eftersom det finns fler, mindre supervoxels i det andra scenariot, som de inte har att deformera så mycket att representera gränser. Båda uppsättningar av parametrar kan vara lämpliga för segmentering av datamängden.
Det största övervägandet när man väljer supervoxel parametrar är hur väl supervoxels representera data. Visar supervoxels ensam, utan data under dem, som i figur 2D, är ett bra sätt att bedöma supervoxel parametrar. När visas detta sätt, bör kanterna och konturerna av former som finns i data fortfarande vara synlig i supervoxels.
Megavoxels är konglomerat av flera närliggande, liknande supervoxels38,39. De kontrolleras igen av fyra användare ingångar: datakälla, lambda, numbins och gamma. Som med supervoxels, tillhandahåller datakällan de indata som efterfrågas under megavoxel skapande. Både lambda och numbins inverkan på megavoxels storlek och gränsen anslutning. Som megavoxels växa större (högt lambda, låga numbins), minskar deras gräns följsamhet. Motsatsen är också sant, gränsen följsamhet kommer att öka med mindre megavoxels (lågt lambda, hög numbins), men när megavoxel storlek minskar, så ökar deras användbarhet i segmentera stora mängder voxlar snabbt. Parametern valfria gamma styr den jämnhet faktorn kontra kostnaden för sammanslagningen av två supervoxels. Låga värden av gamma kan förbättra likheten mellan två supervoxels, på bekostnad av att ha färre megavoxels övergripande.
Som med supervoxels, är det största övervägandet när du väljer och optimera megavoxel parametrar hur väl megavoxels representera data. Visar megavoxels ensam som beskrivs för supervoxels kan igen användas för att bedöma parametrar. Men eftersom megavoxels kommer generellt att vara mycket större och är tredimensionell, med hjälp av annotation verktyg to Välj enda megavoxels att se till att gränsen mellan regioner av intresse är tight rekommenderas också.
Annotation strategi
Två allmänna annotation strategier har beskrivits: en modell utbildning tillvägagångssätt är användbart för att separera stora regioner av en datamängd, medan en super regionen segmentering metod är användbar för mindre, mer varierande funktioner såsom enskilda organeller. Anteckningar kan organiseras på ett hierarkiskt sätt så att det går att kommentera stora regioner först och sedan dela upp dem i mer specifika regioner med en överordnad-underordnad relation. Överordnade etiketten för en etikett kan tilldelas genom att klicka på området till höger om etiketten färgvalet och välja en lämplig förälder etikett från en tidigare nivå. I praktiken använder de flesta datamängder både modell utbildning och Super regionen segmentering strategier för att segmentera specifika regioner/funktioner av intresse.
I modellen utbildning exempel här användes några utbildning ingångar (i form av manuell supervoxel-baserade användaranteckningar) på tre jämnt fördelade skivor data. På detta sätt ökar den modell utbildning aspekten av SuRVoS kraftigt hastigheten med vilken segmentering är möjligt särskilt när du arbetar med stora, differentierade regioner såsom klyftan mellan regionerna i goosegrass fruiting kroppen som framhålls i Figur 3.
När modellera kan utbildning, om förutsägelser inte kan ses, det vara nödvändigt att gå till fliken visualisering och kontrollera att lagrets förutsägelser är påslagen och inställd på en lämplig mängd öppenhet. Också, ett förtroende för 0 tilldelar varje omärkt supervoxel till en etikett, baserat på vad den närmaste matchningen är. Förtroende av 100 kommer bara tilldela en etikett om endast en kategori av etikett har någon proportionell match. Allt däremellan är en avvägning av dessa två ytterligheter. När du väljer en konfidensnivå föreslås det för att kontrollera några skivor att visuellt inspektera att det finns ingen felaktigt förutspådde voxlar före Spara prognos till en etikett.
En bra strategi för att kommentera med Super regioner är att använda verktyget förstoring att zooma in på data, kommentera några organeller samtidigt på en cirkelsektor, först med en ”snabb, stökigt” metod (figur 4 c). Nästa, flytta upp eller ner några skivor i Z och upprepa proceduren. Eftersom supervoxels är tredimensionell, korrigeras många av fel på metoden ”rörigt” av anteckningar som görs ovan eller nedanför skivor. På detta sätt segmentering är påskyndas och gränserna tillhandahålls av supervoxels i stället för manuellt.
