Summary
Här presenterar vi nyttan av längsgående i vivo imaging i uppföljningen av morfologiska förändringar av laserinducerad koroidal kärlnybildning hos möss.
Abstract
Laserinducerad koroidal kärlnybildning (CNV) är en väletablerad modell att efterlikna den våta formen av åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). I detta protokoll mål vårt är att vägleda läsaren inte bara genom de tekniska övervägandena generera laserinducerad lesioner för att utlösa neovaskulär processer, utan snarare fokusera på den kraftfulla information som kan erhållas från multimodala längsgående invivo imaging under hela uppföljningsperioden.
Laserinducerad musen CNV modell genererades av en diod laser administration. Multimodala i vivo avbildningstekniker användes för att övervaka CNV induktion, progression och regression. Första, spektrala domänen optisk koherenstomografi (SD-OCT) utfördes omedelbart efter den lasering för att verifiera ett avbrott av Bruchs membran. Efterföljande i vivo imaging använder fluoresceinangiografi (FA) bekräftade framgångsrika skada av Bruchs membran från seriell bilder förvärvade på koroidal nivå. Longitudinell uppföljning av CNV spridning och regression på dagar 5, 10 och 14 efter det lasering utfördes med hjälp av både SD-okt och FA. Enkel och pålitlig sortering av läckande CNV leasions från FA bilder presenteras. Automatiserad segmentering för mätning av totala retinal tjocklek, kombinerat med manuell kaliber program för mätning av retinal tjocklek på CNV platser, tillåta förutsättningslös utvärdering av förekomsten av ödem. Slutligen, histologisk verifiering av CNV utförs med isolectin GS-IB4 färgning på koroidal flatmounts. Färgningen är thresholded, och isolectin-positiv området beräknas med ImageJ.
Protokollet är särskilt användbart i therapeutics studier som kräver hög-genomströmning-liknande screening av CNV patologi eftersom det tillåter snabb, multimodala och pålitlig klassificering av CNV patologi och retinala ödem. Dessutom möjliggör hög upplösning SD-okt inspelning av andra patologiska kännetecken, såsom ansamling av subretinal eller intraretinala vätska. Denna metod ger dock inte en möjlighet att automatisera CNV volym analys från SD-okt bilder, som måste utföras manuellt.
Introduction
Det första lyckade försöket att härma mänskliga CNV hos gnagare patologi påvisades nästan tre decennier sedan med krypton laser i lång-Evans råttor1. Därefter användes en krypton laser att bryta Bruchs membran i den mest populära mus stammen, C57BL/6J2,3,4. Andelen framgångsrika CNV induktion verifierades med FA och histologiska fläckar. En snabb utveckling av icke-invasiv avbildningsmetoder, såsom okt, främjas tillväxten av fältet för gnagare prekliniska modeller. Möjlighet att övervaka morfologiska förändringar i näthinnan vid flera tidpunkter i samma öga avsevärt bidrar till minskning av användning av djur, och ökar effektiviteten i experimentella studier. Histologisk undersökning av CNV lesioner är ganska enkel och kräver märkning av onormal vaskulär tillväxt runt platsen av laser administration, bild förvärv och area/volym uppskattning med hjälp av ett bildbehandlingsprogram för analys. Däremot införa i vivo avbildningsmetoder mer komplexa analyser av CNV patologi och dess tolkning.
Här presenterar vi en enkel och relativt snabb metod att grade induktion, progression och regression av CNV med FA, SD-okt, och metoden automatisk segmentering i musen laserinducerad CNV modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur behandlades i enlighet med programsatsen ARVO för användning av djur i oftalmologiska och Vision forskning och de EG-direktiv 86/609/EEG för djurförsök, med protokoll godkänts och övervakas av djur Experiment styrelsen Finland.
1. laserinducerad mus CNV modell 5
- Inspektera ögonen på djuret makroskopiskt för eventuella avvikelser.
- Väga musen.
- Beräkna och förbereda en lämplig mängd bedövningsmedel att använda, baserat på vikten av djur, t.ex. en blandning av Medetomidin (1 mg/kg), ketamin (75 mg/kg) och destillerat vatten (0,9% NaCl-lösning) i ett förhållande av 1:1.5:2.5 eller ketamin (40-75 mg/kg), xylazin (5 mg/kg) och destillerat vatten (0,9% NaCl-lösning) i förhållandet 1: 2 5:1; för en 20 g mus, injicera 0,1 mL av blandningen.
- Injicera bedövningsmedel intraperitonealt.
- Placera musen tillbaka i buren och vänta tills djuret är sövd. Bekräfta att musen är ordentligt bedövas av brist på en pedal reflex.
- Se till att användningen av laser säkerhet personlig skyddsutrustning.
- Aktivera en spaltlampa och en 532 nm diode laser.
