Summary
Здесь мы представляем полезность продольных в vivo изображений в прослеживании морфологические изменения лазерно индуцированным хориоидеи неоваскуляризация мышей.
Abstract
Лазерно индуцированным хориоидеи неоваскуляризации (CNV) является устоявшейся модель для имитации влажных форме возрастной макулярной дегенерации (AMD). В этом протоколе мы стремимся руководствоваться читателя не просто через технические соображения генерации лазерно индуцированным поражения вызвать неоваскулярной процессы, но скорее сосредоточиться на мощный информацию, которая может быть получена из смешанных продольной в естественных условиях изображений на протяжении всего последующего периода.
Лазерно индуцированным мыши CNV модель была порождена администрации лазерный диод. Методы визуализации смешанных в естественных условиях были использованы для мониторинга CNV индукции, прогрессирование и регрессии. Во-первых, спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Окт) была выполнена сразу после лазерная проверка разрыв мембраны Бруха. Последующие в vivo изображений с помощью fluorescein ангиография (ФА) подтвердил успешные повреждение мембраны Бруха от последовательного изображения, полученные на уровне хориоидеи. Продольные последующей CNV распространения и регрессии на 5, 10 и 14 дни после лазерная выполнялось с помощью SD-OCT и Англии. Простой и надежный классификации Дырявый ЦНВ leasions из Англии изображения представлены. Автоматизированный сегментации для измерения толщины всего сетчатки, в сочетании с применением ручной калибр для измерения толщины сетчатки в ЦНВ сайтов, позволяют беспристрастной оценки наличия отеков. Наконец Гистологическая верификация CNV осуществляется с помощью isolectin GS-IB4 окрашивания на хориоидеи flatmounts. Окрашивание показатели, и isolectin позитивных площадь вычисляется с ImageJ.
Этот протокол является особенно полезным в терапии исследований, требующих высокой пропускной способности, как скрининг CNV патологии, как он позволяет быстро, смешанных и надежной классификации CNV патологии и сетчатки отек. Кроме того высоким разрешением SD-OCT позволяет запись других патологических признаков, как накопление субретинальное или Интраретинальные жидкости. Однако этот метод не предоставляет возможность автоматизировать анализ объема CNV от SD-Окт изображения, которая должна быть выполнена вручную.
Introduction
Первая успешная попытка имитировать патологии человека CNV грызунов было продемонстрировано почти три десятилетия назад с криптона лазерных в Лонг-Эванс крысы1. После этого криптона лазерных был использован сломать мембраны Бруха в самых популярных мыши напрягаться, C57BL/6J2,3,4. Показатель успеха CNV индукции было проверено с FA и гистологической пятна. Быстрое развитие методов неинвазивной визуализации, например OCT, способствовали росту поля грызунов доклинических моделей. Возможность контролировать морфологические изменения в сетчатке глаза в нескольких точках время тот же глаз значительно способствует сокращению использования животных и увеличивает эффективность в ходе экспериментальных исследований. Гистологическая Оценка CNV поражения довольно прост и требует маркировки ненормальныйа рост сосудов вокруг сайт лазерной администрации, загрузки изображений и площадь/объем оценки с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Напротив в естественных условиях визуализации формы внедрить более сложные анализы CNV патологии и его толкования.
Здесь мы представляем простой и относительно быстрый способ индукции класс, прогрессии и регрессии CNV с помощью Англии, SD-Октябрь, и метод автоматической сегментации в мыши лазерно индуцированным CNV модель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные рассматривались в соответствии с заявлением Арво для использования животных в глазной и видение исследования и Директива 86/609/EEC для экспериментов на животных, с использованием протоколов утвержденные и контролируется животного эксперимента Совет Финляндии.
1. лазерно индуцированным мышь CNV модель 5
- Проверяйте глаза животного макроскопически для каких-либо отклонений.
- Вес мыши.
- Рассчитать и подготовить соответствующее количество обезболивающих средств для использования, на основании веса животного, например смесь medetomidine (1 мг/кг), кетамин (75 мг/кг) и дистиллированной воды (0,9% раствор NaCl) в соотношении 1:1.5:2.5, или кетамин (40-75 мг/кг), Ксилазина (5 мг/кг) и дистиллированной воды (0,9% раствор NaCl) в соотношении 1: 2. 5:1; 20 g мыши вводить 0,1 мл смеси.
- Инъекционные анестетики внутрибрюшинно.
- Место мыши обратно в клетке и ждать, пока животное находится под наркозом. Убедитесь, что мышь должным образом под наркозом, отсутствие педали рефлекс.
- Обеспечить использование лазерной безопасности средств индивидуальной защиты.
- Включите щелевой лампы и 532 нм Лазер диода.
