Summary
マウスのレーザー誘発脈絡膜新生血管の形態学的変化のフォロー アップの縦生体内イメージングの有用性を紹介します。
Abstract
レーザー誘発脈絡膜新生血管 (CNV) は、加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) のウェット フォームを模倣する確立されたモデルです。このプロトコルでは血管新生のプロセス、マルチ モーダル縦から得ることができる強力な情報焦点を当てるをトリガーするレーザー誘起病変を生成の技術的な考察を通して単に読者を目指します生体内のフォロー アップ期間中イメージングします。
レーザー マウス CNV モデルは、ダイオード レーザーの管理によって生成されました。体内のマルチ モーダル イメージング技術は、CNV 誘導、進行と回帰を監視する使用されました。最初、ブルッフ膜の中断を確認するレーザー加工直後後スペクトル領域光干渉断層法 (SD 10 月) を行った。血管造影 (FA) を使用してその後体内イメージング脈絡膜レベルでシリアル画像からブルッフ膜の正常な損傷を確認しました。SD 10 月と FA の両方を使用して CNV の増殖と、レーザー加工後 5、10、および 14 日回帰の縦方向のフォロー アップを行った。シンプルで信頼性の高い FA 画像から漏れの CNV leasions の等級が表示されます。CNV のサイトで網膜の厚さの測定のための手動口径アプリケーションと組み合わせて、合計の網膜厚測定のための自動セグメンテーションは、浮腫の存在の公平な評価を許可します。最後に、脈絡膜の flatmounts に isolectin GS IB4 染色を使って CNV の組織学的検証を行います。どちらられる、染色は、ImageJ で isolectin 正面積が計算されます。
このプロトコルは、CNV の病理学のような高スループット スクリーニングを必要とすることができます高速、マルチ モーダル、治療研究と CNV 病理学および網膜浮腫の信頼性の高い分類に便利です。さらに、高解像度 SD OCT は網膜や網膜の流体の蓄積など、他の病理学的特徴の記録をできます。ただし、このメソッドは SD OCT 画像から手動で行う必要のあるボリュームの CNV 解析を自動化する可能性を行いません。
Introduction
齧歯動物で人間の CNV の病理学を模倣する最初の成功した試みはロング ・ ラット1クリプトン レーザーでほぼ三十年前を示した。その後、クリプトン レーザーは、最も人気のあるマウス緊張、c57bl/6 j2,3,4でブルッフ膜を破るに使用されました。FA と組織学的汚れ CNV 誘導の成功率を検証しました。OCT などの非侵襲的画像診断装置の急速な発展は、齧歯動物の前臨床モデルのフィールドの成長を促しています。大幅目と同じで複数の時点で網膜の形態変化を監視する機能は動物の使用の削減に寄与する、実験的研究の効率が向上します。CNV 病変の組織学的評価ではなく簡単で、レーザー管理、画像取得と画像解析ソフトを用いた面積/体積推定のサイトの周りの異常血管の増殖のラベリングを必要とします。対照的に、生体内のイメージ投射様相は、CNV の病理とその解釈のより複雑な分析をご紹介します。
ここで提示グレード誘導、進行、CNV の回帰してシンプルで比較的高速なメソッド FA、SD、OCT を使用して、マウスの自動抽出法レーザー誘起 CNV モデル。
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Protocol
すべての動物は、動物のための使用の眼科とビジョンの研究や、EC 指令 86/609/EEC 動物実験で承認され、フィンランドの動物実験委員会によって監視されているプロトコルを使用して ARVO 声明に従って扱われました。
1. レーザー マウス CNV モデル5
- 肉眼的に異常動物の目を検査します。
- マウスの重量を量る。
- 計算し、動物、例えばメデトミジン (1 mg/kg), ケタミン (75 mg/kg)、および 1:1.5:2.5、またはケタミン (40-75 mg/kg) の割合で蒸留水 (0.9 %nacl 溶液) の混合物の重量に基づいて、使用する麻酔薬の適切な量を準備します。キシラジン (5 mg/kg)、および 1:2.; 5:1 の割合で蒸留水 (0.9 %nacl 水溶液)20 g のマウスのための混合物の 0.1 mL を注入します。
- 腹腔内麻酔薬を注入します。
- 動物に麻酔がかかるまでは、ケージと待機にマウスを置きます。マウスは正しくペダル反射の欠如によって麻酔を確認します。
- レーザー安全保護具の使用を確認します。
- スリッ トランプと 532 nm ダイオード レーザーを入れます。
- ケージや加熱パッド上の場所から、マウスを削除します。
- 瞳孔の拡張のトロピカミドの一滴を適用します。フル (3 mm) 瞳孔の拡張のための 3-5 分を待ちます。
- スリッ トランプのステージ上にマウスを置きます。
- Applanate 角膜に coverslip の眼科液体ゲルの一滴を配置します。
- 中心部で視神経乳頭とマウスの目を向けます。