- Ta bort musen från buren och plats på en värmedyna.
- Applicera en droppe av Tropikamid för pupilldeformitet dilatation. Vänta 3-5 min för full (3 mm) pupilldeformitet dilatation.
- Placera musen på scenen av spaltlampan.
- Placera en droppe av oftalmologiska flytande gel på ett täckglas till applanate hornhinnan.
- Orient mus ögat med synnervspapillen i mitten.
- Ange laser makt till 100 mW, varaktighet till 100 ms, och spotstorlek 50 µm.
- Fokusera laserstrålen på det retinala pigmentepitelet (RPE).
- Göra tre laser skott i ena ögat genom att undvika retinala blodkärl helst vid 4, 8 och klockan 12 positioner runt synnerven, respektive. Inspektera fundus i ögat efter alla laser skott för avsaknad av retinal blödning. Det kontralaterala ögat fungerar som en icke-lasered kontroll.
- Kassera täckglas och Placera musen tillbaka på en värmedyna.
- Applicera en droppe av PEG gel droppar på båda ögonen.
2. SD-okt 6,7
- Placera musen i gnagare justering scenen och immobilisera huvudet.
- Justera linsen av SD-okt systemet (t.ex., Bioptigen/Leica Envisu R2200) att möta ögat för i vivo imaging använder X - och Y-stegs styrenheter.
- Utföra SD-okt genomsökningar för att verifiera raster av Bruchs membran: när SD-ULT File hela ögat, manuellt flytta referenslinjen på lasered webbplatser. Avbrott av Bruchs membran ska synas tydligt i lasered områden (se figur 1).
3. fluorescein angiografi 7,8,9
- Ta bort musen med innehavaren och placera den i FA-systemet (t.ex., Heidelberg Spectralis HRA2).
- Fokus på laser bränna områden av fundus av ögat använder infraröd reflektans läge med huvudet av synnerven mitt i visningsfönstret.
- Injicera 0,1 mL 5% fluorescein natrium salt för en 20 g mus subkutant eller intraperitonealt.
- Fokusera på koroidal nivån.
- Ta en bild från koroidal fokus nivå.
- Nytt fokus på retinal nivå och ta en bild.
- Vänta 30 s och upprepa steg 3,4-3,6.
- Ta bort musen från hållaren och placera den på en värmedyna.
- Omvänd anestesi av α2-antagonist för Medetomidin, atipamezol (0,5 mg/kg, i.p.), eller vänta för djur återhämtning från anestesi.
- Upprepa i vivo SD-okt och FA imaging i sövda djur på uppföljande dagar 5, 10 och 14.
4. CNV gradering
- Grade skadan av Bruchs membran från OCT bilder och koroidal FA bilder tagna direkt efter den lasering dag 0 enligt följande:
0 - Bruchs membran var inte skadad
1 - framgångsrika skada av Bruchs membran - Grade förekomst av CNV från lasered ställen som hade läckage som observerats genom att jämföra dynamiken i fluorescein signal i en serie av retinal FA bilder enligt följande:
0 - normalt utseende av näthinnan
0,5 - svag färgning av läckage
1,0 - läckande CNV områden
Obs: Använd av OCT imaging för ytterligare bekräftelse av CNV eller i tvivelaktiga FA där förekomsten av intraretinala vätska i OCT bilder skulle föreslå CNV gradering.
5. retinal tjocklek mätningar
- Använda en automatiserad segmentering programvara för retinal tjocklek mätningar. Se till att den totala retinal tjockleken betraktas, som tjockleken på alla lager från nerv fiberskiktet till RPE (friska mätpunkter) eller till en tänkt linje ansluter RPE runt platsen för skador (lasered webbplatser) (se även figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En bubbla eller subretinal blödning omedelbart efter lasering är inte alltid synlig. SD-okt är därför särskilt viktigt att kontrollera skada av Bruchs membran. Figur 1 visar ett exempel på OCT imaging vid olika tidpunkter efter laser administrering.
Figur 1 : OCT sv ansikte ögat fundus (VIP bild) visar tre lasered områden beskrivs i vita, gröna och röda cirklar. OCT B-scan bilder togs tidigare den lasering (baslinje), omedelbart efter det lasering för att verifiera ett avbrott av Bruchs membran (0 dagar, pilarna pekar på platsen för skadan), och 5, 10 och 14 dagar efter laser administration. Som kan ses från området beskrivs i vitt (första raden av bilder), CNV utvecklades inte vid senare tidpunkter. Området beskrivs i grönt och rött utvecklats CNV, som upptäcktes på uppföljande dag 5. Dock regredierat de 10 och 14 dagen tidpunkter, dessa CNV lesioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figurerna 2 och 3 visar seriell bildåtergivning med FA, som bekräftade framgångsrika skada av Bruchs membran i alla tre ställen på dag 0 i en manlig 10-vecka-gammal C57BL/6jRj mus.