- Удалите мышь из клетки и место на грелку.
- Нанесите одну каплю Тропикамид для зрачков дилатация. Подождите 3-5 мин для зрачков дилатация полный (3 мм).
- Поместите курсор мыши на сцене щелевой лампы.
- Поместите одну каплю глазничного жидкого геля на coverslip к applanate роговицы.
- Расположите мышь глаз с главой зрительного нерва в центре.
- Установить мощность лазера до 100 МВт, продолжительность до 100 мс и пятно размером до 50 мкм.
- Фокус лазерного луча на пигментный эпителий сетчатки (ПЭС).
- Сделайте три лазерного выстрела в один глаз, избегая сетчатки сосудов идеально на 4, 8 и 12 часов позиции вокруг зрительного нерва, соответственно. Осмотрите глазного дна, после того, как все Лазерные выстрелы для отсутствия сетчатки кровотечения. Контралатеральной глаз служит элемент лессировку.
- Отменить coverslip и место мыши на грелку.
- Нанесите одну каплю PEG гель капель на обоих глазах.
2. SD-Окт 6,7
- Поместите указатель мыши в стадии грызунов выравнивание и иммобилизации головы.
- Совместите объектив SD-Окт системы (например, Bioptigen/Leica Envisu R2200) грозит глаз в vivo образов с помощью X - и Y-этап контроллеры.
- Выполнять проверку SD-OCT для проверки перерывы мембраны Бруха: как только SD-Окт сканирует весь глаз, вручную переместить исходной линии на гравированных сайтах. Перерывы мембраны Бруха должна быть отчетливо видна в гравированных областях (см. Рисунок 1).
3. fluorescein ангиография 7,8,9
- Удаление мышь с держателем и поместите его на системе FA (например, Heidelberg Spectralis HRA2).
- Фокус на лазер сжечь области глазного дна с помощью режима ИК отражения с главой зрительного нерва в середине окна просмотра.
- Придать 0,1 мл 5% флуоресцеин натриевой соли для мыши 20 g, подкожно или внутрибрюшинно.
- Сосредоточиться на уровне хориоидеи.
- Возьмите изображения от уровня хориоидеи фокус.
- Переориентировать на уровне сетчатки и принять изображение.
- Подождите 30 s и повторите шаги 3.4-3.6.
- Выньте из держателя мыши и поместите его на грелку.
- Обратный анестезии, α2-антагонистов для medetomidine, Атипамезола (0,5 мг/кг, и.п.) или ждать восстановления животных от анестезии.
- Повторите в vivo SD-OCT и FA изображений на наркотизированных животных в последующие дни 5, 10 и 14.
4. CNV классификации
- Класс повреждение мембраны Бруха от октября изображения и хориоидеи FA снимки сразу после лазерная день 0 следующим:
0 - не повреждена мембрана Бруха
1 - успешный повреждение мембраны Бруха - Класс присутствие CNV от гравированных пятна, которые были утечки, как отмечалось, сравнивая динамику флуоресцеин сигнала в серии сетчатки FA изображений следующим:
0 - нормальный вид сетчатки
0.5 - слабый пятнать утечки
1.0 - Дырявый CNV областей
Примечание: Используйте OCT изображений для дополнительного подтверждения CNV или сомнительных FA где присутствие Интраретинальные жидкости в OCT изображения будет предложить CNV классификации.
5. сетчатки толщин
- Использование программного обеспечения автоматизированной сегментации для измерения толщины сетчатки. Убедитесь, что общая толщина сетчатки считается, толщина всех слоев из слоя нервных волокон НПП (здоровый измерения сайты), или воображаемой линии, соединяющей НПП вокруг места повреждения (лазером участков) (см. также рис. 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пузыря или кровотечение сразу после лазерная subretinal не всегда видны. Таким образом SD-Окт особенно важно проверить повреждение мембраны Бруха. На рисунке 1 показан пример OCT изображений в разное время точках после лазерной администрации.
Рисунок 1 : OCT en лицо глаза глазного дна (VIP изображение) показывает три гравированных областей, изложенных в белые, зеленые и красные круги. OCT Б-скан изображения были взяты предыдущие лазерная (базовый), сразу же после лазерная проверка разрыв мембраны Бруха (0 дней, стрелки указывают на сайт повреждения) и 5, 10 и 14 дней после применения лазера. Как видно из области, изложенные в белом (первая строка изображений), CNV не превратились в более поздних timepoints. CNV, который был обнаружен на последующий день 5 развита область, изложенные в зеленый и красный. Однако на 10 и 14 день timepoints, эти поражения ЦНВ регрессировало. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунки 2 и 3 показывают серийный изображений с помощью Англии, который подтвердил успешные повреждение мембраны Бруха во всех трех местах на день 0 мужской мышей C57BL/6jRj 10-недельных.