- レーザー パワーを 100 にセット mW、100 ms に期間および 50 μ m スポット サイズ。
- レーザー光線を網膜色素上皮 (RPE) に焦点します。
- 1 つ目にそれぞれ理想的で、4、8、および 12 ポジション、視神経乳頭周囲の網膜の血管を避けることによって 3 つのレーザー ショットを確認します。すべてレーザー網膜出血の不在のためのショット後の眼底を検査します。反対側の眼は非レーザ書込みコントロールとして機能します。
- 加熱パッド背面 coverslip と場所のマウスを破棄します。
- 両方の目に釘ゲルの滴の一滴を適用します。
2. SD 10 月6,7
- 齧歯動物のアライメント ステージにマウスを置き、頭を固定します。
- X ・ Y ステージ コント ローラーを用いた生体内イメージングの目に直面する (例えばBioptigen/ライカ Envisu R2200) SD 10 月システムのレンズを合わせます。
- SD 10 月ブルッフ膜の中断を確認するスキャンを実行: 書込みサイトで基準線を手動で移動 SD-10 月は、全体の目をスキャンしたら。ブルッフ膜の区切りは、書込み領域 (図 1参照) で明確に見えるはずです。
3. フルオレセイン造影7,8,9
- ホルダー、マウスを取り外して、FA システム (例えば、ハイデルベルク Spectralis HRA2) の上に置きます。
- レーザーで焦点は、表示ウィンドウの中央に視神経の頭部と赤外モードを使用しての眼底部を燃やします。
- 皮下や腹腔内 5% フルオレセイン ナトリウム塩 20 g のマウスのための 0.1 mL を注入します。
- 脈絡膜レベルに焦点を当てます。
- 脈絡膜のフォーカス レベルからイメージを取る。
- 網膜のレベルを合わせるし、イメージを取る。
- 30 s と繰り返し手順 3.4 3.6 を待ちます。
- マウスをホルダーから外し、加熱パッドの上に置きます。
- メデトミジン、アチパメゾール (0.5 mg/kg, i. p.)、または麻酔から動物の回復を待つのため α 2 拮抗薬による麻酔を逆にします。
- SD-10 月と FA イメージング麻酔下の動物 5、10、および 14 フォロー アップ日を繰り返します。
4. CNV のグレーディング
- グレード 10 月画像、次として 0 日目にレーザー加工後すぐに撮影した脈絡膜の FA 画像からブルッフ膜の損傷:
0 - ブルッフ膜が破損していません。
1 にブルッフ膜の成功した被害 - 等級一連の次のように網膜の FA イメージの蛍光信号のダイナミクスを比較することによって観測された漏れがあった書込みのスポットから CNV の存在:
0 - 網膜の正常な外観
漏れの 0.5 - かすかな染
1.0 - 漏れの CNV 領域
注: は、OCT 画像における網膜流体の存在が CNV グレーディングお勧めしたい疑問 FA、CNV の確認を OCT イメージングを使用します。
5. 網膜厚測定
- 網膜の厚さ測定の自動領域分割ソフトウェアを使用します。その合計の網膜厚は RPE (健康測定サイト)、または損傷 (書込みサイト) のサイトの周り RPE を結ぶ架空の線神経線維層からのすべての層の厚さとして考慮されることを確認 (図 7を参照)。
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Representative Results
バブルやレーザー加工後すぐに出血は常に表示されません。したがって、SD 10 月は特にブルッフ膜の損傷を確認することが重要です。図 1は、異なる時点でレーザー投与後 OCT イメージングの例を示します。
図 1: 10 月アン顔ビュー眼底画像 (VIP 画像) の白、緑、赤の円に記載されている 3 つの書込みエリアを表示します。10 月 B スキャン画像が撮影された前 (ベースライン) のレーザー加工、ブルッフ膜の中断を確認するレーザー加工直後後 (0 日で矢印をポイント ダメージのサイト)、レーザー投与後 5、10、14 日。白で囲まれた領域から見ることができる (画像の最初の行)、CNV が後で縦長に開発しなかった。緑と赤で囲まれた領域は、CNV は、5 日目フォロー アップが検出されましたを開発しました。ただし、10 と 14 日縦長で CNV 病変は後退しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2 および 3は、FA は、男性 10 週齢 C57BL/6jRj マウスの 0 日目にすべての 3 つのスポットでブルッフ膜の正常な損傷を確認を使用してシリアルのイメージングを表示します。
図 2: シリアル FA 画像撮影すべて 20 レーザー投与後すぐに脈絡膜レベルで s (画像 18 まで 1).画像後で縦長 (画像 18 で白い矢印) でフルオレセイン漏れを表わす書込みサイトに 1 ポイントで白い矢印は。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: シリアル FA 画像撮影すべての 20 s (画像 18 まで 1) レーザー投与後すぐに網膜レベル。フルオレセイン漏れ・ 1 (漏れ CNV) の粒度は、CNV 領域は 18 の画像の白色の矢印によって指摘されています。FA (8 と 11 の画像の白い矢印) をイメージングの経時的に強度増加とフルオレセイン肯定的な地域を注意してください。イメージ 18 に白で縁取られた 2 つの領域は、FA の微弱な信号 (0.5 等級) とそれぞれ評価されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