Figur 2 : Serial FA imaging tagit varje 20 s (bilder 1 till 18) på nivån koroidal omedelbart efter laser administrering. Vita pilar i bild 1 punkt till lasered webbplatser som visar fluorescein läckage vid senare tidpunkter (vita pilar i bild 18). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Serial FA imaging tagit varje 20 s (bilder 1 till 18) på retinal nivå omedelbart efter laser administrering. CNV område som har fluorescein läckage och en gradering av 1 (läckande CNV) påpekas av den vita pilen i bild 18. Observera en ökande intensitet, samt fluorescein positiva område, under timecourse FA imaging (vit pil i bilderna 8 och 11). Två områden beskrivs i vitt i bilden 18 var klassificerade som att ha en svag FA signal (gradering 0,5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Utöver graderingen av CNV patologi, är SD-okt också användbart att avslöja ytterligare information i lesionen webbplatsen, t.ex., förekomsten av subretinal vätska, ödem och CNV regression. Figur 4 visar viktiga patologiska kännetecken för laserinducerad CNV hos möss.
Figur 4 : Spektrala domänen optisk koherens tomografi Imaging av CNV patologi. SD-okt ger en detaljerad CNV patologi inom näthinnans vävnad, som kan ses från dessa representativa bilder på ärrbildning vävnad, CNV bildandet och flytande ackumulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Makulaödem är en av de viktigaste patologiska kännetecknen för våta formen AMD hos människor. I laserinducerad CNV modellen, kan retinal tjocklek utvärderas med hjälp av automatiserad segmentering. Manuell mätning av valda lasered platser krävs att mäta retinal tjocklek på platsen för CNV. Figur 5 visar ett exempel på en rapport som genereras efter automatiserad segmentering.
Figur 5 : Kvantifiering av retinal tjocklek. Retinal tjocklek mätt med automatiserad segmentering vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Användning av automatiserad segmentering är ett snabbt sätt att ge en översikt av retinal tjocklek (tabell 1). Siffror 6A och 6B visar representativa exempel på automatiserad segmentering från en frisk retinala område och retinal området med CNV patologi, respektive. Trots smärre felaktigheter i särskilja enskilda retinal lager, övergripande, erkänner programvaran tillförlitligt totala retinal tjocklek hos pigmenterade möss.
Figur 6 : Automatiserad segmentering av näthinnans skikt. Automatiserad segmentering av friska retinal (A) och retinal område innehållande CNV (asterisk i bild B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att utvärdera retinal tjocklek på lasered områden, varje lasered område mättes manuellt enligt följande: den totala retinal tjockleken ansågs som tjockleken på alla lager från nervfiber skikt till den imaginära linje som förbinder RPE runt platsen för skador (figur 7 och tabell 1).
| Område | Dag 5 | Dag 10 | Dag 14 |
| Total retinal tjocklek, μm | 218±7.8 | 220±7.2 | 221±9.8 |
| Lasered område 1 | 200 | 204 | 214 |
| Lasered område 2 | 226 | 217 | 220 |
| Lasered område 3 | 222 | 223 | 227 |
| Data presenteras som mean±SD | |||
Tabell 1. Total retinal tjocklek och retinal tjocklek på CNV platser under en 14-dagars uppföljning som bestäms av automatiserad segmentering använder inVivoDiver programvara (v. 3.0.8).
Figur 7 : Manuell mätning av retinal tjocklek på lasered området med CNV patologi. Gula linjen visar den totala retinal tjockleken från nerv fiberskiktet ett imaginärt RPE lager (svart linje) på laser administreringsstället. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Histologiskt, bekräftades CNV lesioner med hjälp av isolectin GS-IB4 märkning (figur 8A). Bild analys programvara bild J användes för att beräkna området av CNV lesion (figur 8B).
Figur 8 : Histologisk analys. Histologiska fläcken av CNV lesion från koroidal flatmount (i grönt, A) kan kvantifieras med tröskelvärde i bild J (B). Skalstapeln för A är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multimodal avbildning erbjuder värdefulla verktyg för CNV patologi utvärdering. Här presenterade vi ett protokoll för avbildning som består av FA, SD-okt och automatisk segmentering för snabb, reproducerbar och tillförlitlig utvärdering av CNV patologi. Ett avbrott av Bruchs membran efter laser administration bekräftades. Dessutom, användning av SD-okt i detta skede också tillåtet omedelbara visualisering av möjliga intraretinala och subretinal blödningar, som kan blanda ihop tolkning av resultat. Retinal läckor var graderade baserat på fluorescein signalen från FA bilder. Användning av SD-okt gett en mer detaljerad beskrivning av CNV patologi. Dessutom betonade längsgående SD-okt analys vid olika tidpunkter under hela uppföljningsperioden tidsmässiga skillnader i patologi som skulle förbli svårfångade om att förlita sig på FA ensam.