Рисунок 2 : Последовательный FA изображений сделана каждые 20 s (изображения от 1 до 18) на уровне хориоидеи сразу же после лазерной администрации. Белые стрелки в изображении 1 очко гравированных сайты, которые показывают флуоресцеин утечки в более поздних timepoints (белые стрелки в изображении 18). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Последовательный FA изображений сделана каждые 20 s (изображения от 1 до 18) на уровне сетчатки сразу же после лазерной администрации. CNV области, которая имеет флуоресцеин утечки и классификации 1 (Дырявый CNV) отмечал белая стрелка в изображении 18. Примечание увеличение интенсивности, а также положительной области флуоресцеин, во время timecourse FA изображений (белая стрелка в изображениях 8 и 11). Две области, изложенные в белом изображении 18 были классифицированы как имеющие слабый сигнал FA (грейдинга 0.5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
В дополнение к классификации CNV патологии, SD-Сен также полезно раскрыть дополнительную информацию в сайт поражения, например, наличие субретинальное жидкости, отек и ЦНВ регрессии. На рисунке 4 показана основная патологических признаков лазерно индуцированным CNV мышей.
Рисунок 4 : Спектральный домена оптической согласованности томография изображений из CNV патологии. SD-OCT предоставляет подробную CNV патологии в ткани сетчатки, как видно из этих представителя изображений на рубцов ткани, CNV образование и накопление жидкости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Макулярного отека является одним из основных патологических признаков влажной формы AMD в организме человека. В модели CNV лазерно индуцированным сетчатки толщина можно оценить с помощью автоматизированных сегментации. Для измерения толщины сетчатки на сайте CNV требуется ручное измерение отдельных лазером участков. На рисунке 5 показан пример отчета генерируется после автоматической сегментации.
Рисунок 5 : Количественная оценка толщины сетчатки. Сетчатки толщина измеряемый автоматизированных сегментации пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Использование автоматизированных сегментации это быстрый способ, чтобы дать общий обзор толщина сетчатки (Таблица 1). Цифры 6A и 6B показывают типичные примеры автоматизированных сегментации от здоровой сетчатки области и из области сетчатки с CNV патологии, соответственно. Несмотря на незначительные неточности в отличительный отдельных слоев сетчатки, общее программное обеспечение надежно распознает Общая толщина сетчатки пигментированные мышей.
Рисунок 6 : Автоматизированная сегментации слоев сетчатки. Автоматизированный сегментации здоровой сетчатки (A) и сетчатки области, содержащие CNV (звездочка в изображении B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Для того чтобы оценить толщину сетчатки на гравированных областей, каждая гравированных область была измерена вручную следующим: Общая толщина сетчатки было рассмотрено как толщина всех слоев к воображаемой линии, соединяющей НПП вокруг места от слой нервных волокон ущерб (рис. 7 и таблицу 1).
| Площадь | День 5 | День 10 | День 14 |
| Общая толщина сетчатки, мкм | 218±7.8 | 220±7.2 | 221±9.8 |
| Гравированных область 1 | 200 | 204 | 214 |
| Гравированных область 2 | 226 | 217 | 220 |
| Гравированных область 3 | 222 | 223 | 227 |
| Данные представлены в виде за | |||
Таблица 1. Общая толщина сетчатки и толщина сетчатки в ЦНВ сайты во время 14-дневный последующего как определяется автоматизированной сегментации, с использованием программного обеспечения inVivoDiver (v. 3.0.8).
Рисунок 7 : Ручное измерение толщины сетчатки на гравированных уголок с патологией CNV. Желтая линия показывает Общая толщина сетчатки от слой нервных волокон мнимой НПП слой (черная линия) на сайте администрации лазера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Гистологически CNV поражения были подтверждены с помощью isolectin GS-IB4 маркировки (рис. 8A). Программное обеспечение для анализа изображений изображения J был использован для расчета площади поражения CNV (Рисунок 8B).
Рисунок 8 : Гистологический анализ. Гистологические пятно CNV поражения от хориоидеи flatmount (в зеленом, A) может быть определена количественно с помощью порог в изображение J (B). Линейки для A -50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Смешанных изображений предлагает ценные инструменты для оценки CNV патологии. Здесь мы представили изображений протокол, состоящий из Англии, SD-OCT и автоматической сегментации для быстрого, воспроизводимые и надежной оценки CNV патологии. Разрыв мембраны Бруха после лазерной администрации было подтверждено. Кроме того использование SD-Октябрь на данном этапе также позволило немедленно визуализация возможных Интраретинальные и субретинальное кровоизлияния, которые могут сбить с толку интерпретацию результатов. Сетчатки утечки были классифицированы на основании флуоресцеин сигнал от Англии изображений. Использование SD-октября представил более подробное описание CNV патологии. Кроме того продольный анализ SD-Окт в различные моменты времени в течение последующего периода выделены временные различия в патологии, которая будет оставаться недостижимой, если полагаться на FA самостоятельно.