CNV の病理学のグレーディング、に加えて SD 10 月も、病変のサイト、例えば、CNV 回帰、浮腫、網膜下液の存在の詳細を明らかにするため便利です。図 4は、マウスにおけるレーザー誘起 CNV の主な病理組織学的特徴を示します。
図 4: スペクトル ドメイン光コヒーレンス断層イメージングの CNV 病理学。SD-10 月は、瘢痕組織、CNV 形成と液体の蓄積にこれらの代表的なイメージから見ることができる網膜組織内で詳細な CNV 病理を提供します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
黄斑浮腫は、人間のウェット フォーム AMD の主な病理組織学的特徴のひとつです。レーザー誘起 CNV モデルの自動領域分割を用いた網膜の厚さを評価できます。選択した書込みサイトの手動測定は、CNV のサイトで網膜の厚さを測定する必要があります。図 5は、自動分割後に生成されるレポートの例を示しています。
図 5: 網膜厚の定量化します。自動抽出法によって測定された網膜厚この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
自動抽出法の使用は、網膜厚 (表 1) の概要を提供する高速な方法です。図 6Aおよび6Bそれぞれ健康な網膜領域からは CNV 病理と網膜の領域自動抽出法の代表的な例を示しています。全体的に個々 の網膜層を区別することは、多少の誤差にもかかわらずソフトウェアは確実に有色マウスの網膜厚を認識します。
図 6: 網膜の層の切り出しを自動化します。健康な網膜領域 (A) と CNV (画像Bのアスタリスク) を含む網膜領域の自動抽出法。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
書込みエリアに網膜の厚さを評価するために各書込み領域を手動で次のように測定した: 網膜厚のサイト周り RPE を結ぶ架空の線に神経線維層のすべてのレイヤーの厚さとして考えられていた損傷 (図 7および表 1)。
| エリア | 日 5 | 日 10 | 日 14 |
| トータル網膜膜厚 μ m | 218±7.8 | 220±7.2 | 221±9.8 |
| 書込みエリア 1 | 200 | 204 | 214 |
| 書込みエリア 2 | 226 | 217 | 220 |
| 書込みエリア 3 | 222 | 223 | 227 |
| データを提示する mean±SD として | |||
表 1。合計網膜厚と CNV 地点 (v. 3.0.8) inVivoDiver ソフトウェアを使用して自動セグメンテーションによって決定される 14 日間のフォロー アップ中に網膜厚。
図 7: CNV 病理学と書込み領域で網膜の厚さのマニュアル測定。黄色の線は、レーザー管理のサイトで架空の網膜色素上皮層 (黒線) に神経線維層から総網膜の厚さを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
組織学的, CNV 病変は isolectin GS IB4 ラベル (図 8 a) を使用して確認されました。画像解析ソフトウェア イメージ J は、CNV 病変 (図 8 b) の面積を計算に使用されました。
図 8: 組織学的解析.画像 J (B) のしきい値を使用して (の緑、 A) 脈絡膜 flatmount から CNV 病変の組織学的染色を定量化することができます。Aスケール バーは、50 μ m です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
マルチ モーダル イメージングでは、CNV の病理学的評価のための貴重なツールを提供しています。FA から成るイメージング プロトコルの紹介、SD OCT と CNV 病理、再現可能な迅速かつ信頼性の高い評価のための自動セグメンテーション。ブルッフ膜レーザー管理が確認された後の休憩。また、この段階で SD 10 月の使用はまたの結果の解釈を混同するかもしれない可能な網膜と網膜出血の即時の可視化を許可しました。網膜リーク FA 画像から蛍光信号に基づいて等級別になった。SD 10 月の使用は、CNV の病理学の詳細な説明を提供しました。さらに、フォロー アップ期間中のさまざまな時点での縦断的 SD 10 月分析には FA だけに頼る場合とらえどころのないまま検査開始の時間差が強調表示されます。
網膜厚は、自動抽出法を用いて測定しました。CNV が誘導されたサイトでの網膜の厚みを測定した手動で。Flatmount 脈絡膜の組織学的評価を確認すると、画像解析ソフト イメージ j. を用いて血管新生の領域