För att rengöra en etikett, har standard segmentering förfining alternativ tillhandahållits. Dilatation orsakar valda segmentering etiketten växa med given radie, erosion orsakar det att krympa. Öppning och stängning är tillämpningen av första erosion och dilatation, eller vice versa, respektive. Och fyll hålen gör exakt. Av dessa operationer har betydelse. I allmänhet utför fyllning hål, sedan öppningen, sedan dilatation fungerar väl. Varje förfining metod kan tillämpas på en cirkelsektor (”detta” slice ”), på alla skivor i 2D (” alla skivor (2D) ”) eller i 3D (” hela volym (3D) ”). Alla skivor (2D) rekommenderas.
Betydelse och framtida inriktningar
Effektiv och korrekt segmentering är nästa flaskhalsen i bearbetning av 3D datamängder, särskilt med den rutinmässiga automatiserad insamlingen av terabyte image data under lång sikt sessioner. SuRVoS Workbench kan snabba segmentering processen genom en faktor 5 jämfört med manuell segmentering. Också, eftersom gränserna är avgränsad av supervoxels, variationer i de resulterande segmenteringar bör förbättra. I framtiden hoppas vi att utforska sätt att använda segmentering av en representativ 3D region av intresse som träningsdata för att gälla resten av volymen, eller ens en separat volym, med högt förtroende. Detta förskott skulle ytterligare minska mängden av användartid och input nödvändigt att segmentet även komplexa biologiska volymer, bidrar till att lindra bild bearbetning och segmentering flaskhalsen. Detta, i sin tur gör en kvantitativ jämförelse av biologiska data i olika stater (t.ex. icke-sjukdom, sjukdom, behandlas) med robust experimentella nummer.
Disclosures
Författarna förklarar de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi skulle vilja erkänna och tacka Rui Wang och Wah Chiu från Baylor College of Medicine för att tillhandahålla cryoET datamängden och Andrew Bodey från Diamond Light Source för att bistå med den I13 beamtime. Delar av forskningen stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidraget nr (P41GM103832) Vi bekräftar Diamond Light Source för att gemensamt finansiera Imanol Luengo under PhD STU0079.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| computer | n/a | n/a | Must be running Linux operating system and have an NVidia GPU with at least 4 GB of memory |
References
- DiamondLightSource/SuRVoS: Version 1.0. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/247547 (2017).
- SuRVoS Workbench - Super Region Volume Segmentation. , Available from: https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ (2017).
- Frangakis, A. S., Förster, F. Computational exploration of structural information from cryo-electron tomograms. Curr Opin Struct Biol. 14 (3), 325-331 (2004).
- Lucić, V., Förster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Lučič, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Milani, M., Drobne, D. Focused ion beam manipulation and ultramicroscopy of unprepared cells. Scanning. 28 (3), 148-154 (2006).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), (2004).
- Rigort, A., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 135-144 (2012).
- Förster, F., Han, B. -G., Beck, M. Visual Proteomics. Meth Enzymolb. 483, 215-243 (2010).
- Liu, Y., Sigworth, F. J. Automatic cryo-EM particle selection for membrane proteins in spherical liposomes. J Struct Biol. 185 (3), 295-302 (2014).
- Asano, S., et al. A molecular census of 26S proteasomes in intact neurons. Science. 347 (6220), 439-442 (2015).
- Garduño, E., Wong-Barnum, M., Volkmann, N., Ellisman, M. H. Segmentation of electron tomographic data sets using fuzzy set theory principles. J Struct Biol. 162 (3), 368-379 (2008).
- Sommer, C., Straehle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE Int Symp Biomed Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Darrow, M. C., et al. Structural Mechanisms of Mutant Huntingtin Aggregation Suppression by the Synthetic Chaperonin-like CCT5 Complex Explained by Cryoelectron Tomography. J Biol Chem. 290 (28), 17451-17461 (2015).