Total retinal tjocklek mättes med automatiserad segmentering. Retinal tjocklek på platser CNV förmåddes mättes manuellt. Histologisk utvärdering av koroidal flatmount är verifierade och området av kärlnybildning mäts med bild analys programvara bild J.
Ordentlig insyn i den visuella axeln är avgörande för framgångsrika resultat av protokollet presenteras. Torrhet i hornhinnan och bildandet av grå starr är de huvudsakliga faktorerna som är inblandade i Felsökning. Därför, när musen blir sövda, ögonen ska vara ständigt hydrerade med konstgjorda tårar eller gel att bibehålla lämplig hydrering av hornhinnan. Föreslagna protokollet bör utföras företrädesvis inom 10 min från induktion av anestesi. Utökade anestesi tid kan orsaka bildandet av grå starr och förhindra in-vivo imaging.
Protokollet beskrivs begränsas till observationella gradering av CNV progression baserat på vaskulär läckage på nivån av näthinnan. Kvantitativ bedömning av retinal läcka kan läggas med Heidelberg Spectralis programvara, vilket gör att avgränsningen av området av läckan, och innehåller kvantitativa uppgifter om regionen av intresse. Dessutom föreslog Sulaiman och kollegor (2015) nyligen en beräkning av CNV volym från i vivo förvärvade OCT bilder med ellipsoid metod10. Ellipsoid modellen införs sannolikt bias mot överskattning av volym av lesioner som CNV i de flesta fall har en oregelbunden form. Men ger hög korrelation mellan volym mätningar från confocal analys av histologiska prover och föreslagna ellipsoid kvantifiering från OCT bilder bevis för att metoden är ett värdefullt verktyg för den kvantitativa utvärderingen av CNV volym10 .
Avslutningsvis, vi tror att kombinationen presenteras på olika i vivo imaging modaliteter, tillsammans med automatisk segmentering och histologisk analys, ger reproducerbara och tillförlitlig utvärdering av CNV patologi i prekliniska studier. Metoden skulle vara särskilt användbar för bevis av begreppet terapeutisk interventionsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren Symantas Ragauskas, Ph.D. är anställd (forskare) och aktieägare i Experimentica Ltd. erbjuder kontrakt forskningstjänster sysselsätter den prekliniska CNV-modell som används i denna artikel.
Författaren Eva Kielczewski är anställd (forskningsingenjör applikationer, OCT) av Leica Microsystems som producerar SD-okt-system som används i denna artikel.
Författaren Joseph Vance är anställd (NA OCT Sales Director) av Leica Microsystems som producerar SD-okt-system som används i denna artikel. Joseph Vance är också ordförande och VD för perspektiv, LLC.
Författaren Simon Kaja, Ph.D. är konsult forskningschef och aktieägare i Experimentica Ltd., en preklinisk contract research organisation som erbjuder kontrakt forskningstjänster, inkl den prekliniska CNV-modellen används i denna artikel. Simon Kaja, Ph.D. är även CEO av K & P Scientific, LLC, ett biovetenskap som konsultföretag, och fungerar som Dr John P. och Therese E. Mulcahy begåvad Professor i oftalmologi vid Loyola University Chicago Stritch School of Medicine. Villkoren i detta avtal har granskats och godkänts av Loyola University Chicago i enlighet med dess intressekonflikt policy.
Författaren Anita Kalesnykas, Ph.D. är anställd (VD) och aktieägare i Experimentica Ltd. erbjuder kontrakt forskningstjänster sysselsätter den prekliniska CNV-modell som används i denna artikel.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Yuliya Naumchuk (Loyola University Chicago) och Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) för utmärkta tekniska och Videografiska stöd. Dr. Kajas forskningsprogrammet stöds av Dr. John P. och Therese E. Mulcahy begåvad professor i oftalmologi vid Loyola University Chicago.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidine (commercial name Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Anesthesia |
| Ketamine | Intervet | Vnr 51 14 85 | Anesthesia |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Anesthesia |
| Xylazine (commercial name Rompun vet) | Bayer | vnr 14 89 99 | Anesthesia |
| Tropicamide | Santen | Vnr 04 12 36 | Mydriatic agent |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Lubricant |
| Systane | Alcon | - | Lubricant |
| 5% Fluorescein sodium salt | Sigma Aldrich | F6377-100G | Fluoresent agent |
| Atipamezole (commercial name Antisedan) | Orion | Vnr 47 19 53 | Anesthesia |
References
- Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
- Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
- Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502 (2015).
- Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643 (2015).
- Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
- Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).