視軸の適切な透明性は提案するプロトコルのパフォーマンスの成功にとって重要です。角膜の乾燥と白内障の形成は、トラブルシューティングに関係する主な要因です。したがって、マウスが麻酔を取得します、一度人工涙液や角膜の適切な水和を維持するためにゲルと、目を常に水和する必要があります。提案プロトコルは、麻酔の導入から 10 分以内で優先的に行わなければなりません。拡張麻酔時間は白内障の形成を引き起こす可能性があります、生体内イメージングを防ぐ。
記述されていたプロトコルは CNV の進行レベル、網膜の血管のリークに基づいて観測グレーディングに限定されます。網膜のリークの定量評価は、リークの領域の描写ができ、関心領域の定量的なデータを提供しますハイデルベルク Spectralis ソフトウェアを使用して追加できます。また、スライマンや同僚 (2015) 最近画像に生体内で取得した 10 月楕円体法10を使用してからの CNV 容積の計算を提案する.ほとんどの場合 CNV があり不規則な形状、楕円体モデルは最も可能性の高い病変量の過大評価バイアスを紹介します。ただし、OCT 画像から提案された楕円体定量化や組織標本の共焦点解析からボリューム計測の高相関はメソッドが CNV ボリューム10 の定量的評価のための貴重なツールであることの証拠を提供します.
最後に、異なる体内画像診断、自動セグメンテーションと組織学的解析の提示の組み合わせを考えて前臨床試験において CNV 病理学の再現性と信頼性の高い評価を提供します。メソッドは、概念実証の治療的介入研究のために特に有用かもしれない。
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Disclosures
著者 Symantas Ragauskas、博士は従業員 (研究員) と提供契約のこの記事で使用されている臨床の CNV モデルを用いた研究サービス Experimentica 会社の株主です。
エヴァ Kielczewski の著者は、この記事で使用される SD OCT システムを生み出すライカマイクロシス テムズの社員 (研究アプリケーション エンジニア、10 月) です。
著者ジョセフ ・ ヴァンスは従業員 (NA 10 月セールス ・ ディレクター) のこの記事で使用される SD OCT システムを生み出すライカマイクロシス テムズ。ジョセフ ・ ヴァンスは、また社長と目的と、LLC のマネージング ディレクターです。
著者サイモン カジャ、博士はコンサルタント最高科学責任者および前臨床契約研究機関提供受託研究サービス、この記事で使用される臨床 CNV モデル税込 Experimentica 株式会社の株主です。サイモン カジャ、博士も CEO の K & P 科学的な LLC は、コンサルティング会社、生命科学、博士ジョン p. とテレーズ E. マルケイ恵まれて教授ロヨラ大学シカゴ、Stritch 医学部眼科として提供しています。この整理の言葉が検討されており、その利益相反ポリシーに従ってロヨラ大学シカゴ校によって承認されました。
著者 Giedrius Kalesnykas 博士は従業員 (CEO) と提供契約のこの記事で使用されている臨床の CNV モデルを用いた研究サービス Experimentica 会社の株主です。
Acknowledgments
著者感謝したい Yuliya Naumchuk (Loyola 大学シカゴ)、アグネ Žiniauskaitė (Experimentica 株式会社) 優れた技術と再生産のサポート。カジャ博士の研究プログラムをサポートするには、博士ジョン p. とテレーズ E. マルケイ恵まれて教授ロヨラ大学シカゴ校で眼科で。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidine (commercial name Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Anesthesia |
| Ketamine | Intervet | Vnr 51 14 85 | Anesthesia |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Anesthesia |
| Xylazine (commercial name Rompun vet) | Bayer | vnr 14 89 99 | Anesthesia |
| Tropicamide | Santen | Vnr 04 12 36 | Mydriatic agent |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Lubricant |
| Systane | Alcon | - | Lubricant |
| 5% Fluorescein sodium salt | Sigma Aldrich | F6377-100G | Fluoresent agent |
| Atipamezole (commercial name Antisedan) | Orion | Vnr 47 19 53 | Anesthesia |
References
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