- Wang, R., et al. Electron cryotomography reveals ultrastructure alterations in platelets from patients with ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (46), 14266-14271 (2015).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. eLife. 2, (2013).
- Dai, W., et al. Visualizing virus assembly intermediates inside marine cyanobacteria. Nature. 502 (7473), 707-710 (2013).
- Sandberg, K. Methods for Image Segmentation in Cellular Tomography. Methods Cell Biol. 79, 769-798 (2007).
- Volkmann, N. Methods for Segmentation and Interpretation of Electron Tomographic Reconstructions. Methods Enzymol. 483, 31-46 (2010).
- Tsai, W. -T., et al. From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data. J Vis Exp. (90), (2014).
- FEI. Amira & Avizo 3D: Software for Scientific and Industrial Data. , Available from: https://www.fei.com/software/amira-avizo/ (2016).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Nguyen, H., Ji, Q. Shape-driven three-dimensional watersnake segmentation of biological membranes in electron tomography. IEEE trans med imaging. 27 (5), 616-628 (2008).
- Rusu, M., Starosolski, Z., Wahle, M., Rigort, A., Wriggers, W. Automated tracing of filaments in 3D electron tomography reconstructions using Sculptor and Situs. J Struct Biol. 178 (2), 121-128 (2012).
- Moussavi, F., Heitz, G., Amat, F., Comolli, L. R., Koller, D., Horowitz, M. 3D segmentation of cell boundaries from whole cell cryogenic electron tomography volumes. J Struct Biol. 170 (1), 134-145 (2010).
- Hecksel, C. W., et al. Quantifying Variability of Manual Annotation in Cryo-Electron Tomograms. Microsc Mpicroanal. 22 (3), 487-496 (2016).
- Achanta, R., Shaji, A., Smith, K., Lucchi, A., Fua, P., Süsstrunk, S. SLIC superpixels compared to state-of-the-art superpixel methods. IEEE trans pattern anal mach intell. 34 (11), 2274-2282 (2012).
- Luengo, I., Basham, M., French, A. P. Fast global interactive volume segmentation with regional supervoxel descriptors. Proc. SPIE. 9784, (2016).
- Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation Workbench. J Struct Biol. 198 (1), 43-53 (2017).
- Wadeson, N., Basham, M. Savu: A Python-based, MPI Framework for Simultaneous Processing of Multiple, N-dimensional, Large Tomography Datasets. arXiv:1610.08015 [cs]. , Available from: http://arxiv.org/abs/1610.08015 (2016).
- DiamondLightSource/Savu: Version 1.2. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/198726 (2014).
- Paganin, D., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. J Microsc. 206 (Pt 1), 33-40 (2002).
- van Aarle, W., et al. Fast and flexible X-ray tomography using the ASTRA toolbox. Opt Express. 24 (22), 25129-25147 (2016).
- Palenstijn, W. J., Batenburg, K. J., Sijbers, J. Performance improvements for iterative electron tomography reconstruction using graphics processing units (GPUs). J Struct Biol. 176 (2), 250-253 (2011).
- Mastronarde, D. N. Dual-Axis Tomography: An Approach with Alignment Methods That Preserve Resolution. J Struct Biol. 120 (3), 343-352 (1997).
- Duke, E., Dent, K., Razi, M., Collinson, L. M. Biological applications of cryo-soft X-ray tomography. J Microsc. 255 (2), 65-70 (2014).
- Arbeláez, P., Maire, M., Fowlkes, C., Malik, J. Contour detection and hierarchical image segmentation. IEEE trans pattern anal mach intell. 33 (5), 898-916 (2011).
- Luengo, I., Basham, M., French, A. P. Hierarchical Piecewise-Constant Super-regions. arXiv:1605.05937 [cs]. , Available from: http://arxiv.org/abs/1605.05937 (2016).
- Luengo, I., Basham, M., French, A. P. SMURFS: superpixels from multi-scale refinement of super-regions. , Available from: http://www.bmva.org/bmvc/2016/papers/paper004/index.html 1-12 (2016).