Общая толщина сетчатки была измерена с помощью автоматизированных сегментации. Сетчатки толщина на участках, которые вызывали CNV вручную была измерена. Гистологическая Оценка хориоидеи flatmount проверяется, и области неоваскуляризация измеряется с помощью программного обеспечения для анализа изображений изображения Дж.
Надлежащей прозрачности зрительной оси имеет решающее значение для успешного выполнения представленных протокола. Сухости роговицы и формирования катаракты являются основными факторами, участвующих в устранении неполадок. Таким образом после того, как мышь получает под наркозом, глаза должны постоянно увлажненной с искусственной слезы или гель для поддержания надлежащей гидратации роговицы. Предлагаемый протокол должен выполняться преференциально в течение 10 мин от индукции анестезии. Расширенные анестезии время может привести к образованию катаракты и предотвратить в vivo изображений.
Описывается протокол ограничивается наблюдений классификации CNV прогрессии, основанные на сосудистые утечки на уровне сетчатки. Количественная оценка сетчатки утечки могут быть добавлены с помощью Heidelberg Spectralis программное обеспечение, которое позволяет делимитации области утечки и количественные данные о регионе интереса. Кроме того Сулейман и коллеги (2015) недавно предложил расчет объема ФХП в естественных условиях приобрел OCT изображений с помощью эллипсоидов метод10. Эллипсоид модель скорее вводит уклон в сторону завышения объема поражения как ЦНВ в большинстве случаев имеет неправильную форму. Однако высокая корреляция между объем измерений от конфокальной анализ гистологических образцов и предлагаемых эллипсоид Квантификация от октября изображений предоставляет доказательства того, что метод является ценным инструментом для количественной оценки объема ЦНВ10 .
В заключение, мы считаем, что представленный сочетание различных в vivo imaging условия, вместе с автоматической сегментации и гистологический анализ, обеспечивает воспроизводимость и надежной оценки CNV патологии в доклинических исследованиях. Этот метод может быть особенно полезно для доказательство концепции исследования терапевтического вмешательства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор Symantas Рагаускас, к.т.н. является работник (научный сотрудник) и акционер компании Experimentica Ltd., который предлагает контракта служб исследований доклинических CNV модель, используемая в этой статье.
Автор Eva Kielczewski является сотрудником (инженер приложений, Окт) Leica Microsystems, который производит SD-Окт систем, используемых в этой статье.
Автор Джозеф Vance является сотрудником (NA октября директор по продажам) компании Leica Microsystems, который производит SD-Окт систем, используемых в этой статье. Джозеф Вэнс также является президентом и управляющим директором щего, ООО.
Автор Симон Kaja, к.т.н.-консультант главный научный сотрудник и акционер компании Experimentica Ltd., доклинические контрактно-исследовательская организация, предлагает контракт исследовательских услуг, включая доклинические CNV модель используется в этой статье. Симон Kaja, кандидат также Генеральный директор K & научных P, ООО, наук о жизни консалтинговой фирмы и выступает в качестве д-р Джон P. и Тереза E. Малкахи наделены профессором офтальмологии в университете Лойолы, Стритч школа медицины. Условия этого соглашения были рассмотрены и одобрены Университет Лойолы в соответствии с его политикой конфликта интересов.
Автор Гедрюс Kalesnykas, Ph.D. — сотрудника (ГАС) и акционер компании Experimentica Ltd., который предлагает контракта служб исследований доклинических CNV модель, используемая в этой статье.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Юлия Наумчук (Университет Лойолы) и Агне Žiniauskaitė (Experimentica ООО) за отличную техническую и видеографическая поддержку. Программа исследований доктор Kaja поддерживается Dr. John P. и Тереза E. Малкахи наделены профессуру в офтальмологии в университете Лойолы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidine (commercial name Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Anesthesia |
| Ketamine | Intervet | Vnr 51 14 85 | Anesthesia |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Anesthesia |
| Xylazine (commercial name Rompun vet) | Bayer | vnr 14 89 99 | Anesthesia |
| Tropicamide | Santen | Vnr 04 12 36 | Mydriatic agent |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Lubricant |
| Systane | Alcon | - | Lubricant |
| 5% Fluorescein sodium salt | Sigma Aldrich | F6377-100G | Fluoresent agent |
| Atipamezole (commercial name Antisedan) | Orion | Vnr 47 19 53 | Anesthesia |
References
- Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
- Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
- Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502 (2015).
- Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643 (2015).
- Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
- Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).
